謝天楚,李旭軍,李 濤

骨肉瘤是兒童和青年人最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤,根據(jù)其組織學特征，通常將骨肉瘤分為成骨細胞、成軟骨細胞和成纖維細胞骨肉瘤[1]。骨肉瘤具有高度侵襲、轉(zhuǎn)移性。目前以甲氨蝶呤、多柔比星、順鉑為基礎(chǔ)的新輔助化療結(jié)合手術(shù)治療是治療骨肉瘤的主要方式，但其復發(fā)及轉(zhuǎn)移率仍較高，5年生存率<50%[2]，并且骨肉瘤的發(fā)病機制到目前為止并不清楚，因此迫切需要闡明骨肉瘤的發(fā)病機制，找到更佳的治療方法。微小RNA(miRNAs)是一類參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的非編碼RNA，一般長度為20～24 nt,通過上調(diào)或下調(diào)多種重要靶基因的表達,在胚胎發(fā)育和腫瘤形成等過程中發(fā)揮重要作用[3],如miR-298可抑制乳腺癌、胃癌、胰腺癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移，通過特定的靶基因促進癌細胞的凋亡[4-6]。研究表明骨肉瘤的發(fā)生與miRNA在細胞內(nèi)表達失調(diào)相關(guān)，多種miRNA的表達異常對骨肉瘤細胞的惡性生物學行為產(chǎn)生重要影響[7-8]，但目前miR-298在骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展中的作用尚不清楚。Notch信號通路在細胞增殖、分化中起重要作用，其調(diào)控異常通常會導致癌癥的發(fā)生、發(fā)展[9]。在Notch信號調(diào)節(jié)通路中，miR-124可下調(diào)Notch1表達抑制胃癌細胞的增殖與凋亡[10]，也有研究表明通過下調(diào)Notch1的表達可抑制骨肉瘤細胞的分化、增殖和凋亡等，抑制骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展[11]，而miR-298與Notch1在骨肉瘤中的相互作用報道較少。因此本研究通過測定miR-298在骨肉瘤細胞株中的表達水平，進一步研究miR-298對骨肉瘤細胞株生物學行為的影響，并對其可能的機制進行探討,為闡明骨肉瘤的發(fā)病機制提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細胞株和主要試劑 人骨肉瘤細胞株143B、MG63、U2OS、正常人正常成骨細胞株hFOB1.19均購自于中國科學院上海細胞研究所，HEK293人胚胎腎細胞系購自美國ATCC公司。RPMI 1640細胞培養(yǎng)基、胎牛血清及青霉素-鏈霉素(Invitrogen公司，美國)，全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、高靈敏ECL化學放光試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，Lipo-2000轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen，美國)，Transwell小室(Chemicon公司，日本)，Matrigel基質(zhì)膠(美國B&D公司)，兔抗人一抗Notch1(Santa cruz，美國)、兔抗人一抗GAPDH(Santa cruz，美國)以及山羊抗兔二抗IgG(Santa cruz，美國)；其他試劑均由上海國藥試劑分析純配制。

1.2細胞培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染 人源性miR-298擬物序列設(shè)計參考miRBase數(shù)據(jù)庫。將143B、MG63、U2OS、hFOB1.19在補充有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，條件：溫度37℃，5% CO2。每2天更換1次培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24 h前，將細胞以70%～80%的密度接種于生長培養(yǎng)基中。根據(jù)培養(yǎng)手冊，使用Lipofectamine RNAiMax將miR-298 mimics轉(zhuǎn)染至143B細胞，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞作為miR-298過表達組，將Control mimics轉(zhuǎn)染至143B細胞中作為miR-298對照組。同時將Notch1 siRNA及Control siRNA分別轉(zhuǎn)染至143B細胞作為Notch1 siRNA組和Notch1對照組。

1.3定量聚合酶鏈反應(PCR) 將細胞收集后加入含有500 μl的lysis buffer的EP管中裂解，Trozel裂解液抽提組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，PCR擴增目的基因，使用U6作為內(nèi)參。根據(jù)按照Takara公司實時定量PCR試劑盒說明書進行PCR反應。獲得數(shù)據(jù)以RQ=2-ΔΔCT計算mRNA表達量。實驗重復3次。本研究中使用的引物如下：miR-298上游引物:5′-ACACTCAGCTGGGAGCAGAAGCAGGGAG-3′，下游引物:5′- GGTGTCGTGGAGTCG-3′;U6內(nèi)參上游引物：5′-TCCGATCGTGAAGCGTTC-3′，下游引物:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；Notch1上游引物：5′-ATGAGTTCCAGTGCGAGTGC，下游引物：5′-TAAGTGTTGGGTCCGTCCAG-3′；GAPDH上游引物：5′-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3′，下游引物：5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′。

1.4雙熒光素酶活性測定 將miR-298 mimics轉(zhuǎn)染到143B細胞中。分組如下：miR-298 mimics+Notch1 3′UTR Wt、miR-298 NC+Notch1 3′UTR Wt、miR-298 mimics+Notch1 3′UTR Mut、miR-298 NC+Notch1 3′UTR Mut。根據(jù)siPORTneoFX的使用方法，在轉(zhuǎn)染后48 h制備裂解物。然后根據(jù)制造商提供的說明書，使用雙熒光素酶測定系統(tǒng)進行熒光素酶分析。實驗重復3次。

