李 達，馬聰玉，呂青林，柳文媛，馮 鋒,2,4，張 杰,4*

(1中國藥科大學中藥學院，南京 210009；2江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學院，淮安 223003；3中國藥科大學藥物分析教研室，南京 210009；4中國藥科大學生物材料重點實驗室，南京 210009)

乳木果仁系山欖科(Sapotaceae)植物乳油木(VitellariaparadoxaC.F.Gaertn)果實(乳木果)的果仁，只能在非洲大陸生長，主產(chǎn)于馬里至蘇丹、烏干達等國家間的亞撒哈拉地區(qū)[1]。作為“藥食兩用”植物，乳木果是當?shù)刂匾氖称穪碓粗?，同時也用于治療曬傷、皮疹、風濕、痢疾、蕁麻疹、胃腸道感染和潰瘍等疾病[2-3]?，F(xiàn)代植物化學研究表明，乳木果仁中主要有三萜、揮發(fā)油、甾體和酚類等化學成分[1-2，4]；現(xiàn)代藥理研究表明，乳木果仁具有抗炎、抗菌和抗氧化等作用[2-3,5-6]。乳木果仁中使用最為廣泛的是其中提取的乳木果油，常應用于皮膚護理產(chǎn)品和化妝品配方成分[6]。

酚類化合物廣泛存在于人們?nèi)粘ｏ嬍持?，具有清除體內(nèi)自由基、抗菌消炎、抗腫瘤、抗過敏、抗病毒等方面的生物活性[7]。此外，已普遍認為人體內(nèi)的過量自由基與多種疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)系，因此尋找天然抗氧化劑已成為國內(nèi)外學者研究的熱點。而目前尚未有關(guān)于各產(chǎn)地脫脂乳木果仁的總酚含量及相關(guān)藥理活性的研究報道，故本實驗測定了26個不同產(chǎn)地脫脂乳木果仁的總酚含量及抗氧化、細胞毒和EBV-EA抑制等生物活性，并探討了TPC與抗氧化、細胞毒和EBV-EA抑制活性間的相關(guān)性，為其藥用潛力的進一步開發(fā)提供參考。

1 材 料

1.1 試藥與試劑

乳木果樣品由世界農(nóng)林研究中心(ICRAF)的Eliot T.Masters博士于2006年5月至7月間在非洲7個國家26個地區(qū)的成熟乳油木樹上收集并鑒定，其中科特迪瓦產(chǎn)地1個樣品(S1)、加納產(chǎn)地1個樣品(S2)、尼日利亞產(chǎn)地11個樣品(S3～S13)、喀麥隆產(chǎn)地2個樣品(S14～S15)、乍得產(chǎn)地8個樣品(S16～S23)、蘇丹產(chǎn)地2個樣品(S24～S25)、烏干達產(chǎn)地1個樣品(S26)；福林試劑、氯化鐵、過硫化鉀(K2S2O8)(上海阿拉丁有限公司)；6-羥基-2,5,7,8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸(Trolox)、DPPH、ABTS、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)(上海源葉生物科技有限公司)；12-O-十四酰基佛波醇-13-乙酸酯(TPA)(美國ChemSyn實驗室)；正丁酸(日本Nacalai Tesque公司)；順鉑(Cisplatin)(日本W(wǎng)ako Pure化學試劑公司)；MTT(日本西格瑪奧德里奇公司)；96孔板、75 cm2細胞培養(yǎng)瓶、胎牛血清(FBS)、鼻咽癌患者的陽性血清、辣根過氧化物酶、羊抗人免疫球蛋白A抗體、RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Invitrogen公司)；細胞培養(yǎng)瓶(美國BD公司)；所有其他的試藥與試劑均為分析純(南京化學試劑公司)。

1.2 儀 器

CAX-370型離心機(日本Tomy Seiko公司)；RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；BS124S型分析天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)；JM-A5002型電子天平(諸暨超澤衡器設備有限公司)；酶標儀(美國BioTek公司)；XD-202型倒置顯微鏡(南京江南永新光學有限公司)。

