張園 肖冰 田晶晶 許文濤

（中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083）

“民以食為天，食以安為先”。食品安全是社會廣泛關(guān)注的話題，也是關(guān)乎國計民生的大事。隨著我國經(jīng)濟水平的提升，食品的流通量加大、加工方式更加多樣，這對食品安全檢測技術(shù)提出了更高的要求，如靈敏度更高、特異性更好、檢測時間更短、成本更低和現(xiàn)場檢測等。

食品安全風險因子檢測方法中，高效液相色譜法、氣相色譜法等大型儀器檢測方法靈敏度好、操作簡單，同時也存在檢測成本高、無法實現(xiàn)高通量檢測等缺陷；免疫檢測法特異性好、檢測原理相對簡單，但抗體的成本較高，并且性質(zhì)不夠穩(wěn)定；功能核酸生物傳感器種類多樣，無需大型儀器設(shè)備，通過信號擴增技術(shù)可以提高檢測靈敏度，檢測成本相對較低。功能核酸能夠通過特定核酸結(jié)構(gòu)發(fā)揮相應功能，功能核酸生物傳感器應用功能核酸實現(xiàn)信號識別、信號放大或信號輸出。

恒溫技術(shù)是無需變換溫度即可進行相關(guān)反應，達到目的效果的技術(shù)，因此無需變溫設(shè)備，能夠在一定程度上節(jié)省檢測時間、降低檢測成本。恒溫技術(shù)僅需恒溫儀器，部分恒溫技術(shù)甚至無需溫度控制相關(guān)儀器，在室溫下即可進行。為了降低對儀器設(shè)備的依賴度，實現(xiàn)現(xiàn)場檢測，恒溫技術(shù)在功能核酸生物傳感器中得到發(fā)展和應用。通常，生物傳感器由3部分組成：信號識別元件、信號放大元件和信號輸出元件。根據(jù)恒溫技術(shù)在傳感器中的不同作用，可將恒溫技術(shù)劃分為恒溫介導的信號識別技術(shù)、恒溫介導的信號放大技術(shù)、恒溫介導的信號輸出技術(shù)3大類（圖1）。

圖 功能核酸生物傳感器中的恒溫技術(shù)分類圖

1 恒溫技術(shù)介導的信號識別技術(shù)

1.1 核酸靶物質(zhì)識別技術(shù)

使用功能核酸生物傳感器進行核酸靶物質(zhì)檢測時，最常用的就是引物和探針。引物和探針都是基于堿基互補配對原則來識別特定核酸序列的。不同之處在于，引物與核酸結(jié)合后要進行延伸，所以引物的3′端必須有羥基，為引物延伸做準備。探針通過多年的發(fā)展和改進，已經(jīng)與多種技術(shù)進行結(jié)合，可以實現(xiàn)信號識別和信號輸出雙重功能。最常用的是熒光探針，在核酸兩端分別標記熒光基團和淬滅基團，通過改變標記的基團之間的距離產(chǎn)生熒光信號的變化。例如，taqman探針、小溝結(jié)合（Minor groove binder，MGB）探針和分子信標等。引物和探針在進行核酸識別中最為經(jīng)典，但是其特異性有待提升，未來可以與新興納米材料進行結(jié)合，在生物傳感器中實現(xiàn)更多功能。

1.2 非核酸靶物質(zhì)識別技術(shù)

1.2.1 適配體 適配體是一類能夠特異性結(jié)合靶物質(zhì)的脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，DNA）或者核糖核酸（Ribonucleic acid，RNA）片段。適配體的特異性主要由核酸序列決定。相比于抗體，適配體具有穩(wěn)定性高、成本低、不存在批次差異和便于保存等特點。此外，適配體在實際檢測應用中便于被修飾和固定，并且適配體信號識別模式容易與核酸擴增相結(jié)合，實現(xiàn)信號放大，提高檢測靈敏度。

適配體通常是由體外篩選得到的，其中指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化技術(shù)（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）篩選方法應用最為廣泛。SELEX方法是Ellington和Szostak等［1］于1990年發(fā)明的。在此基礎(chǔ)上，發(fā)展多種SELEX的改進方法，如轉(zhuǎn)換 SELEX［2］、毛細管電泳SELEX［3］和微流控 SELEX［4］。

目前適配體在多個檢測方法中有廣泛應用，如光學、電化學和質(zhì)量測定。此外，其可以作為治療劑［5］、抗感染藥［6］和藥物遞送分子［7］，并且可以用于癌癥檢測［8］。適配體的性能優(yōu)越，更多物質(zhì)的適配體將會出現(xiàn)，篩選特異性高、親和力強的適配體的相關(guān)研究將會增加。