1.5蛋白免疫印跡試驗 提取對數(shù)轉(zhuǎn)染后的生長期的143B細胞，提取蛋白后，用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒定量測定細胞蛋白濃度。通過SDS-PAGE分離后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜中，5%脫脂乳封閉30 min,Notch1一抗(1∶1000)4℃孵育過夜后，用含有TBST溶液洗膜3次，每次10 min，在室溫下孵育二抗(1∶5000)，封閉1 h。使用ECL顯影液檢測目標蛋白的表達水平，GAPDH作蛋白內(nèi)參對照。實驗重復3次。

1.6甲基噻唑基四唑(MTT)增殖實驗 將轉(zhuǎn)染后處于對數(shù)期的143B細胞使用胰蛋白酶消化后，制成單細胞懸浮液并以1×103細胞/孔的密度接種到96孔板中。在細胞培養(yǎng)7 d后，加入20 μl MTT測定液，每孔充分混合均勻，并在37℃下孵育4～6 h。然后使用無菌吸管吸出上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，在室溫下攪拌10 min保證晶體充分溶解。然后在48 h進行MTT測定波長為490 nm時的吸光度，計算骨肉瘤細胞的增殖情況。實驗重復3次。

1.7劃痕遷移實驗 將轉(zhuǎn)染后的143B細胞接種于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基的6孔板中，用1 ml槍頭垂直于孔板制造細胞劃痕，吸去細胞培養(yǎng)液，用PBS沖洗孔板3次，洗去劃痕產(chǎn)生的細胞碎片；加入無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，用倒置顯微鏡拍攝細胞遷移的圖像。通過愈合情況，分析各組細胞的遷移能力變化。實驗重復3次。

1.8細胞侵襲能力檢測 將基質(zhì)膠在4℃條件下過夜融化,并與3倍體積的無血清培養(yǎng)基混合均勻后加入24孔transwell小室(每孔50 μl)。復溫30 min后，將250 ml 10%FBS、DMEM加入下室中，并且將總數(shù)為1×105個轉(zhuǎn)染后的143B細胞種植在上室中，并在培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)24 h。利用棉簽輕微地清潔膜上表面的細胞，穿透聚碳酸酯膜的細胞用甲醇固定并用0.1%結(jié)晶紫染色。隨機選擇5個視野，在倒置顯微鏡下計數(shù)遷移到下側(cè)的細胞數(shù)。實驗重復3次。

2 結(jié)果

2.1不同細胞株中Notch1及Notch1表達水平 miR-298在不同的骨肉瘤細胞中均呈現(xiàn)低表達狀態(tài)。143B、MG63、U2OS細胞株中miR-298表達水平低于hFOB1.19，且143B細胞株低于MG63、U2OS細胞株(P<0.05)。143B細胞株中miR-298的表達水平相對最低，因此后續(xù)實驗選取骨肉瘤細胞株143B作為研究對象。Notch1在不同的骨肉瘤細胞株中均呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。143B、MG63、U2OS細胞株中miR-298表達水平高于hFOB1.19，且143B細胞株高于MG63、U2OS細胞株(P<0.05)。見表1。

2.2miR-298和Notch1在骨肉瘤143B細胞株細胞株中的調(diào)控關(guān)系 與miR-298對照組相比，miR-298過表達組野生型載體Notch1 3'-UTR Wt轉(zhuǎn)染的143B細胞中，Notch1的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；2組野生突變型載體Notch1 3'-UTR Wt轉(zhuǎn)染的143B細胞中Notch1熒光素酶活性比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。通過蛋白免疫印跡實驗我們可以發(fā)現(xiàn)，過表達miR-298后，Notch1蛋白表達含量降低。見圖1。

表1 不同細胞株miR-298及Notch1表達水平

注：hFOB1.19為正常成骨細胞株，143B、MG63、U2OS為骨肉瘤細胞株；與hFOB1.19細胞株比較,aP<0.05;與143B細胞株比較，cP<0.05

表2 miR-298過表達對骨肉瘤143B細胞株Notch1 3'-UTR基因Notch1表達的影響

注：與miR-298對照組比較，aP<0.05

圖12組骨肉瘤143B細胞株中Notch1表達情況

2.3過表達miR-298對骨肉瘤143B細胞株增殖、遷移、侵襲的影響 過表達miR-298后，骨肉瘤細胞增殖數(shù)目、侵襲細胞數(shù)及劃痕實驗傷口愈合率均低于miR-298對照組(P<0.05，P<0.01)。見表3。

表3 過表達miR-298對骨肉瘤143B細胞株增殖、遷移、侵襲的影響

注：與miR-298對照組比較，aP<0.05，bP<0.01

2.4抑制Notch1表達對骨肉瘤143B細胞株增殖、遷移、侵襲的影響 抑制Notch1表達后，骨肉瘤細胞增殖數(shù)目和侵襲細胞數(shù)均較Notch1對照組減少，劃痕實驗傷口愈合率低于Notch1對照組(P<0.05，P<0.01)。見表4。