1.3 細胞株

人白血病細胞HL60、肺腫瘤細胞A549、乳腺腫瘤細胞SK-BR-3和淋巴瘤細胞Raji購自日本Riken細胞庫。細胞均在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其中HL60，SK-BR-3和Raji細胞在含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中生長；A549細胞在含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中生長。細胞實驗操作在生物安全柜中進行。

2 方 法

2.1 樣品制備

各產(chǎn)地(圖1[8])脫脂乳木果仁(5.0 g)用甲醇100 mL 60 ℃加熱回流提取3次，每次3 h。合并提取液用離心機以5 000 r/min離心10 min，取上清液減壓濃縮，得到不同產(chǎn)地脫脂乳木果仁甲醇浸膏。

Figure1 Map of Africa showing the sites (·) of twenty-six defattedVitellariaparadoxakernels

2.2 總酚含量測定

總酚含量測定采用福林-西奧卡特(Folin-Ciocalteu)法，沒食子酸(GAE)作標準品[9-10]。

照“2.1”項下樣品制備方法，取各產(chǎn)地脫脂乳木果仁提取物浸膏，甲醇重新溶解后，用0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，干燥，精密稱定，均配制成10 mg/mL 樣品溶液。準確移取樣品溶液0.1 mL，加入Folin-Ciocalteu試劑1 mL混合。5 min后，加入碳酸鈉溶液(0.29 g/mL)2 mL，蒸餾水定容至10 mL。室溫、避光處放置1 h，在760 nm處測得吸收度。沒食子酸標準品用甲醇溶解，配成0.05 mg/mL的標準溶液，準確量取上述標準液0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL，照樣品測定方法，以沒食子酸濃度為橫坐標，吸收度為縱坐標，繪制標準曲線，樣品干浸膏的總酚含量以沒食子酸計(mg/g)，每次3組平行實驗。

2.3 抗氧化活性測定

2.3.1 DPPH自由基清除實驗[11]照“2.2項”下樣品溶液配制方法，各產(chǎn)地脫脂乳木果仁提取物均用無水乙醇溶劑配成50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL的樣品溶液(根據(jù)不同樣品測定結(jié)果可上調(diào)樣品溶液質(zhì)量濃度至200、100 μg/mL；或下調(diào)樣品溶液濃度至1.56、0.78 μg/mL)；15 mmol/L DPPH溶液0.2 mL與空白溶劑0.8 mL混合后，初始吸收度(A)在0.8～1.0處最佳。實驗中，將不同濃度的樣品溶液0.8 mL加至15 mmol/L DPPH溶液0.2 mL中，反應混合液于25 ℃、避光處放置30 min，轉(zhuǎn)移至比色皿內(nèi)，于酶標儀517 nm處測定其吸收度。每次3組平行實驗，抗氧化活性測定結(jié)果以半數(shù)抑制濃度(IC50)表示，以水溶性維生素E(Trolox)作為對照品。清除率(%)=(Acontrol-Asample)/(Acontrol-Ablank)×100。

2.3.2 ABTS自由基清除實驗[12]ABTS工作母液配制：將ABTS(7.0 mmol/L)與K2S2O8(2.45 mmol/L)溶液等體積混合，配制成ABTS工作母液；母液在室溫、避光處放置16 h，工作母液稀釋后，在734 nm處的初始吸收度為0.7±0.05時使用。

照“2.2項”下樣品溶液配制方法，各產(chǎn)地脫脂乳木果仁提取物均用pH 7.4的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)配成200 μg/mL的樣品溶液。于96孔板中將樣品溶液10 μL加至ABTS工作液200 μL中，30 min后在734 nm處測定其吸收度。Trolox標準品用PBS溶解，配成625、312.5、156.25、78.125、39.062 5 μmol/L不同濃度標準溶液，照樣品測定方法，以Trolox濃度為橫坐標，清除率為縱坐標，繪制標準曲線，每次3組平行實驗計算樣品的ABTS清除率，抗氧化活性測定結(jié)果以Trolox計(mmol/g)。計算公式同“2.3.1”項。