1.2.2 脫氧核酶 第一個脫氧核酶是于1994年用Pb2+篩選的RNA切割核酶［9］。切割核酶由酶鏈和底物鏈兩部分組成。當特定的物質(zhì)存在時，與酶鏈相互作用，其切割特性被激活，底物鏈在特定位點被切割。RNA切割核酶的底物鏈中插入了核糖核苷酸，并在核糖核苷酸處被切割。切割核酶識別靶物質(zhì)的特異性主要是由酶鏈的序列決定的。RNA切割核酶相比于DNA切割核酶切割效率更高，所以應用更加廣泛。

根據(jù)激活切割活性物質(zhì)的不同，切割核酶可以分為金屬核酶和非金屬核酶。以金屬離子作為切割活性激活物質(zhì)的RNA切割核酶被廣泛應用于功能核酸生物傳感器中。多種金屬離子的切割核酶被篩選，如 Mg2+［10］、Zn2+［11］等。另外，微生物分泌物［12］、組氨酸［13］等也可以激活核酶的切割活性。部分RNA切割核酶能夠被不同物質(zhì)激活切割活性，今后對RNA切割核酶特異性的研究需進一步加強。

1.2.3 點擊反應 點擊化學，又譯為“鏈接化學”、“動態(tài)組合化學”、“速配接合組合式化學”，是在2001年引入的一個合成概念，主旨是通過小單元的拼接來快速可靠地完成形形色色分子的化學合成［14］。點擊化學的代表反應為銅催化的疊氮-炔基環(huán)加成反應，此原理廣泛應用于銅離子的檢測。

Ge等［15］開發(fā)了一種基于點擊反應的銅離子檢測方法。作者將G-四聯(lián)體序列進行劈裂，將兩段G-四聯(lián)體序列的3′端和5′端分別修飾疊氮基和炔基。當沒有銅離子時，不能發(fā)生點擊反應，G-四聯(lián)體無法發(fā)揮過氧化物酶催化活性。當銅離子存在時，在銅離子的催化作用下，發(fā)生點擊反應，形成完整的G-四聯(lián)體序列，在氯化血紅素和過氧化氫存在時，催化TMB產(chǎn)生有色物質(zhì)。借助酶標儀，最低檢測限可達5.9 nmol/L。此外，還可以通過金納米顆粒的顏色特性，利用銅離子催化點擊反應的性質(zhì)檢測銅離子［16］。點擊反應原理簡單，容易實現(xiàn)，今后的研究中可以將其與更多功能核酸結(jié)合應用于傳感器檢測中。

1.2.4 錯配 通常，單鏈DNA可以基于堿基互補配對原則通過形成氫鍵產(chǎn)生穩(wěn)定的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)。但是，近年來研究發(fā)現(xiàn)，若兩條鏈都為胸腺嘧啶（Thymine，T），在汞離子（Hg2+）存在時，可以形成T-Hg2+-T錯配結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定DNA雙鏈結(jié)構(gòu)。能夠形成相似結(jié)構(gòu)的還有胞嘧啶（Cytosine，C）和銀離子（Ag+），形成C-Ag+-C結(jié)構(gòu)?；谏鲜鲈?，多種銀離子和汞離子的檢測方法被開發(fā)。

錯配結(jié)構(gòu)可以與不同的核酸結(jié)構(gòu)結(jié)合，如發(fā)卡和G-四聯(lián)體。Stobiecka等［17］利用T-Hg2+-T錯配開發(fā)了一種由汞離子和半胱氨酸作為開關(guān)的檢測方法。作者將發(fā)卡頸部的序列插入一個T-T錯配，發(fā)卡序列兩端分別標記熒光基團和淬滅基團。起始為發(fā)卡打開的狀態(tài)，有熒光信號，當汞離子存在時，發(fā)卡結(jié)構(gòu)形成，熒光淬滅。當再加入半胱氨酸時，半胱氨酸能夠與汞離子結(jié)合，導致發(fā)卡結(jié)構(gòu)被破壞，熒光信號再次產(chǎn)生。Li等［18］將C-C錯配設(shè)計在G-四聯(lián)體序列中，銀離子的存在與否會影響G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)的形成。當環(huán)境中存在游離的銀離子，G-四聯(lián)體可以在氯化血紅素存在時催化ABTS反應，實現(xiàn)可視化檢測。

2 恒溫技術(shù)介導的信號放大技術(shù)

2.1 非酶依賴的信號放大技術(shù)