表4 抑制Notch1表達對骨肉瘤143B細胞株增殖、遷移、侵襲的影響

注：與Notch1對照組比較，aP<0.05，bP<0.01

3 討論

骨肉瘤是起源于間葉組織的惡性腫瘤，占原發(fā)惡性骨腫瘤的20%，是最常見于青少年的一種原發(fā)惡性骨腫瘤[12-15]，70%～80%的患者發(fā)病年齡為10～25歲，每年發(fā)病率為(1～3)/100萬[16]。研究表明骨肉瘤的發(fā)生與先天性染色體異常、p53及Rb抑癌基因失活、生長因子的表達異常有關(guān)[17]，但目前其發(fā)病機制仍不清楚。近年來越來越多的研究表明，miRNA在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。成熟的miRNA經(jīng)典的作用機制是通過其5'到3'端的2～8位堿基序列與靶基因mRNA 3'UTR結(jié)合，形成RNA誘導或沉默復合體，從而抑制靶基因的翻譯或使靶基因mRNA降解活化轉(zhuǎn)錄因子家族，發(fā)揮其對惡性腫瘤細胞生物學行為的調(diào)控作用[18]。Liu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，miR-214可通過促進PENT基因的表達，從而抑制骨肉瘤的增殖及轉(zhuǎn)移Pu等[20]研究表明，miR-34a-5p在耐藥骨肉瘤細胞中可同時對CD117基因及MEF2通路進行調(diào)控，從而影響DNA的生成，抑制骨肉瘤細胞的增殖，促進凋亡，增強其對化療藥物的敏感性。但目前尚未找到影響骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展并起決定性作用的miRNA，因此，尋找骨肉瘤中特異性表達的miRNA及其具體調(diào)控通路，在轉(zhuǎn)錄水平進行外源干預性調(diào)控，可能是治療骨肉瘤的新突破口。

miR-298位于人染色體20q13.32上。近年有研究發(fā)現(xiàn)，miR-298在多種惡性腫瘤中均呈低表達狀態(tài)，并且與惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移、預后密切相關(guān)[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-298可以下調(diào)EZH2的表達，抑制上皮性卵巢癌細胞株的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移[21]，同時在多柔比星耐藥乳腺癌細胞中，過表達miR-298可以下調(diào)P-gp蛋白的表達，增加多柔比星在細胞核中的積聚，增強細胞毒性[22]，但miR-298在骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展中作用目前未見報道。本研究結(jié)果顯示，miR-298在不同的骨肉瘤細胞中均呈現(xiàn)低表達狀態(tài)，進一步使用miR-298過表達后，骨肉瘤143B細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移受到明顯抑制，可見miR-298在骨肉瘤細胞中扮演著抑癌基因的角色。

Notch信號通路是由4個跨膜缺口蛋白組成的高度保守的信號傳導途徑，參與細胞周期、細胞凋亡及增殖的調(diào)控[23]。Notch信號通路主要由Notch配體和靶基因組成，當Notch受體受配體刺激后，可發(fā)生蛋白裂解并進入核內(nèi)的Notch胞內(nèi)域(NICD)與轉(zhuǎn)錄因子CBF1/Suppressor of Hairless/LAG-1/RBP-Jk結(jié)合，啟動轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)靶基因的表達[24]。Notch1是Notch受體蛋白中重要的多功能跨膜受體蛋白，已證實notch1調(diào)控多種惡性腫瘤的生物學行為，激活Notch1信號通路可通過調(diào)節(jié)COX-2促進胃癌細胞的侵襲和集落形成能力[25]，相反，將重組有Notch1基因片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至甲狀腺癌DRO和FTC236細胞中，其增殖明顯受抑制[26]，但miR-298能否通過調(diào)控Notch1信號通路影響骨肉瘤細胞的生物學行為尚不清楚。本實驗研究中，我們發(fā)現(xiàn)，Notch1在不同的骨肉瘤細胞中均呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，進一步抑制Notch1的表達，骨肉瘤143B細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力減弱，并且通過TargetScan數(shù)據(jù)庫對miR-298進行檢索，預測其靶基因，發(fā)現(xiàn)miR-298和Notch1間有部分相同的結(jié)合序列，推測Notch1可能是miR-298的靶基因，熒光光素酶基因報告顯示miR-298 mimics與野生型載體Notch1 3'-UTR Wt共轉(zhuǎn)染后，Notch1的熒光素酶活性顯著降低，蛋白免疫印跡實驗表明過表達miR-298后，Notch1蛋白表達水平降低，提示Notch1是miR-298的靶基因，miR-298可靶向負向調(diào)控Notch1表達水平，抑制骨肉瘤細胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。但其上游及下游是否存在特異性的調(diào)控通路，以后的研究將會進一步探討。

綜上所述，miR-298可靶向下調(diào)Notch1基因的表達，抑制骨肉瘤細胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，可為骨肉瘤的診斷和治療開辟新的治療靶點。