劉開平，韋玉梅，熊 杰，孫燕飛，雷勇輝

（1.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 石河子 832003）

蝗蟲屬直翅目，全世界種類超過10 000種，我國(guó)有1 000余種?；认x主要包括飛蝗和土蝗，飛蝗在我國(guó)有東亞飛蝗〔Locusta migratoria manilensis（Meyen）〕、 亞 洲 飛 蝗〔Locusta migratoria migratoria（Linnaeus）〕和西藏飛蝗〔Locusta migratoria tibitensis（Chen）〕3 種，其中東亞飛蝗分布范圍最廣，具有繁殖能力強(qiáng)、食量大、遷飛、抵抗不良環(huán)境能力強(qiáng)等特點(diǎn)，一旦爆發(fā)成災(zāi)，常常導(dǎo)致顆粒無收，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和社會(huì)穩(wěn)定造成嚴(yán)重危害［1］。刺腿食蚜蠅是常見的昆蟲天敵，以幼蟲捕食蚜蟲而著稱［2］，在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中是一種益蟲。

近年來，昆蟲體內(nèi)共生菌的研究越來越引起國(guó)內(nèi)外研究者的重視。在長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化過程中，昆蟲與其體內(nèi)的共生菌建立了密切的互利共生關(guān)系，內(nèi)共生菌是宿主昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育及適應(yīng)性的重要調(diào)控因子［3］。有研究表明，刺吸危害的同翅目昆蟲，如蚜蟲、飛虱、葉蟬等，體內(nèi)普遍存在內(nèi)共生菌。大多數(shù)同翅目昆蟲的共生菌，除了在短期的卵巢感染階段外，很少情況下在菌胞（Mycetocyte）外發(fā)現(xiàn)；蚜蟲共生菌的種類主要有初級(jí)共生菌布赫納氏菌（Buchnera aphidicola）和若干次級(jí)共生菌，如沙雷氏菌 （Serratia symbiotica）、立克次氏體（Rickettsiaspp.）、沃爾巴氏菌（Wolbachiaspp.）、U型共生腸桿菌（egiella insecticola）、T 型共生腸桿菌 （Hamil-tonella defensa）等［4］，但目前關(guān)于昆蟲共生酵母菌的研究鮮為報(bào)道。在“昆蟲·共生菌”這一共生關(guān)系研究中，共生菌的離體培養(yǎng)至關(guān)重要［5］，而傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法對(duì)昆蟲內(nèi)生菌不同分類水平菌群結(jié)構(gòu)的多樣性難以進(jìn)行全面深入研究，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，高通量測(cè)序技術(shù)已開始逐步應(yīng)用于微生物多樣性研究。26S rDNA的D1/D2區(qū)域的序列保守程度適中，長(zhǎng)度適中（約600 bp），可以作為酵母菌種級(jí)水平鑒定指標(biāo)，在微生物高通量測(cè)序研究中應(yīng)用廣泛。對(duì)大量子囊菌酵母26S rDNA的D1/D2區(qū)域的序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，同種但不同菌株之間該區(qū)核苷酸替換率低于1%，通過對(duì)該序列的研究可以將假絲酵母屬（Candida）絕大部分種區(qū)分開［6］。對(duì)卵塊培養(yǎng)法分離得到的褐飛虱體內(nèi)的兩株菌的26S rDNA D1/D2區(qū)序列測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)分別與解脂假絲酵母（Yarrowia lipolytica）和嗜鹽梗孢酵母（Sterigmatomyces halophilus） 具 有 100% 和99.8%序列相似性［7］。至今，國(guó)內(nèi)外尚無有關(guān)東亞飛蝗和食蚜蠅體內(nèi)的酵母共生菌的離體培養(yǎng)報(bào)道，這嚴(yán)重阻礙了該類共生菌的生理生化特性實(shí)驗(yàn)的開展。而作為單細(xì)胞個(gè)體，其常規(guī)的形態(tài)分類又受到很大的限制，從而使得該類共生菌的分類研究至今止步不前。

本研究首次采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序方法對(duì)2種昆蟲酵母菌26SrDNA進(jìn)行分析，探討農(nóng)業(yè)害蟲東亞飛蝗及益蟲刺腿食蚜蠅這兩種不同類型昆蟲內(nèi)生酵母菌的多樣性差異，并為農(nóng)業(yè)害蟲防治和特殊環(huán)境下的特殊微生物資源利用提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在石河子市分別采集東亞飛蝗和刺腿食蚜蠅2種昆蟲各30只，采樣信息見表1。