2.1.1 雜交鏈式反應 雜交鏈式反應（Hybridization chain reaction，HCR）是一個無酶參與的擴增過程，于2004年被Dirks和Pierce［19］報道。首先，需要設(shè)計合理的發(fā)卡引物（H1和H2）和核酸促發(fā)因子。發(fā)卡通常由三部分構(gòu)成：頸、環(huán)及toehold序列。toehold序列的長度是HCR的決定性因素，如果太短，則不足以啟動HCR反應。研究表明，當toehold序列為6-10個堿基對時，HCR反應的速率比較穩(wěn)定［20］?；趖oehold原理，觸發(fā)子可以破壞發(fā)卡1結(jié)構(gòu)，將發(fā)卡1 部分單鏈暴露出來，繼而打開發(fā)卡2，實現(xiàn)相互雜交，得到長雙鏈DNA產(chǎn)物。通過與熒光染料、G-四聯(lián)體、納米顆粒、電化學信號物質(zhì)等結(jié)合，可以實現(xiàn)HCR擴增產(chǎn)物的熒光信號輸出、電化學信號輸出、化學發(fā)光信號輸出、可視化信號輸出等。目前HCR已經(jīng)應用于多種靶物質(zhì)的檢測，如核酸（DNA或RNA）、小分子、金屬離子甚至癌細胞。

2.1.2 三明治結(jié)構(gòu) 三明治結(jié)構(gòu)（Sandwich）在生物檢測、臨床分析、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。相比于普通的識別模式，sandwich需要分析物質(zhì)與兩個識別物結(jié)合，這大大提高了其特異性。在核酸檢測中，普通sandwich只有一個信號分子，為了實現(xiàn)信號放大的目的，核酸檢測中可以在sandwich的基礎(chǔ)上增加了多重信號探針，這種技術(shù)即為supersandwich。Xia等［21］率先開展了相關(guān)研究工作。他們采用了標記亞甲基藍的探針，當靶物質(zhì)存在時，可與信號探針雜交形成黏性末端，暴露出的單鏈可繼續(xù)結(jié)合靶物質(zhì)，進而結(jié)合信號探針，如此循環(huán)形成supersandwich結(jié)構(gòu)。這種方法的檢測限（100 fmol/L）明顯低于普通sandwich的檢測限（100pmol/L）。在此基礎(chǔ)上，Chen等［22］引入輔助探針，與信號探針的兩個部分互補配對，當靶物質(zhì)存在時，結(jié)合信號探針形成粘性末端，結(jié)合輔助探針，進而再次結(jié)合信號探針，如此循環(huán)，實現(xiàn)僅一個靶物質(zhì)分子就可以生成帶有多個信號探針的DNA長雙鏈。此方法檢測限低至100 amol/L。

2.2 酶依賴的信號擴增技術(shù)

2.2.1 環(huán)介導的等溫擴增技術(shù) 環(huán)介導的等溫擴增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）最早由Notomi等［23］在2000年提出，是一種簡單（一步式）、快速、高靈敏（6 拷貝數(shù)）的核酸擴增技術(shù)。LAMP擴增的實現(xiàn)依賴于其特殊的引物（每次擴增需4-6個引物）和有鏈置換作用的Bst DNA聚合酶。在擴增過程中，引物識別模板鏈特定的DNA片段。擴增初期，4條引物被使用，分別為上下游內(nèi)外引物，在Bst DNA聚合酶的作用下延伸，形成啞鈴形的DNA結(jié)構(gòu)，然后進行延伸和鏈替代，得到雙鏈DNA產(chǎn)物［24］。整個擴增過程在60-65℃環(huán)境下，45-60 min內(nèi)即可完成。

LAMP擴增靈敏度高，可以擴增6拷貝數(shù)的DNA片段，但是也容易被污染，產(chǎn)生假陽性。擴增產(chǎn)物可以通過濁度檢測、電泳檢測、熒光檢測（熒光染料）等多種方式表征。隨著LAMP技術(shù)的發(fā)展，多重LAMP擴增方法目前已與多種技術(shù)結(jié)合，應用于檢測領(lǐng)域，如多重微流控LAMP［25］、實時多重LAMP［26］。Chen 等［27］將多重 LAMP 與核酸側(cè)流層析傳感器進行結(jié)合。LAMP擴增過程中采用2條內(nèi)引物做半抗原標記，靶標物質(zhì)的兩端通過“半抗原標記-抗體”識別體系進行檢測，最后通過金納米粒子進行信號輸出。使用該方法，可在50 min內(nèi)完成銅綠假單胞菌和其毒素基因的檢測，最低檢測限可達20 CFU/mL。

