劉相局，黃彥良

（1.中國(guó)科學(xué)院海洋研究所 海洋環(huán)境腐蝕與生物污損重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.中國(guó)科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心，山東 青島 266071；4.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，海洋腐蝕與防護(hù)開(kāi)放工作室，山東 青島 266237）

氫鼓泡、氫致裂紋、氫致塑性損失（氫脆）、高 溫氫腐蝕、氫化物相的產(chǎn)生或氫致馬氏體相變等是碳鋼在制造和服役過(guò)程中最為常見(jiàn)的氫損傷形式[1]。目前，常用氫脆泛指以上氫損傷形式。陰極保護(hù)作為碳鋼在服役過(guò)程中最為常見(jiàn)的腐蝕防護(hù)方法之一，在其抑制碳鋼陽(yáng)極溶解的同時(shí)，會(huì)促進(jìn)析氫反應(yīng)的發(fā)生，使碳鋼表面產(chǎn)生更多的氫原子，進(jìn)而增加了碳鋼發(fā)生氫脆的可能性。研究表明，即使施加的陰極保護(hù)電位未達(dá)到析氫電位，材料表面沒(méi)有明顯的析氫現(xiàn)象，仍有氫進(jìn)入金屬材料內(nèi)部，使材料發(fā)生氫脆[2-3]。

微生物腐蝕是指附著在材料表面的生物膜中的微生物自身生命活動(dòng)及其代謝產(chǎn)物直接或間接地加速材料腐蝕過(guò)程的現(xiàn)象。參與材料腐蝕的微生物多是環(huán)境中鐵硫循環(huán)的參與者。腐蝕微生物種類繁多，根據(jù)細(xì)菌種類及作用的不同，可以分為硫酸鹽還原菌SRB、硫氧化菌SOB、產(chǎn)酸菌APB、鐵氧化細(xì)菌IOB、鐵還原細(xì)菌IRB、硝酸鹽還原菌NRB以及產(chǎn)粘液細(xì)菌SFB等[4]。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)金屬材料施加陰極保護(hù)，會(huì)抑制其表面生物膜的附著和生長(zhǎng)，進(jìn)而抑制微生物腐蝕[5]。目前，對(duì)陰極保護(hù)抑制金屬腐蝕的研究主要集中在靜電作用力[6-8]、陰極氧還原反應(yīng)[9-10]對(duì)生物膜的形成，以及陰極保護(hù)對(duì)已附著生物膜的影響[11]等方面。然而在研究陰極保護(hù)對(duì)微生物腐蝕抑制的過(guò)程中，往往會(huì)忽略陰極極化對(duì)材料氫脆的影響。Vigdorovich和Zavershinskii[12]研究了St3鋼在含有SRB和H2S的培養(yǎng)基中的氫滲透電流，發(fā)現(xiàn)氫滲透電流在有菌的培養(yǎng)基中比在無(wú)菌培養(yǎng)基中高2倍以上。Romero等[13]在研究利用氫滲透測(cè)試技術(shù)來(lái)表征金屬/生物膜界面上 SRB的生物活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，該菌的存在明顯增加了金屬的氫滲透電流。Javaherdashti等[14]研究發(fā)現(xiàn)，SRB對(duì)3.5%NaCl溶液中碳鋼的氫致開(kāi)裂有明顯的促進(jìn)作用。因此，在對(duì)碳鋼施加陰極保護(hù)時(shí)，不僅要考慮氫脆等問(wèn)題，還需要考慮到其所處服役環(huán)境中微生物對(duì)氫脆是否有協(xié)同作用。

1 微生物生長(zhǎng)代謝的測(cè)定

微生物的生長(zhǎng)和代謝是影響金屬腐蝕的重要因素之一。因此，在研究微生物對(duì)陰極保護(hù)作用下碳鋼氫滲透的影響前，首先要測(cè)定微生物的生長(zhǎng)和代謝基本參數(shù)，如微生物生長(zhǎng)曲線、代謝產(chǎn)物和對(duì)環(huán)境 pH的影響等。

1.1 微生物生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

1）分光光度法，也稱濁度法。該方法方便、快捷，可連續(xù)測(cè)定，是目前最為常用的測(cè)試方法。測(cè)試細(xì)菌濁度最常用的波長(zhǎng)有480nm（藍(lán)光）、540nm（綠光）、600nm（橙光）和 660nm（紅光）[15]。濁度測(cè)試時(shí)，在較短的波長(zhǎng)下靈敏度最好。對(duì)于細(xì)胞密集的懸液，在較長(zhǎng)波長(zhǎng)下準(zhǔn)確度更高。濁度的單位為某波長(zhǎng)下的光密度（Optical density，OD）。濁度測(cè)量的缺點(diǎn)是不能區(qū)分活菌和死菌，因此對(duì)于微生物衰亡期的測(cè)定不明顯。