表1 不同采樣點(diǎn)地理因子

1.2 東亞飛蝗和刺腿食蚜蠅內(nèi)生菌基因組DNA提取及測(cè)序

將所得樣本昆蟲用酒精進(jìn)行表面消毒后用無菌水清洗，再用研缽在無菌間研磨成勻漿，然后將所得原液與無菌水按1∶1比列混合，并用0.45 μm的濾膜進(jìn)行抽濾，然后利用試劑盒提取基因組DNA （Powersoil?DNA isolation kit）。根據(jù)Kurtzman等［8］的方法，用通用引物NL-1和NL-2 PCR擴(kuò)增酵母26S rDNA的D1/D2區(qū)域。PCR擴(kuò)增體系（50 μL）：dd H2O 38 μL，10×Taq E Buffer 5 μL，dNTPs（2.5mmol/L）4 μL，引物NL-1 和NL-4各1 μL，混勻，再分別加入模板DNA 0.5μL，Taq聚合酶（5 U/ L）0.5 μL，混勻后稍微離心。然后按照程序94℃，1 min；53℃，1 min；72℃，1 min 20 s進(jìn)行36個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)鑒定，用Axygen DNA凝膠回收試劑盒（Axygen，美國(guó)）進(jìn)行割膠回收。送樣至上海派森諾生物科技有限公司對(duì)樣品26S rDNA D1/D2區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序，利用Illumina（MiSeq）平臺(tái)，對(duì)獲得的序列進(jìn)行OTU歸并劃分，每個(gè)OTU的代表序列用于分類地位鑒定，在屬水平對(duì)菌群進(jìn)行聚類分析，根據(jù)聚類結(jié)果分析東亞飛蝗和刺腿食蚜體內(nèi)酵母群落豐富度的差異。

1.3 多樣性分析

基于OTU聚類結(jié)果，利用Mothur軟件計(jì)算東亞飛蝗和刺腿食蚜蠅體內(nèi)酵母菌Alpha多樣性，包括Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)［9］，作為測(cè)序數(shù)據(jù)量不同樣本中物種豐富度比較的依據(jù)，也可作為樣本測(cè)序量合理與否“是否足以覆蓋所有類群”的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，得出樣本測(cè)序深度。并通過SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)2個(gè)樣本的多樣性指數(shù)差異的顯著性分析［10］，反映東亞飛蝗和刺腿食蚜蠅體內(nèi)絕大多數(shù)酵母菌的信息。

1.4 物種組成分析

獲得的OTU與RDP數(shù)據(jù)庫(kù)（Release 11.1，http:// rdpcme.msu.edu/）比對(duì)，通過 RDP Classifier鑒定OTU代表性序列的微生物分類地位。各組樣品在不同水平的分類比較柱形圖是根據(jù)QIIME（v1.8.0）軟件計(jì)算的結(jié)果用Origin軟件繪制［11］。

2 結(jié)果與分析

2.1 東亞飛蝗與刺腿食蚜蠅酵母菌OUT水平分析

在當(dāng)前的測(cè)序量下，2個(gè)樣本的Chao1曲線與Shannon曲線（圖1）都接近平臺(tái)期，說明增加測(cè)序數(shù)據(jù)無法再找到更多的OTU，這表明選取的樣本測(cè)序量能夠充分反映待測(cè)樣本酵母菌菌群結(jié)構(gòu)的合理性及多樣性。

圖1 Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)稀釋曲線

兩個(gè)樣本共檢測(cè)到126 728條reads，其中子囊菌亞門（Ascomycota）32 695條，擔(dān)子菌亞門（Basidiomycota）20 150條，測(cè)序長(zhǎng)度集中在270～300 bp之間。2個(gè)樣品共產(chǎn)生906個(gè)OTU，去除豐度值低于全體樣本測(cè)序總量0.001%的OTU，并去除稀有OTU，用于后續(xù)的一系列分析。OTU劃分并對(duì)分類地位鑒定的統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表2）顯示，在各分類水平上東亞飛蝗體內(nèi)酵母菌OTU數(shù)目均高出刺腿食蚜蠅。由vene圖（圖2）可知東亞飛蝗體內(nèi)特有229個(gè)OTU，刺腿食蚜蠅體內(nèi)特有259個(gè)OTU，二者共有418個(gè)OTU。