2.2.2 依賴解旋酶擴增技術(shù)（Helicase-dependent amplification，HDA） 該技術(shù)在2004年被首次報道，是一種類似于體內(nèi)DNA復制的擴增方式［28］。HDA利用解旋酶在三磷酸腺苷存在情況下的解旋活性，將DNA雙鏈打開，無需熱熔解步驟。為了防止DNA鏈再次結(jié)合，加入單鏈結(jié)合蛋白與解旋的DNA單鏈結(jié)合。上游引物和下游引物與DNA單鏈結(jié)合，在DNA聚合酶的作用下延伸形成新鏈，新鏈又會被解旋酶打開并被單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合，從而進入新一輪的解旋擴增循環(huán)，如此反復循環(huán)。在60-65℃的單一溫度下，60-120 min內(nèi)即可達到指數(shù)擴增。HDA系統(tǒng)中使用的熱穩(wěn)定UvrD解旋酶極大地提高了該方法在更高溫度（60-65℃）下的特異性和靈敏度。但是解旋酶UvrD的解旋速度（20 bp/s）和持續(xù)性（每個結(jié)合解旋少于100 bp）導致HDA不適用于長鏈擴增［28］。

HDA已經(jīng)被應用于多種靶物質(zhì)的檢測，如致病菌、埃博拉病毒RNA及單堿基突變等。在與功能核酸側(cè)流層析傳感器聯(lián)用時，通常將HDA反應體系中的上、下游引物分別做半抗原標記，通過HDA擴增獲得兩端有不同半抗原標記的雙鏈DNA產(chǎn)物［29］。Tong等［30］結(jié)合限制性切克內(nèi)切酶來提高檢測過程中的特異性、減少擴增反應所需的時間。

2.2.3 重組酶聚合酶擴增技術(shù)（Recombinase polymerase amplification，RPA） 2006 年 Piepenburg 等［31］首次報道該技術(shù)。在核酸擴增技術(shù)中，重組酶聚合酶擴增技術(shù)引起格外的注意RPA。RPA沒有初始DNA雙鏈熔解步驟，在37-42℃之間，20 min內(nèi)即可完成擴增。重組酶聚合酶技術(shù)包括3種核心成分：結(jié)合單鏈核酸的重組酶、單鏈結(jié)合蛋白及具有鏈置換活性DNA聚合酶。在擴增過程中，重組酶與引物結(jié)合形成復合物定向?qū)ふ彝葱蛄?。當找到靶序列時，在重組酶的作用下雙鏈DNA被打開，引物插入。為了防止雙鏈重新結(jié)合，單鏈結(jié)合蛋白與被打開的單鏈DNA結(jié)合。在DNA聚合酶的作用下，引物延伸得到新鏈，完成DNA模板鏈的指數(shù)型擴增。

RPA可以有效擴增DNA和RNA模板，已經(jīng)廣泛應用于多種目標的檢測，包括細菌、真菌、寄生蟲、癌細胞、病毒和轉(zhuǎn)基因。檢測和擴增時間的限制不同，可能與靶物質(zhì)序列、樣品種類、引物和擴增子長度等有關(guān)系。RPA在終點檢測和實時檢測中都有應用，其中具有代表性的是試紙條檢測［32］和實時熒光檢測［33］。試紙條提供了一種低成本、可視的定性/半定量檢測方法。相反，實時熒光檢測能夠?qū)崿F(xiàn)擴增過程的實時檢測，但需要特定的信號讀取設(shè)備。

2.2.4 交叉引物擴增技術(shù) 交叉引物擴增技術(shù)（Cross-priming amplification，CPA）是由杭州優(yōu)思達公司獨立研發(fā)成功的一種新的核酸恒溫擴增技術(shù)，也是中國首個具有自主知識產(chǎn)權(quán)的核酸擴增技術(shù)。CPA擴增體系中除包含具有鏈置換功能的Bst DNA聚合酶大片段外，還包括多條擴增引物，在Bst DNA聚合酶在作用下，不同位置的引物發(fā)生連續(xù)的循環(huán)擴增［34］。該反應通常在65℃恒溫下進行，得到雙鏈DNA產(chǎn)物。反應時間約1 h。

CPA擴增成本低，操作簡單，在致病菌檢測、轉(zhuǎn)基因檢測、病毒檢測等都有應用。CPA擴增產(chǎn)物可以通過濁度、擴增子電泳、雙鏈DNA特異性熒光染料或環(huán)磷酸熒光試劑等進行檢測。另外，也可以與試紙條檢測傳感器聯(lián)合使用。Wang等［35］報道的多重CPA結(jié)合多重核酸側(cè)流層析傳感器，通過引物設(shè)計和側(cè)流層析傳感器檢測線數(shù)量調(diào)整實現(xiàn)了多重檢測。