2.3.3 鐵離子還原法(FRAP)[13]FRAP工作母液配制：將TPTZ(10 mmol/L)、FeCl3(2 mmol/L)溶液和醋酸鹽緩沖液(pH 3.6)以10∶1∶1的體積比混合，配成FRAP工作液，在室溫、避光處放置，現(xiàn)配現(xiàn)用。

照“2.2項”下樣品溶液配制方法，各產(chǎn)地脫脂乳木果仁提取物均用pH 7.4的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)配成500 μg/mL的樣品溶液。于96孔板中將樣品溶液5 μL加至工作液180 μL中，30 min 后在593 nm處測定其吸收度。Trolox標準品用PBS溶解，配成1 250、625、312.5、156.25、78.125 μmol/L不同濃度標準溶液，照樣品測定方法，以Trolox濃度為橫坐標，吸收度為縱坐標，繪制標準曲線，每次3組平行實驗計算樣品的抗氧化能力，抗氧化活性測定結(jié)果以Trolox計(mmol/g)。

2.4 細胞毒活性測定

細胞毒活性評價采用MTT法[14]。細胞HL60，A549和SK-BR-3以每孔3×103個細胞的密度接種在含10% FBS及雙抗培養(yǎng)基100 μL的96孔板中，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待70%～80%細胞貼壁后棄掉培養(yǎng)基，并設置空白組、樣品組和陽性對照組。其中，空白組只加入純培養(yǎng)基100 μL；樣品組則加入樣品質(zhì)量濃度分別為200、100、50、25、12.5 μg/mL的含藥培養(yǎng)基100 μL(根據(jù)不同樣品測定結(jié)果可上調(diào)樣品溶液質(zhì)量濃度至400 μg/mL；或下調(diào)樣品溶液質(zhì)量濃度至6.25、3.125 μg/mL)；陽性對照組加入含陽性藥Cisplatin的培養(yǎng)基100 μL，質(zhì)量濃度分別為20、10、5、2.5、1.25 μg/mL(根據(jù)不同細胞測定結(jié)果可下調(diào)樣品溶液質(zhì)量濃度至0.625、0.312 5 μg/mL)，每組均設置3個平行孔。于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后棄掉培養(yǎng)基，避光條件下加入5 mg/mL MTT溶液15 μL，繼續(xù)避光孵育3 h后，棄掉每孔溶液，加入DMSO 100 μL，于570 nm下測量吸收度。細胞存活率(%)=(Asample/Ablank)×100。

2.5 EBV-EA抑制活性測定

使用Raji細胞測定樣品對EBV-EA的抑制作用[15-16]，細胞在含10% FBS及雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基的75 cm2細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將指數(shù)生長期的Raji細胞，調(diào)整細胞密度約為每毫升1×106個細胞，取l mL置于試管中，并設置空白組、樣品組和陽性對照組。其中，空白組只加入純培養(yǎng)基1 mL；樣品組則加入含4 mmol/L正丁酸、32 mmol/L TPA和不同濃度待測樣品(100、10和1 μg/mL)的培養(yǎng)基1 mL；陽性對照組為加入含4 mmol/L正丁酸、32 mmol/L TPA的培養(yǎng)基1 mL。培養(yǎng)48 h后，細胞懸浮液進行離心(1 000 r/min，離心10 min)，除去上清液，收獲細胞，使用間接免疫酶法檢測Raji細胞中的EBV-EA的表達情況，每次3組平行實驗。

