崔凱， 岳碧松

(四川大學生命科學學院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，成都610065)

微衛(wèi)星每個單元長1～6 bp，廣泛分布于真核生物的基因組中，包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)(Beckman & Weber，1992)。研究表明，可能是DNA復制過程中的“滑鏈(strand slippage)”現象造成微衛(wèi)星DNA多態(tài)性信息容量較高(Levinson & Gutman，1987)。由于多態(tài)性信息豐富、易于檢測、數量多、在基因組內分布均勻等優(yōu)點，微衛(wèi)星被作為優(yōu)良的遺傳標記得到了廣泛的應用(Guptaetal.，1996；Pérezetal.，2001；Maetal.，2004)。

綠尾虹雉Lophophoruslhuysii隸屬于雞形目Galliformes雉科Phasianidae，中國特有種，國家Ⅰ級重點保護野生動物，世界自然保護聯盟(IUCN)瀕危物種紅色名錄將其列為易危(VU)物種(BirdLife International，2016)。綠尾虹雉主要分布于四川、云南西北部、西藏東南部、甘肅東南部和青海南部(鄭光美，2015)，常棲息于海拔3 000～4 500 m的高山草甸、灌叢和裸巖地帶，缺少食物的冬季會垂直遷徙到海拔2 000 m左右的地區(qū)活動(何芬奇，盧汰春，1985；盧汰春等，1986)。由于人類活動和自然災害等因素，綠尾虹雉的種群數量持續(xù)下降(劉夢瑤等，2013)。本研究從基因組水平對綠尾虹雉的微衛(wèi)星特性及相關功能進行分析，可對該物種的群體遺傳多樣性和親緣關系的研究提供數據支持，為該物種的保護提供有用信息。

1 研究方法

1.1 綠尾虹雉全基因組序列

綠尾虹雉的全基因組序列由本實驗室測序組裝，基因組全長1.01 Gb，Scaffold N50為6.9 Mb。相關研究項目信息及測序數據已上傳至NCBI(Bioproject ID：PRJNA321629)?；蚪M的相關基因結構注釋也由本實驗室分析所得。

1.2 數據分析

1.2.1微衛(wèi)星搜索統(tǒng)計和定位微衛(wèi)星的搜索和統(tǒng)計利用本實驗室自主開發(fā)的Krait(Duetal.，2017)完成，該軟件可從Github(https：//github.com/lmdu/krait/releases)下載。對綠尾虹雉全基因組Scaffolds的FASTA序列上的微衛(wèi)星序列進行搜索和統(tǒng)計，得到相關的類型和位置信息。本研究微衛(wèi)星的搜索標準為：單堿基重復12次以上，二堿基重復7次以上，三堿基重復5次以上，四到六堿基重復次數均為4次以上。進一步利用自編腳本與基因組注釋GFF文件和得到的微衛(wèi)星注釋文件進行比較查找，定位外顯子中所含的全部微衛(wèi)星序列，并進行統(tǒng)計分析，得到所含微衛(wèi)星外顯子的基因FASTA序列。

1.2.2微衛(wèi)星所在外顯子的基因序列注釋分析注釋分析主要利用Gene Ontology(GO)和KEGG通路注釋。GO注釋要先將編碼基因的蛋白質序列與NR庫進行BLAST比對(參數：E-value<1E-5)，隨后的結果導入Blast2GO(Conesaetal.，2005)進行GO條目注釋。注釋到的條目利用網頁版的WEGO(Jiaetal.，2006)進行分類統(tǒng)計并作圖。注釋得到所有GO分為三大類：細胞組分、分子功能和生物學過程。GO富集和KEGG通路富集分析利用KOBAS 2.0(Xieetal.，2011)網頁提交注釋的編碼蛋白質序列執(zhí)行，統(tǒng)計檢驗利用卡方檢驗，顯著水平設置為α=0.05，最終獲得GO富集條目和KEGG富集相關通路。