2.2.5 等溫鏈置換聚合酶擴增技術(shù)（Isothermal stranddisplacement polym-erase reaction，ISDPR） ISDPR基于一條發(fā)夾模板、一條線性引物和具有鏈置換活性的DNA聚合酶，發(fā)夾與單鏈靶標DNA雜交后被打開暴露出單鏈模板，線性引物進一步與模板DNA雜交并在DNA聚合酶延伸后替代靶標DNA，得到雙鏈DNA產(chǎn)物，而被替代的靶標DNA可以繼續(xù)打開新的發(fā)夾模板實現(xiàn)循環(huán)擴增，從而達到大量擴增的目的，該反應通常在42℃恒溫下進行。

此恒溫擴增方式設(shè)計簡單，操作方便。He等［36］將ISDPR反應與試紙條聯(lián)合使用，實現(xiàn)核酸的可視化檢測。作者將發(fā)卡和引物分別標記生物素和地高辛，所以擴增產(chǎn)物的兩端分別被標記了生物素和地高辛。在試紙條檢測線標記生物素抗體，擴增產(chǎn)物可以被固定在試紙條上，然后標記地高辛抗體的金納米顆粒與擴增產(chǎn)物結(jié)合，實現(xiàn)顏色信號的輸出。

2.2.6 切克內(nèi)切酶介導等溫擴增技術(shù)（Nicking endonuclease mediated isothermal amplification，NEMA）NEMA是利用切克內(nèi)切酶和Bst DNA聚合酶實現(xiàn)的擴增反應。切克內(nèi)切酶能夠識別DNA雙鏈特定的序列，并在特定位置切割其中的一條DNA鏈。DNA鏈首先被普通引物和帶有切割位點的引物擴增，得到帶有切割位點的DNA雙鏈產(chǎn)物。雙鏈DNA的其中一條鏈被切克內(nèi)切酶切割，在其他引物的作用下延伸，發(fā)生鏈替代擴增反應。NEMA的擴增產(chǎn)物為DNA單鏈。

通常切克內(nèi)切酶的最適孵育溫度為55-65℃。另外，NEMA可以擴增400-500 bp的DNA序列，可以滿足日常分子診斷需求。有報道NEMA可以用于定量檢測。例如，Xu等［37］開發(fā)出NEMA-SMB擴增方式，將NEMA與分子信標進行結(jié)合，分子信標使擴增過程以熒光信號的方式被表征出來，實現(xiàn)高特異性和高靈敏度的定量檢測。雖然NEMA用于全基因組擴增時反應體系不夠穩(wěn)定，但是仍可作為鏈置換擴增反應的一個替代選擇。

2.2.7 核酸序列依賴擴增技術(shù)（Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA） NASBA 于 1991年被首次報道［38］，NASBA技術(shù)通過AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、T7RNA聚合酶、RNase H三種酶和一對引物（下游引物5′端帶有T7RNA聚合酶啟動子序列）得到RNA單鏈產(chǎn)物。NASBA被設(shè)計用于RNA擴增，但是某些情況下也可用于DNA擴增。NASBA反應溫度通常為4℃，反應前需要雙鏈高溫分離步驟，若為DNA雙鏈，則需95℃處理，若為RNA，則需65℃處理。反應時間從1.5-3 h不等。NASBA技術(shù)能直接使用RNA單鏈做模板，有效降低核酸污染。

多重 NASBA在1999年被首次報道，研究人員在一個NASBA反應中使用生物素和ECL標記定量檢測兩個mRNAs［39］。另外，通過使用不同的熒光素基團標記的分子信標，可以實現(xiàn)多重實時NASBA［40］，可以使用特定的激發(fā)光和發(fā)射光濾光片同時測量不同的熒光團。

2.2.8 滾環(huán)擴增技術(shù)（Rolling cycling amplification，RCA） RCA通過使用環(huán)狀DNA模板和高度持續(xù)的DNA或RNA聚合酶實現(xiàn)短核酸靶標的擴增，擴增產(chǎn)物為含有與環(huán)狀模板互補的串聯(lián)序列的長單鏈核酸。當短核酸鏈與環(huán)狀DNA模板結(jié)合時，在聚合酶的作用下開始延伸，并替代已合成的鏈，形成長單鏈產(chǎn)物，長度可達105堿基。用于擴增RNA靶標時，通常使用T7 RNA聚合酶；用于DNA靶標時，通常使用噬菌體Φ29酶、Bst和Vent exo-DNA聚合酶。RCA擴增通常在30-65℃下進行，在30-90 min內(nèi)即可完成擴增［41］，并且在10拷貝數(shù)DNA存在時即可啟動反應。為了提高RCA反應的擴增效率，超支化RCA和網(wǎng)狀RCA已經(jīng)被開發(fā)［42］。