間接免疫酶法具體實驗步驟：①收獲細胞時，利用殘存培養(yǎng)液，制成濃稠的細胞懸液；②取1滴細胞懸液均勻涂布載玻片小圓穴內(nèi)，制成細胞涂片，晾干；隨后將涂片用冷丙酮在4 ℃冰箱固定，晾干；用PBS洗3次，再次晾干；③滴加鼻咽癌患者的陽性血清(一抗)于小孔內(nèi)，放入濕盒，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育40 min，取出，PBS洗3次，晾干；滴加辣根過氧化物酶標記的羊抗人免疫球蛋白A抗體(二抗)，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育40 min，取出，PBS洗3次，晾干；④將涂片放入酶染色底物溶液中顯色，避光8～10 min，取出涂片，蒸餾水洗1次，晾干，于倒置顯微鏡下計數(shù)500個細胞中陽性細胞數(shù)，計算陽性細胞率。陽性細胞率采用卡方檢驗，進而計算出相應的抑制率。

2.6 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)計算與分析由SPSS 19.0軟件完成；組間差異性比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)中的Tukey算法，P<0.05即表示有統(tǒng)計學意義差異。相關(guān)性分析評價采用皮爾森相關(guān)系數(shù)值(Pearson Correlation)。

3 結(jié)果與討論

3.1 總酚含量

如表1所示，各產(chǎn)地脫脂乳木果仁均總酚含量平均值為107.6 mg/g(以沒食子酸計)，其中尼日利亞產(chǎn)地的S12樣品具有最高的總酚含量(265.7 mg/g)，S13樣品具有最低的總酚含量(25.8 mg/g),且差異性分析結(jié)果顯示，各產(chǎn)地脫脂乳木果仁總酚含量有顯著性差異性(P<0.05)?；诜宇愇镔|(zhì)具有較多良好的生物活性[7]，下文將討論總酚含量與抗氧化 (DPPH、ABTS和FRAP)、細胞毒和EBV-EA抑制等活性之間的相關(guān)關(guān)系。

3.2 抗氧化活性

如表1所示，各產(chǎn)地脫脂乳木果仁甲醇提取物均表現(xiàn)出不同程度的抗氧化活性(DPPH:IC503.4～54.9 μg/mL，ABTS:0.17～4.09 mmol/g，F(xiàn)RAP:0.11～1.93 mmol/g，以Trolox計)。其中，樣品S4，S5，S8，S9，S12和S19表現(xiàn)出較高的DPPH 自由基清除活性(IC503.4～9.9 μg/mL)，較對照品Trolox(IC506.9 μg/mL)具有更強或幾乎相等的抗氧化活性；同時，這6個樣品在ABTS和FRAP方法測定下也具有較強的抗氧化活性，抗氧化范圍分別為2.07～4.09 mmol/g和0.60～1.93 mmol/g。結(jié)合課題組前期對脫脂乳木果仁甲醇提取物主要單體化合物的活性研究[6]發(fā)現(xiàn)，沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、槲皮素和蘆丁等化合物具有顯著的抗氧化活性，因此，脫脂乳木果仁中的酚類成分(黃酮和酚酸)是抗氧化的主要活性成分。