表2 OTU劃分和分類地位鑒定結(jié)果

圖2 東亞飛蝗和刺腿食蚜蠅共有OTU vene圖

2.2 東亞飛蝗與刺腿食蚜蠅酵母菌Alpha多樣性分析

對(duì)2個(gè)樣本的Simpson指數(shù)、Shannon 指數(shù)、Chao1 指數(shù)、Ace指數(shù)進(jìn)行Alpha多樣性及差異顯著性分析表明，東亞飛蝗的Chao1、Ace指數(shù)比刺腿食蚜蠅大，而Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)比刺腿食蚜蠅?。ū?），說明東亞飛蝗樣本存在著稀有OTU的概率更大，而刺腿食蚜蠅樣本中群落的均勻度和豐富度更好，且優(yōu)勢(shì)物種明顯。通過T假設(shè)檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)樣本各多樣性指數(shù)的統(tǒng)計(jì)參數(shù)值（t）均小于假設(shè)檢驗(yàn)顯著水平為0.01時(shí)的參考值（t0.01），表明東亞飛蝗和刺腿食蚜蠅體內(nèi)酵母菌多樣性差異并不顯著（表4）。

表3 樣品的Alpha多樣性指數(shù)

表4 多樣性指數(shù)差異顯著性分析

2.3 東亞飛蝗與刺腿食蚜蠅酵母菌的菌群結(jié)構(gòu)分析

據(jù)OTU劃分和分類地位鑒定結(jié)果，可以獲得兩個(gè)樣本在各分類水平的具體組成（表2、表4，圖3、圖4）。相當(dāng)于以不同的分辨率查看群落組成結(jié)構(gòu)，比較兩個(gè)樣本在各分類水平所含有的酵母菌類群數(shù)量（表5）；東亞飛蝗體內(nèi)酵母菌群共分屬于2門6綱11目12科17屬73種，刺腿食蚜蠅體內(nèi)酵母菌群共分屬于2門8綱13目16科17屬88種。

各分類水平上的數(shù)目雖然大體相同，但種類和比例卻相差甚大。通過比較分析發(fā)現(xiàn)，在門水平上（圖3），兩個(gè)樣本的內(nèi)生酵母菌主要分布在子囊菌亞門和擔(dān)子菌亞門，東亞飛蝗樣本中子囊菌亞門占比例為76.5%，而刺腿食蚜蠅中僅占22.2%，前者較后者高54.3個(gè)百分點(diǎn)；東亞飛蝗樣本中擔(dān)子菌亞門占比例為23.5%，而刺腿食蚜蠅中占77.8%，前者較后者低54.3個(gè)百分點(diǎn)。在屬水平上，兩個(gè)樣本共發(fā)現(xiàn)19個(gè)屬，分別為黑粉菌屬（Filobasidium）、畢赤酵母屬（Pichia）、假絲酵母屬（Candida）、金擔(dān)子菌屬（Aureobasidium）、隱球酵母屬（Cryptococcus）、擬威爾嗜殺酵母屬（Cyberlindnera）、梅奇酵母屬（Metschnikowia）、接合酵母屬（Zygosaccharomyces）、Cystofilobasidium、Prototheca、Papiliotrema、擲孢酵母屬（Sporobolomyces）、雙足綱酵母屬（Dipodascus）、Tetrapisispora、Kwoniella、裂殖酵母屬（Schizosaccharomyces）、阿卡酵母屬（Acaromyces）、威克漢姆酵母屬（Wickerhamlella）、Udeniomyces。其中，兩個(gè)樣本共有的屬為前15個(gè)屬，東亞飛蝗特有的屬為擬威爾嗜殺酵母屬和擲孢酵母屬、分別占1.16%和2.91%；刺腿食蚜蠅特有的屬為雙足綱酵母屬（Dipodascus）和阿卡酵母屬、均占1.49%；東亞飛蝗體內(nèi)優(yōu)勢(shì)屬均為線黑粉菌屬和畢赤酵母屬、分別占44.77%和34.30%，刺腿食蚜蠅體內(nèi)優(yōu)勢(shì)屬也為黑粉菌屬、占43.28%；此外，東亞飛蝗和刺腿食蚜蠅體內(nèi)相差最大的屬為畢赤酵母屬，前者較后者高28.82個(gè)百分點(diǎn)。

統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，共有的酵母屬中，東亞飛蝗體內(nèi)含量在1%以上的有6個(gè)，分別為線黑粉菌屬44.77%、畢赤酵母屬34.30%、假絲酵母屬（3.49%）、Udeniomyces3.49%、隱球酵母屬（Cryptococcus）1.74%、Papiliotrema1.74%；而刺腿食蚜蠅體內(nèi)含量在1%以上的屬有11個(gè)，分別為黑粉菌屬43.28%、Udeniomyces7.46%、假絲酵母屬7.46%、梅奇酵母屬5.97%、金擔(dān)子菌屬（Aureobasidium）5.97%、畢赤酵母屬4.48%、Cystofilobasidiu4.48%、Protocheca4.48%、Papiliotrema1.49%、Kwoniella1.49%、裂殖酵母屬1.49%。此外，東亞飛蝗和刺腿食蚜蠅體內(nèi)未分類的真菌分別占4.4%和12.6%。