1998年首次將RCA應用于生物檢測［43］。目前被應用于DNA或者RNA的單堿基突變檢測、miRNA、蛋白質(zhì)、三磷酸腺苷等的檢測。人們嘗試將大多數(shù)檢測技術(shù)應用于檢測RCA擴增產(chǎn)物，如伏安法、熒光法、表面增強拉曼光譜、比色法和化學發(fā)光法。

2.2.9 等溫指數(shù)擴增技術(shù)（Exponential amplification reaction，EXPAR） EXPAR首次于2003年被報道，此擴增方式能夠?qū)崿F(xiàn)高靈敏度檢測，其擴增的特異性取決于引物延伸和替代［44］。等溫指數(shù)擴增技術(shù)以單鏈靶標為引物，通過基于切克內(nèi)切酶和Bst DNA聚合酶實現(xiàn)的鏈置換反應。根據(jù)靶標自主設(shè)計含有酶切位點的單鏈模板，引物經(jīng)過DNA聚合酶延伸后與模板形成完整的切克內(nèi)切酶識別位點，單鏈切割后發(fā)生鏈置換反應。該反應通常在65℃恒溫下進行。

Wang等［45］運用EXPAR進行mRNA擴增時，將第一輪EXPAR產(chǎn)物設(shè)計為新的EXPAR的引物，實現(xiàn)進一步的擴增。但是EXPAR不能用于長核酸鏈的擴增，這限制了其應用。

2.2.10 鏈置換擴增反應（Strand displacement amplification，SDA） SDA最早是Walker等［46］于 1992年報道。SDA擴增需要熱前處理解開雙鏈DNA。SDA擴增需要HincII限制性切割酶和具有鏈置換作用的聚合酶。SDA擴增過程中所需引物5′端含有HincII限制酶識別的特定序列。因為合成中使用巰基修飾的脫氧腺苷三磷酸（Deoxyadenosine triphosphate，dATP）代替dATP，所以新合成的DNA鏈具有硫代磷酸酯修飾，不能被HincⅡ切割。原有引物在切割位點處被切割，在聚合酶作用下延伸3′末端并取代下游DNA鏈，以此達到擴展目的。反應溫度通常為30-55℃。

SDA被應用于檢測多種靶物質(zhì)。SDA可以與熒光基團結(jié)合用于致病菌的檢測，如結(jié)核分枝桿菌，擴增過程中，熒光標記探針與擴增產(chǎn)物結(jié)合，使熒光強度隨擴增的進行增加。另外，通過與適配體結(jié)合，也被應用于可卡因的檢測［47］?；赟DA擴增原理，利用SYBR Green I表征擴增產(chǎn)物，同樣可以實現(xiàn)miRNA的檢測。

2.2.11 循環(huán)探針技術(shù)（Cyclic probe technology，CPT） CPT與上述信號放大方式不同，CPT不擴增靶序列，而是通過探針和酶的作用原理實現(xiàn)信號放大［48］。循環(huán)探針為25-30 bp的單鏈多核苷酸，包括3部分：3′端DNA、中間4-6堿基的RNA和5′端DNA。循環(huán)探針可以與靶物質(zhì)雜交形成雙鏈。RNase H酶僅能探針-靶物質(zhì)雜合物的切割磷酸-核糖核苷酸化學鍵，所以探針被切割為兩段序列，靶物質(zhì)可以重新和未切割探針結(jié)合，循環(huán)后獲得大量切割后的探針片段DNA。此方法僅能應用于DNA靶物質(zhì)。CPT反應溫度為55-65℃。CPT產(chǎn)物可以通過多種方式檢測，最常見的是通過使用放射性同位素標記探針的聚丙烯酰胺凝膠電泳，抗體介導的比色酶測定和試紙條也可以實現(xiàn)CPT產(chǎn)物檢測。CPT可以在某些條件下顯示線性響應，便于定量。

2.2.12 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（Terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT） TdT是一種催化脫氧核苷酸結(jié)合到DNA或RNA分子的3′羥基端的無需模板的DNA聚合酶，最早于1958年在牛胸腺中發(fā)現(xiàn)［49］。TdT可以催化dNTP或標記了小分子的dNTP，如Cy3-dNTP，biotin-dNTP，聚合于RNA或單雙鏈DNA的3′-OH末端的反應，該反應不需要特定模板，但引物必須是至少有3個以上堿基的寡核苷酸。TdT酶通常在37℃下使用。