SourceSampleLongitudeAltitudeElevation/mTPC/(mg/g)Antioxidant activityDPPH/(IC50,μg/mL)ABTS/(mmol/g)FRAP/(mmol/g)C^ote d'Ivo-ireS1W 7°12'58″N 10°1'35″45372.7±4.719.1±1.42.11±0.020.25±0.00 GhanaS2W 0°29'27″N 6°47'11″145132.8±7.610.0±1.82.18±0.020.52±0.03NigeriaS3E 4°28'48″N 11°35'3″28065.8±2.817.3±1.32.21±0.090.68±0.03S4E 5°18'7″N 10°58'9″337247.0±4.57.6±0.23.42±0.281.24±0.07S5E 6°13'52″N 10°10'22″347210.9±5.99.6±0.92.45±0.060.69±0.03S6E 6°44'43″N 9°5'50″242106.5±7.012.8±1.31.65±0.060.48±0.00S7E 6°54'45″N 8°35'4″173110.9±4.212.4±1.91.70±0.040.52±0.00S8E 6°56'35″N 10°38'44″683216.9±6.99.7±0.32.36±0.010.60±0.00S9E 7°27'9″N 9°40'53″365186.4±6.26.8±0.82.07±0.111.32±0.00S10E 8°58'54″N 8°38'34″16065.8±2.823.1±0.91.52±0.030.20±0.01S11E 11°34'36″N 9°9'16″313101.4±6.311.1±2.41.94±0.060.50±0.02S12E 12°29'6″N 9°19'15″245265.7±6.93.4±0.74.09±0.061.93±0.01S13E 12°52'13″N 9°33'36″26725.8±2.454.9±2.80.17±0.010.11±0.00CameroonS14E 10°28'49″N 5°12'55″142177.4±6.212.9±1.11.45±0.030.48±0.02S15E 11°2'56″N 5°50'12″98829.5±2.144.3±4.00.27±0.020.11±0.01ChadS16E 14°19'34″N 9°36'30″31465.8±5.820.4±2.21.45±0.040.22±0.01S17E 15°29'30″N 9°35'54″36342.9±3.834.8±2.10.65±0.030.13±0.01S18E 15°38'17″N 9°19'41″40053.6±5.224.7±0.31.40±0.090.36±0.01S19E 16°9'17″N 8°31'25″468212.3±6.69.9±1.42.22±0.020.61±0.00S20E 16°21'12″N 9°22'45″36646.9±4.533.5±1.70.90±0.030.11±0.01S21E 17°4'44″N 8°38'16″39081.3±4.218.9±3.12.14±0.130.17±0.01S22E 17°26'45″N 9°1'12″38746.4±3.532.3±0.41.11±0.040.12±0.01S23E 18°2'19″N 9°3'56″418109.5±5.610.3±0.82.03±0.120.50±0.05SudanS24E 28°26'55″N 7°17'19″47392.8±5.611.8±2.62.35±0.170.43±0.01S25E 30°31'27″N 6°34'57″47172.7±4.722.2±2.61.48±0.040.21±0.01UgandaS26E 33°40'59″N 2°21'0″120357.7±5.424.5±1.81.50±0.030.45±0.02Troloxa6.9±0.2Mean107.6

aReference compound.TPC:Total phenolic contents；DPPH:1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl；ABTS:2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid；FRAP:Radical scavenging activity and ferric-reducing antioxidant power

3.3 細胞毒活性

如表2所示，S1～S3，S5，S9，S10～S12，S15～S18和S22～S26等17個脫脂乳木果仁樣品對HL60，A549和SK-BR-3中的一種或多種細胞表現(xiàn)出一定的細胞毒性，IC50范圍在25.1～95.5 μg/mL，其中S11和S26 2個樣品對實驗中3種細胞均表現(xiàn)出細胞毒性，IC50在41.2～92.0 μg/mL范圍間。因此，樣品S11和S26提取物具有作為潛在抗腫瘤劑價值。結(jié)合課題組前期研究[6]發(fā)現(xiàn)，Tieghemelin A、Butyroside D、Arginine C、3-O-β-D-葡萄糖醛酸基-16α-羥基原椴樹酸、3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-16α-羥基原椴樹酸、椴樹酸、原椴樹酸、3-O-β-D-葡萄糖醛酸基椴樹酸和3β-(β-D-甲基葡萄糖醛酸基-2β,6β,23-三羥基-5,12-二烯-28-齊墩果酸等化合物對上述細胞中的一種或多種具有較為顯著的細胞毒性，因此，脫脂乳木果仁中的三萜類成分是產(chǎn)生細胞毒的主要活性成分。