2 結果

2.1 微衛(wèi)星類型和豐度

對微衛(wèi)星的重復類型和數量進行統(tǒng)計(表1)。綠尾虹雉的全基因組中，6種完美型微衛(wèi)星總數為292 430個，總長度達5 465 549 bp，占基因組的0.54%，相對豐度為290.47個/Mb。其中，數量和長度最多的是單堿基類型，達209 830個(71.75%)，相對豐度為208.43個/Mb。其余微衛(wèi)星占比都小于10%，依次是四堿基(9.99%)、二堿基(7.07%)、三堿基(6.38%)、五堿基(3.93%)，最少的是六堿基(0.88%，相對豐度為2.56個/Mb)。

表1 綠尾虹雉基因組中完美型微衛(wèi)星分布概況Table 1 The perfect microsatellite types in Lophophorus lhuysii

2.2 不同類型微衛(wèi)星重復次數

綠尾虹雉不同類型微衛(wèi)星的重復次數分布差異較大，單堿基重復次數最多，主要為12～32次(71.75%)，12次最多，有39 900個；其余5種類型的重復次數和長度都較低，均低于10%，主要為4～11次(圖1)。微衛(wèi)星偏倚十分明顯，主要集中在單堿基，其中，A最豐富，有195 729個，占66.93%，C相對較少，有14 101個，占4.82%；二堿基中，AT最多，有9 849個，占3.37%，其次是AC(2.56%)和AG(1.13%)，CG最少，僅有37個，占0.01%；三堿基中最多的是AAT，有5 535個，占1.89%；四堿基中AAAC和AAAT最多，分別占3.81%和2.80%；五堿基中AAAAC最多，占1.07%(表2，圖2)。

2.3 微衛(wèi)星定位在外顯子中的編碼基因功能注釋

對微衛(wèi)星進行全基因組定位，其中，分布于外顯子的有2 816個，分布于1 314個編碼基因中，數量最少，只占0.96%；分布于內含子和基因間區(qū)的數量龐大，分別有101 791個(34.81%)和187 823個(64.23%)。外顯子是編碼蛋白的翻譯區(qū)，對基因行使的功能具有重要作用，所以對在外顯子中定位到微衛(wèi)星的編碼基因進行了GO和KEGG注釋分析。

2.3.1GO注釋和富集分析GO注釋主要分為三大類：細胞組分、分子功能和生物學過程(圖3)。所得GO條目為599個，分布于695個基因中。WEGO分析發(fā)現，268個歸于細胞部分，135個與分子功能有關，196個參與到生物學過程中。細胞組分中主要與細胞和細胞部分(GO：0005623，GO：0044464)有關，分子功能中主要與連接(GO：0005488)有關，生物學過程中主要與細胞過程和代謝過程(GO：0009987，GO：0008152)有關。GO條目富集前10的主要與代謝、合成過程和轉錄有關，其中，RNA代謝過程富集最顯著(P=7.92E-16)，有122個(表3)。

2.3.2KEGG注釋和富集分析對綠尾虹雉外顯子中含有微衛(wèi)星的基因進行KEGG注釋，得到903個KO number，將這些條目進行富集分析，富集到了14個通路中。這些通路中，黏著連接富集最顯著，有14個基因，P值為2.03E-04；黏著斑的基因總數最多，有21個，P值為5.11E-03。將這些通路進行功能分類，主要分為機體系統(tǒng)、細胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、人類疾病和代謝。其中，環(huán)境信息處理相關的通路最多，7個通路含有80個基因；其次是細胞過程，2個通路含有35個基因；機體系統(tǒng)的最少，只有1個通路6個基因(表4)。