當被用于檢測中信號放大時，TdT酶通常與dGTPs相結(jié)合，增加G-四聯(lián)體的含量。Liu等［50］通過TdT酶聚合制備富含G的隨機DNA序列，并證明了這種隨機富含G的DNA能夠形成G-四聯(lián)體。他們研發(fā)了兩種檢操作單且無標記的檢測TdT酶活性的策略，包括基于脫氧核糖核酸酶的比色測定法和實時熒光測定法。該實驗的實時檢測方法為臨床診斷中關(guān)鍵酶的生化分析提供了一種可行的方法，且操作相對于傳統(tǒng)方法更加簡便。

3 恒溫技術(shù)介導的信號輸出技術(shù)

3.1 恒溫技術(shù)介導的熒光信號輸出技術(shù)

熒光信號是比較靈敏的信號輸出方式，在功能核酸生物傳感器中應用廣泛。熒光產(chǎn)生機理有所不同，最為經(jīng)典的是熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理。熒光共振能量轉(zhuǎn)移是指一個體系含有能量供體與能量受體兩個熒光團，在供體被激發(fā)光所激發(fā)后可以向受體發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，進而受體被激發(fā)，發(fā)出熒光，該種能量的屬性是非輻射的［51］。

根據(jù)其與核酸的作用方式不同，熒光信號分子可以大致分為標記型和免標記型。標記型是指將熒光信號分子通過共價鍵的方式，標記在核酸鏈上，通過核酸結(jié)構(gòu)或位置的改變，對熒光信號產(chǎn)生影響。可以標記在核酸鏈上的熒光基團有羅丹明類、熒光素類及多環(huán)芳烴類等。非標記型中最具有代表性的是核酸染料，如單鏈核酸結(jié)合染料SYBR Gold、SYBR Green Ⅱ等，雙鏈核酸結(jié)合染料SYBR Green I、TOTO-3等。納米材料在熒光信號輸出方面也有不同形式的應用，如金屬納米簇、量子點等。

3.2 恒溫技術(shù)介導的可視化信號輸出技術(shù)

可視化檢測主要是通過顏色的變化來實現(xiàn)的，無需借助任何儀器設(shè)備就可以獲得檢測結(jié)果。也可以借助酶標儀等儀器，進行更加準確的實驗結(jié)果分析和定量檢測。顏色信號一方面可以通過納米材料在溶液中的狀態(tài)產(chǎn)生變化；另一方面可以通過催化底物產(chǎn)生有色物質(zhì)發(fā)生變化。

通過在溶液中的狀態(tài)來產(chǎn)生顏色變化最具有代表性的是金納米顆粒。金納米顆粒有靈敏度高、顏色變化明顯、便于修飾核酸鏈等優(yōu)勢。DNA單鏈可以穩(wěn)定金納米顆粒的分散狀態(tài)，呈現(xiàn)紅色。而DNA雙鏈可以促進金納米顆粒聚集呈現(xiàn)藍色。除此之外，還可以通過金硫鍵將核酸鏈修飾到金納米顆粒的表面，通過核酸鏈的堿基互補，促進金納米顆粒形成聚集狀態(tài)。

目前發(fā)現(xiàn)G-四聯(lián)體和氯化血紅素復合物及很多納米材料有催化活性，通過催化底物產(chǎn)生有色物質(zhì)也可以實現(xiàn)可視化檢測。Wu等［52］利用此原理進行L-半胱氨酸的檢測。首先使用富胞嘧啶序列的DNA制備了DNA-Ag/Pt納米簇，尺寸小、比表面積大的納米結(jié)構(gòu)能有更多的活性位點，更強的催化活性。當加入L-半胱氨酸后，可以促進納米簇聚集，催化活性降低，催化TMB產(chǎn)生的有色物質(zhì)變少，實現(xiàn)L-半胱氨酸的檢測，檢測限為2.0 nmol/L。

3.3 恒溫技術(shù)介導的電信號輸出技術(shù)

電化學生物傳感器具有靈敏度高、操作簡便、便于攜帶等優(yōu)點。根據(jù)電化學信號產(chǎn)生的機理不同，可以大致分為兩大類：一是通過改變電極表面的電荷分布產(chǎn)生電信號；二是通過催化氧化還原反應產(chǎn)生電信號。通常，第一種機理所使用的電信號物質(zhì)通過直接標記在核酸末端、與單雙鏈核酸結(jié)合、嵌入到具有特殊構(gòu)象的核酸中、游離于溶液中檢測等方式表征電化學信號的產(chǎn)生，包括亞甲基藍、六氨合釕、二茂鐵和鐵氰化鉀等。第二種則通過與底物相互作用，促進氧化還原反應和電子轉(zhuǎn)移產(chǎn)生電化學信號，常用的有G-四聯(lián)體、金屬有機框架等。