3.4 EBV-EA抑制活性

如表3所示，所有提取物質(zhì)量濃度在100 μg/mL(提取物與TPA的重量比5 000∶1)時，可觀察到Raji細胞均有較好的存活率(50%以上)，提取物質(zhì)量濃度在10和1 μg/mL時存活率幾近100%，表明所有提取物對Raji細胞表現(xiàn)出較低的細胞毒性；同時，提取物質(zhì)量濃度在100 μg/mL時均對EBV-EA具有顯著的抑制作用(85.8%～94.9%)。其中，S3，S7，S15，S17，S19和S21～S23等7個樣品即使在1 μg/mL質(zhì)量濃度下也表現(xiàn)出一定程度的抑制效果(1.4%～7.0%)。目前已有報道，對EBV-EA的抑制作用與體內(nèi)抑制促腫瘤過程相關(guān)[17]，因此，上述7種脫脂乳木果仁提取物具有作為促腫瘤抑制劑的潛力。結(jié)合課題組前期研究[6]發(fā)現(xiàn)，椴樹酸、原椴樹酸、3-O-β-D-葡萄糖醛酸基椴樹酸、3-O-β-D-葡萄糖醛酸基原椴樹酸、3-O-β-D-葡萄糖醛酸基-16α-羥基原椴樹酸、3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-16α-羥基原椴樹酸、3β[(β-D-甲基葡萄糖醛酸基]-2β,6β,16α,23-四羥基-12-烯-28-齊墩果酸、3β[(β-D-甲基葡萄糖醛酸基]-2β,6β,23-三羥基-5,12-二烯-28-齊墩果酸、Mi-glycoside I、兒茶素、表兒茶素和槲皮素等化合物具有顯著的EBV-EA抑制活性，因此，脫脂乳木果仁中的三萜和黃酮類成分是EBV-EA抑制的主要活性成分。

SampleCytotoxic activity/IC50(μg/mL)HL60A549SK-BR-3S175.2±3.3>100>100S290.9±7.4>100>100S372.2±3.6>100>100S4>100>100>100S588.7±3.9>100>100S6>100>100>100S7>100>100>100S8>100>100>100S976.6±6.2 IC50>100>100S10>100>10053.9±1.2S1168.3±4.777.8±7.292.0±6.8S1240.3±5.6>10093.2±7.9S13>100>100>100S14>100>100>100S15>10050.7±5.286.6±1.3S1653.8±6.5>100>100S1771.7±7.0>100>100S1825.1±4.0>10095.5±6.5S19>100>100>100S20>100>100>100S21>100>100>100S2294.9±3.9>100>100S2337.6±3.4>100>100S2473.6±3.4>10051.1±6.6S2566.6±6.1>10073.3±3.21S2642.2±4.279.7±2.441.2±5.0Cisplatin1.3±0.35.5±2.45.6±2.0

SampleInhibition to EBV-EA activation100101 μg/mLS111.5±0.6(>50)56.8±1.7100.0±0.5S213.2±0.7(>50)60.3±1.7100.0±0.4S39.0±0.5(>50)51.3±1.998.4±0.6S410.8±0.5(>50)55.3±1.8100.0±0.5S512.6±0.6(>50)59.7±1.7100.0±0.4S610.4±0.6(>50)55.2±1.8100.0±0.5S76.6±0.4(>50)46.8±1.995.1±0.7S812.5±0.7(>50)60.2±1.7100.0±0.4

(Continued)

SampleInhibition to EBV-EA activation100101 μg/mLS96.9±0.4(>50)58.6±2.2100.0±0.5S1013.8±0.6(>50)61.5±1.7100.0±0.4S1112.5±0.6(>50)58.4±1.7100.0±0.4S129.3±0.5(>50)53.0±1.7100.0±0.5S1313.2±0.6(>50)58.6±1.6100.0±0.4S1411.5±0.6(>50)57.8±1.5100.0±0.5S157.5±0.5(>50)48.4±1.994.1±0.6S169.6±0.6(>50)52.7±1.7100.0±0.5S178.6±0.6(>50)50.4±1.896.3±0.5S188.0±0.5(>50)50.0±1.9100.0±0.5S195.1±0.4(>50)44.1±1.993.0±0.7S2010.5±0.6(>50)54.6±1.7100.0±0.5S217.8±0.5(>50)45.7±1.998.6±0.5S227.2±0.5(>50)45.2±1.898.0±0.5S236.8±0.5(>50)44.5±1.995.7±0.6S2413.9±0.7(>50)59.3±1.6100.0±0.4S2514.2±0.7(>50)60.7±1.5100.0±0.4S2610.7±0.6(>50)55.3±1.7100.0±0.5