3 討論

利用全基因組數據對綠尾虹雉微衛(wèi)星序列進行鑒定和分類注釋，可為其分子標記和種群遺傳多樣性研究等提供有用信息。本文對綠尾虹雉全基因組微衛(wèi)星進行了搜索分析，1.01 Gb基因組中完美型微衛(wèi)星292 430個，長度主要在10～43 bp，總長度5 465 549 bp，占全基因組的0.54%，相對豐度290.47個/Mb。雉科鳥類中，紅原雞Gallusgallus共有28 272個微衛(wèi)星(0.49%)(黃杰等，2012)，火雞Meleagrisgallopavo有177 733個(0.28%)(李午佼等，2012)。與人類3%微衛(wèi)星含量(Subramanianetal.，2003)相比，綠尾虹雉等雉科鳥類的微衛(wèi)星數量較少，這或許與哺乳動物基因組較大且重復序列較多有關。人類基因組大小為2.91 Gb，重復序列占基因組的66%～69%(Koningetal.，2011)，而鳥類基因組較小且重復序列少，如綠尾虹雉基因組中重復序列只占9.9%。這些證據說明，人類基因組會有相對較多的微衛(wèi)星。在所有微衛(wèi)星類型中，綠尾虹雉的單堿基型微衛(wèi)星最多，達71.75%，其中An含量最高(66.93%)。該結果與紅原雞相似，都以An和Tn為主，單堿基占65.1%(黃杰等，2012)。重復單位增加，微衛(wèi)星位點的總數會相應減少(Bennett，2000)。在許多動植物中，都表現出微衛(wèi)星A和T堿基偏倚，如紅原雞(黃杰等，2012)、核桃Juglansregia(廖卓毅，2015)、林麝Moschusberezovskii(盧婷等，2017)、虎皮鸚鵡Melopsittacusundulatus(黃杰等，2017)和天麻Gastrodiaelata(周天華等，2017)等。真核生物中普遍存在的ployA(Gallie，1991)或許是大部分物種全基因組微衛(wèi)星預測結果表現強烈偏倚的原因，此外，真核生物非編碼區(qū)的CpG島易被甲基化(Bird，1986)，或也與這種偏倚有關。此外，綠尾虹雉和其他幾種雉科鳥類比其他物種有較明顯的A堿基偏倚，重復次數最多的重復單元類型分別是A、AT、AAT、AAAC，這種雉科鳥類普遍特點也有待深入研究。

圖1 綠尾虹雉中各重復單元微衛(wèi)星重復次數分布Fig. 1 Repeat distribution of each microsatellite type in Lophophorus lhuysii

圖2 綠尾虹雉全基因組中相對豐度最高的微衛(wèi)星基序分布Fig. 2 Relative abundance of the most relative abundant microsatellite motifs in the genome of Lophophorus lhuysii

圖3 綠尾虹雉微衛(wèi)星分布于外顯子的基因GO功能注釋Fig. 3 The GO function annotation of exon microsatellites in Lophophorus lhuysii

表4 綠尾虹雉微衛(wèi)星分布于外顯子的基因KEGG富集Table 4 The KEGG enrichment of exon microsatellites in Lophophorus lhuysii

外顯子區(qū)是重要的表達區(qū)域，本文對綠尾虹雉微衛(wèi)星進行了外顯子定位分析，發(fā)現外顯子中有2 816個(0.96%)微衛(wèi)星，分布于1 314個編碼基因中。GO注釋到695個基因中，其中涉及較多關于細胞和細胞部分，富集前10的條目主要與代謝、合成過程和轉錄有關。KEGG富集到14個通路中，其中最顯著富集到黏著連接通路，而大分類下環(huán)境信息處理條目最多。微衛(wèi)星屬于不穩(wěn)定DNA序列，易發(fā)生擴增，而位于外顯子中的微衛(wèi)星發(fā)生移碼突變可能會造成基因突變，而這些基因又與綠尾虹雉處理環(huán)境信息、代謝和細胞的基本組分息息相關，若發(fā)生突變可能會使這些信號通路的信息傳遞和一些物質的代謝過程受到影響。

微衛(wèi)星在真核生物中分布多、分類廣，有著多方面的用途：可用于個體識別和親緣鑒定；是一種常用的遺傳標記，可用于研究遺傳多態(tài)性揭示物種的起源、遷徙和進化等；也可用于遺傳病腫瘤診斷等醫(yī)學有關用途(張云武等，2001)。本文利用軟件預測首次對綠尾虹雉的全基因組微衛(wèi)星進行了搜索鑒定，并對其分布規(guī)律進行了探究，為后續(xù)的微衛(wèi)星篩選提供數據基礎。