2）活菌計(jì)數(shù)法，又稱平板菌落計(jì)數(shù)法，包括平板涂布法和傾倒平板法。其優(yōu)點(diǎn)是可直接反映樣品中活菌數(shù)量，缺點(diǎn)是操作繁瑣。對(duì)于厭氧菌，可在厭氧手套箱內(nèi)進(jìn)行操作，或利用Hungate滾管技術(shù)，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。

3）顯微計(jì)數(shù)法，即利用計(jì)數(shù)室（板）對(duì)微生物進(jìn)行直接計(jì)數(shù)。其優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、迅速、成本低，且能直接觀察微生物細(xì)胞的大小以及形態(tài)特征。缺點(diǎn)是不能區(qū)分測(cè)定死活微生物的數(shù)目。

1.2 菌量測(cè)定

1）濁度與菌體數(shù)量之間的關(guān)系。對(duì)于單細(xì)胞生物，濁度在一定程度上和細(xì)胞數(shù)量成比例?？赏ㄟ^(guò)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，將細(xì)胞數(shù)量（活菌或顯微計(jì)數(shù)）、干重或蛋白質(zhì)含量與濁度聯(lián)系起來(lái)。當(dāng)細(xì)胞濃度過(guò)高時(shí)，測(cè)試濁度會(huì)低于理論值，此時(shí)可對(duì)菌懸液稀釋后再做測(cè)量。為保證測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性，所測(cè)樣品的濁度應(yīng)盡量保持在0.1～0.65之間。

2）三磷酸腺苷（ATP）法。該方法是Littman等[16]提出的，用于測(cè)定油田注水中 SRB的相對(duì)含量。其主要檢測(cè)步驟包括：取樣、樣品 ATP提取、添加熒光素-熒光素酶、測(cè)定生物發(fā)光值、計(jì)算ATP的濃度和活菌數(shù)量。其優(yōu)點(diǎn)是靈敏、快速、簡(jiǎn)便、穩(wěn)定。缺點(diǎn)是熒光強(qiáng)度（RLU）和菌落形成單位（CFU）之間沒(méi)有直接關(guān)系[17]。

3）最大可能菌數(shù)法（The Most Probable Number,簡(jiǎn)稱MPN法）。根據(jù)API RP-38，該方法采用以乳酸鈉為碳源的液體培養(yǎng)基，用以測(cè)定SRB的細(xì)菌數(shù)量。培養(yǎng)基具體成分見(jiàn)表1。

表1 MPN法培養(yǎng)基組成

4）其他方法。菌量的測(cè)定方法還有很多，如上所述的活菌計(jì)數(shù)法和顯微計(jì)數(shù)法不僅可以用于測(cè)定微生物的生長(zhǎng)曲線，同樣可用于菌量的測(cè)定。其他方法還有電子計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)法、測(cè)定細(xì)胞質(zhì)量法、測(cè)定細(xì)胞總氮量或總碳量法等。

微生物生長(zhǎng)曲線及菌量測(cè)試方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)根據(jù)不同的測(cè)試精度要求、儀器設(shè)備、測(cè)試時(shí)間等因素，綜合考慮，選擇最適宜的測(cè)試方法。

1.3 其他參數(shù)的測(cè)定

1）pH值的測(cè)定。pH值是影響微生物腐蝕的重要因素之一，同樣也是影響陰極保護(hù)過(guò)程中碳鋼氫滲透的重要因素。特別是當(dāng)周?chē)h(huán)境處于酸性狀態(tài)時(shí)，陰極保護(hù)會(huì)促進(jìn)碳鋼表面氫的形成，加速氫脆的發(fā)生。

2）代謝產(chǎn)物的測(cè)定。微生物代謝產(chǎn)物具有多樣性，對(duì)氫滲透的影響也各不相同。SRB的代謝產(chǎn)物 H2S微溶于水后會(huì)產(chǎn)生 H2，造成氫脆[18-19]。F.Huang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，H2S對(duì) X65鋼的腐蝕產(chǎn)物FeS在基體表面附著，可阻礙其氫滲透。產(chǎn)酸菌如硝酸鹽及亞硝酸鹽氧化菌、硫桿菌屬、醋酸桿菌等能夠代謝產(chǎn)生乙酸、甲酸、H2NO3和 H2SO4等[4]。這些酸的存在會(huì)顯著降低周?chē)h(huán)境的pH值，使金屬發(fā)生腐蝕以及促進(jìn)陰極保護(hù)過(guò)程中氫的產(chǎn)生，導(dǎo)致氫脆。