圖3 門水平菌群分類學(xué)組成和分布

圖4 屬水平菌群分類學(xué)組成和分布

表5 各分類水平的微生物類群數(shù)統(tǒng)計(jì)

3 結(jié)論與討論

新疆是東西方生物多樣性的過渡帶。從生態(tài)類型劃分看，是歐洲夏干帶和東亞夏濕帶之間的過渡帶。石河子地區(qū)屬于北疆地區(qū)典型的寒溫帶氣候，嚴(yán)酷的自然環(huán)境成為酵母菌進(jìn)化的驅(qū)動(dòng)力，因此其酵母菌多樣性存在特異性。酵母菌的生存分布受其直接和間接生存微環(huán)境特征的影響［12］，本研究中2個(gè)采樣點(diǎn)較近，其生境在同一農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中高度重合，且東亞飛蝗和刺腿食蚜蠅均為雜食性昆蟲［1，13］，通過Alpha多樣性分析和菌群結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)刺腿食蚜蠅體內(nèi)內(nèi)生酵母菌多樣性略高于東亞飛蝗，但差異性并不顯著，二者的主要差別在于在于其體內(nèi)特有的酵母。

統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，擬威爾嗜殺酵母和擲孢酵母只存在于東亞飛蝗體內(nèi)。擲孢酵母的某些類群是人和植物的病原菌［14］，從蘋果葡萄等植株的葉片、花以及果實(shí)和其他單子葉植物中能夠分離得到，并引起植物炎癥［15］。昆蟲內(nèi)共生菌不僅能調(diào)控宿主昆蟲的營(yíng)養(yǎng)代謝和生殖代謝，還能協(xié)助昆蟲抵御生物、非生物脅迫，提高昆蟲對(duì)化學(xué)農(nóng)藥的抗性及對(duì)寄主植物的適應(yīng)性等［16］而擲孢酵母某些菌株具有細(xì)胞分化抵抗逆境的特點(diǎn)，可作為研究發(fā)育調(diào)控和抗逆機(jī)制的潛在模式生物［17］。有研究表明其抗藥性近年來也有增加趨勢(shì)，導(dǎo)致傳統(tǒng)的化學(xué)藥物對(duì)蝗蟲防治日漸式微［18-19］。在同一自然生境中，刺腿食蚜蠅體內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)擲孢酵母。表明蝗蟲內(nèi)擲孢酵母的的抗性機(jī)制可能是導(dǎo)致極端環(huán)境條件下蝗蟲抗性增加的原因之一。擲孢酵母既是某些農(nóng)林經(jīng)濟(jì)作物的病原菌，又可能是蝗蟲抗性增加的調(diào)控因子。而野生的嗜殺酵母能夠產(chǎn)生一定量的嗜殺因子以抵抗病原真菌的感染而不對(duì)自身產(chǎn)生作用［20-21］，這在一定程度上解釋了為何蝗蟲體內(nèi)存在病原真菌而不被感染。目前嗜殺酵母已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)［22］。本研究并未對(duì)擲孢酵母對(duì)蝗蟲抗性調(diào)控的分子機(jī)理以及嗜殺因子的藥理進(jìn)行深入研究，也并未見相關(guān)報(bào)道，因此通過對(duì)其進(jìn)一步研究可為相關(guān)農(nóng)業(yè)病蟲害的綜合性治理提供新思路。

本研究通過熒光定量原位測(cè)序技術(shù)對(duì)酵母進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)限制性片段多態(tài)分析（PCR-ITS—RFLP）并進(jìn)行了變性凝膠電泳分析，結(jié)果表明DGGE不適用于酵母種群多樣性的定量測(cè)定，而PCR—ITS-RFLP所得結(jié)果不能完全反映樣本酵母菌群結(jié)構(gòu)多樣性［23］，但高通量測(cè)序技術(shù)能夠檢測(cè)和鑒定出更多的酵母類群［24］。本研究利用26S rDNA D1/D2區(qū)域序列的高通量測(cè)序，分析2種昆蟲內(nèi)生酵母菌種群結(jié)構(gòu)，結(jié)果充分反映了2種具有不同生態(tài)功能昆蟲內(nèi)生酵母菌多樣性的特征，為新疆豐富酵母菌資源的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。但本實(shí)驗(yàn)所選NL1和NL2引物還檢測(cè)到枝孢屬（Cladosporium）、擬南芥屬（Arabidopsis）等其他非酵母微生物類群，針對(duì)昆蟲內(nèi)生酵母高通量測(cè)序的引物選擇有待進(jìn)一步研究加以改進(jìn)。