3.5 相關(guān)性分析

如表4所示，TPC與DPPH自由基清除活性有顯著的負相關(guān)關(guān)系(r=-0.750，P<0.01)、與ABTS自由基清除活性有顯著的正相關(guān)關(guān)系(r=0.837，P<0.01)、與FRAP有顯著的正相關(guān)關(guān)系(r=0.833，P<0.01)，表明提取物的抗氧化活性主要來源于其中的酚類物質(zhì)，與其他學者報道的一致[18-19]。而TPC與EBV-EA(100 μg/mL)的抑制作用無相關(guān)性(r=-0.059，P>0.05)，表明提取物中的酚類物質(zhì)不是產(chǎn)生EBV-EA抑制作用的主要活性成分。基于提取物中酚類成分對HL60，A549，SK-BR-3和10、1 μg/mL質(zhì)量濃度下的EBV-EA抑制無明顯的生物活性，本文未討論TPC與它們間的相關(guān)關(guān)系。

4 討 論

乳木果在非洲當?shù)刭Y源豐富，屬重要的“藥食同源”植物，生活中被廣泛使用。研究已發(fā)現(xiàn)[6，20]，它具有較多良好的生物活性，如：抗炎、抗氧化等，并應用于抗炎抗敏功效的藥妝品中。本文首次研究了亞撒哈拉非洲地區(qū)26個不同產(chǎn)地脫脂乳木果仁的TPC及抗氧化、細胞毒和EBV-EA抑制活性。實驗結(jié)果顯示，來自于亞撒哈拉非洲26個不同產(chǎn)地的脫脂乳木果仁甲醇提取物的TPC、抗氧化活性、細胞毒性和EBV-EA抑制活性各有不同，其中的部分產(chǎn)地提取物或表現(xiàn)出較強的抗氧化活性，或表現(xiàn)出較強的對人腫瘤細胞增殖的抑制活性，或表現(xiàn)出較強的EBV-EA抑制活性，表明植物生長的地理環(huán)境(包括不同經(jīng)度、緯度和海拔等)因素對植物的化學成分種類與含量有著一定的影響，進而造成其TPC與生物活性的差異。

Table4 Pearson′s correlation coefficients (r) between TPC and antioxidant (DPPH，ABTS，F(xiàn)RAP) and EBV-EA activation inhibitory activities (100 μg/mL)

ParameterTPCDPPHABTSFRAPEBV-EA(100 μg/mL)TPC1DPPH-0.750**1ABTS0.837**-0.853**1FRAP0.833**-0.670**0.816**1EBV-EA (100 μg/mL)-0.0590.0250.035-0.1341

**P<0.01

此外，由于植物成分多而復雜，且成分間的協(xié)同作用難以說明，所以有必要對脫脂乳木果仁化學成分進行更加全面、系統(tǒng)的研究，并對細胞毒和EBV-EA抑制活性的作用機制作深入探討；基于不同產(chǎn)地來源脫脂乳木果仁化學成分與生物活性上的不同，可采用化學計量學等方法比較其質(zhì)量差異，有利于建立可靠的質(zhì)量控制方法，為脫脂乳木果仁質(zhì)量標準制定提供重要的依據(jù)。工業(yè)生產(chǎn)中的脫脂乳木果仁除了作為燃料外，常常被當作工業(yè)廢料丟棄，結(jié)合本研究結(jié)果，生物活性較好的脫脂乳木果仁具有作為抗氧化劑、抗腫瘤劑和腫瘤化學預防劑的潛力，可為脫脂乳木果仁廢棄資源在功能性食品和藥用方面的開發(fā)奠定研究基礎。