常用的微生物代謝產(chǎn)物檢測(cè)手段有氣相色譜法和高效液相色譜法等。若對(duì)精度要求較高，可將色譜和質(zhì)譜聯(lián)用，使兩者優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)。例如氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS）。核磁共振技術(shù)（NMR）同樣也可用于高精度代謝產(chǎn)物分析。

2 氫滲透測(cè)量系統(tǒng)

2.1 試樣的選擇及測(cè)試前處理

氫滲透試樣可以是片狀或者管狀的。其尺寸應(yīng)能用于分析基于一維擴(kuò)散的瞬態(tài)滲透電流。根據(jù)ASTM G148—97[21]，片狀試樣暴露于電解質(zhì)溶液的半徑與厚度比應(yīng)大于10∶1，管狀試樣需根據(jù)平面擴(kuò)散方程分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其外徑與內(nèi)徑比值應(yīng)小于 1∶1?？紤]到原子氫從充氫面擴(kuò)散至另一面所需的響應(yīng)時(shí)間、氫滲透電流密度達(dá)到穩(wěn)態(tài)擴(kuò)散電流密度所需的時(shí)間以及長(zhǎng)時(shí)間實(shí)驗(yàn)導(dǎo)致試片被腐蝕等問(wèn)題，還需要選擇具有合適厚度的試樣。

試樣在陽(yáng)極池的一面常采用金屬鎳[22-23]或金屬鈀[24-25]作鍍層，以提供試樣表面原子氫被氧化的催化活性，并阻止金屬試樣表面發(fā)生腐蝕反應(yīng)，增加測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性[26]。幾種鍍層工藝條件見(jiàn)表2。

表2 常見(jiàn)鍍鎳/鍍鈀配方及工藝條件

2.2 Devanathan-Stachurski雙電解池及測(cè)試系統(tǒng)

氫滲透測(cè)試目前多采用Devanathan-Stachurski雙電解池技術(shù)[30]。以片狀試樣所適用裝置為例。如圖1所示，裝置由金屬試樣分成互不相通的左右兩室，分別為陰極池和陽(yáng)極池。右側(cè)陽(yáng)極池一般充入優(yōu)級(jí)純的氫氧化鈉溶液，并對(duì)試樣 A面施加恒定的陽(yáng)極極化電位。若陽(yáng)極池填充0.1mol/L NaOH溶液，通過(guò)測(cè)定鍍鎳層在其中的鈍化區(qū)間（約為 0～+300 mV (vs.Hg/HgO)）[31]，可確定對(duì)陽(yáng)極池施加的陽(yáng)極極化電位，例如+300 mV (vs.Hg/HgO)的極化電位。當(dāng)測(cè)得電流密度小于0.1 μA/cm2后，即可滿足背景電流要求[21]，可進(jìn)行下一步氫滲透測(cè)試。將待測(cè)電解質(zhì)溶液（例如含待測(cè)菌體的培養(yǎng)基、無(wú)菌培養(yǎng)基或其他溶液等）充入陰極池，對(duì)試樣C面施加陰極電位或電流，發(fā)生反應(yīng)H++e→H0，產(chǎn)生的原子氫H0一部分復(fù)合成分子氫放出，另一部分通過(guò)表面吸附和擴(kuò)散作用進(jìn)入試樣內(nèi)部。氫原子擴(kuò)散至A面后，將在A面被氧化（H0→H++e）而產(chǎn)生陽(yáng)極電流，利用恒電位儀將該電流記錄下來(lái)，減去背景電流后即為即時(shí)的氫滲透電流。

若待測(cè)電解質(zhì)溶液為無(wú)菌/有菌培養(yǎng)基，則測(cè)試前須將裝置放入滅菌鍋內(nèi)121℃滅菌20～25min，不能滅菌的裝置用75%酒精擦拭，并用紫外線滅菌燈照射滅菌30min。管狀試樣用Devanathan-Stachurski雙電解池模型如圖2所示。

3 結(jié)語(yǔ)

微生物在環(huán)境中無(wú)處不在，且具有生物多樣性和代謝產(chǎn)物多樣性。關(guān)于微生物的研究目前主要集中在其對(duì)金屬材料的腐蝕情況，而對(duì)于微生物、氫滲透和陰極保護(hù)三者之間關(guān)系的研究報(bào)道很少。在已有報(bào)道中可以看出，微生物的存在促進(jìn)了陰極保護(hù)下金屬的氫滲透[19,23,29]，起抑制作用的微生物鮮有報(bào)道。因此，研究微生物作用下碳鋼陰極保護(hù)對(duì)氫滲透的影響對(duì)實(shí)際工程應(yīng)用中陰極保護(hù)電位的選取具有重要的意義。