3.4 拉曼光譜信號輸出技術(shù)

1928年，Raman等［53］發(fā)現(xiàn)了拉曼散射現(xiàn)象。拉曼光譜屬于分子振動光譜，可以反映分子的特征結(jié)構(gòu)。但是拉曼散射效應是個非常弱的過程，目前應用比較多的是表面增強拉曼光譜，用通常的拉曼光譜法測定吸附在膠質(zhì)金屬顆粒如銀、金或銅表面的樣品，或吸附在這些金屬片的粗糙表面上的樣品，其拉曼光譜的強度可提高103-106倍。關(guān)于增強機理的本質(zhì)，學術(shù)界目前仍未達成共識，大多數(shù)學者認為SERS增強主要由物理增強和化學增強兩個方面構(gòu)成，并認為前者占主導地位，而后者在增強效應中只貢獻1-2個數(shù)量級。

Qian等［54］利用玻璃基質(zhì)標記肽核酸發(fā)卡，當靶物質(zhì)存在時，發(fā)卡結(jié)構(gòu)被打開，并且復合物帶有負電荷，可以與銀納米粒子靜電吸附，增強拉曼光譜信號。檢測限可以達到34 pmol/L。

3.5 表面等離子共振信號輸出技術(shù)

表面等離子共振（Surface plasmon resonance，SPR）現(xiàn)象在傳感器中作為信號輸出方式被應用。光在棱鏡與金屬膜表面上發(fā)生全反射現(xiàn)象時，會形成消逝波進入到光疏介質(zhì)中，而在介質(zhì)（假設(shè)為金屬介質(zhì)）中又存在一定的等離子波，當兩波相遇時可能會發(fā)生共振。當消逝波與表面等離子波發(fā)生共振時，檢測到的反射光強會大幅度地減弱。當反射光完全消失時入射角就是SPR角。SPR角隨金屬表面折射率變化而變化，而折射率的變化又與金屬表面結(jié)合的分子質(zhì)量成正比。因此可以通過對生物反應過程中SPR角的動態(tài)變化獲取生物分子之間相互作用的特異信號。Wang等［55］通過基于表面等離子體共振原理利用金納米粒子作為信號放大策略檢測microRNA。首先，他們將DNA探針標記在金芯片上，當靶物質(zhì)存在時可以引發(fā)sandwich結(jié)構(gòu)的形成，與標記核酸鏈的金納米顆粒雜交。標記金納米顆粒的核酸鏈可以在此基礎(chǔ)上不斷結(jié)合，實現(xiàn)信號放大的效果，此方法檢測限達到45 pmol/L。傳感器檢測性能。恒溫介導的功能核酸生物傳感器具有巨大的發(fā)展?jié)摿?，需要更深入的研究?/p>

一方面，恒溫技術(shù)介導的功能核酸生物傳感器需要強有力的理論支持。相關(guān)恒溫技術(shù)需要得到更加深入的理論研究，以便為后續(xù)的優(yōu)化和應用提供基礎(chǔ)。另一方面，恒溫技術(shù)介導的功能核酸生物傳感器需要進一步與實際應用相結(jié)合，并且從實際應用的角度出發(fā)，進行相關(guān)性能的優(yōu)化。

最后，交叉學科是一個重要的發(fā)展趨勢。通過將生物學、納米材料學、化學等學科綜合應用，可以開發(fā)性能更加優(yōu)越的檢測技術(shù)。如應用納米材料具有尺寸效應、磁性、酶催化活性等特點，將其與功能核酸相結(jié)合，可以實現(xiàn)信號擴增或信號輸出的目的。通過將其他學科的技術(shù)與恒溫技術(shù)介導的功能核酸生物傳感器結(jié)合，可以實現(xiàn)更高靈敏度和更高特異性的檢測。

4 總結(jié)與展望

恒溫技術(shù)介導的功能核酸生物傳感器發(fā)展迅速，在信號識別、信號放大和信號輸出方面都展現(xiàn)了巨大的優(yōu)勢。在信號識別方面，恒溫技術(shù)介導的功能核酸生物傳感器通過適配體、RNA切割核酶、點擊反應等方式實現(xiàn)靶物質(zhì)的高特異性識別；在信號擴增方面，恒溫技術(shù)發(fā)揮了無需變溫設(shè)備的優(yōu)勢，同時兼具擴增時間短、擴增產(chǎn)物多樣等特點，無酶擴增方式不僅降低了檢測成本，同時也避免了酶活抑制劑對擴增效果的影響；在信號輸出方面，熒光信號、可視化信號、電化學信號等靈敏度較高，可以提高