劉 顏，李承業(yè)，蔡星光，孫李丹，黃文龍

(1重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400016；2中國藥科大學(xué)新藥研究中心，南京 210009；3嘉興學(xué)院，嘉興 314000)

糖尿病是一種由胰島素分泌缺陷和/或胰島素功能障礙所導(dǎo)致的慢性代謝性疾病，主要表現(xiàn)為高血糖[1-2]。長期代謝紊亂可導(dǎo)致腎、眼、神經(jīng)系統(tǒng)及心血管等各個組織器官出現(xiàn)功能障礙和衰竭[3-4]。國際糖尿病聯(lián)盟報告表明，糖尿病已成為危害人類健康的嚴(yán)重疾病之一[5]。

胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是一種內(nèi)源性腸促胰島素激素[6]，在體內(nèi)發(fā)揮促進胰島素釋放、抑制胰高血糖素釋放、抑制食欲和延緩胃排空等功能，還有減輕體重的效果[7]。而且其促胰島素釋放作用和抑制胰高血糖素釋放作用具有血糖依賴性，因此，其低血糖風(fēng)險大大降低[8-9]。但是，內(nèi)源性GLP-1在血漿中會被二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase-4，DPP-4)等酶代謝失活，并且會被腎小球快速濾過清除，其體內(nèi)半衰期只有2～3 min[10]。近年，研究人員對GLP-1的性質(zhì)進行研究并開發(fā)了長效化GLP-1受體激動劑。已上市或進入臨床研究的長效化GLP-1受體激動劑有艾塞那肽(Ex-4)、利西拉來(Lixisenatide)、利拉魯肽(Liraglutide)、索瑪魯肽等(Semaglutide)。GLP-1受體激動劑同時具有穩(wěn)定血糖、減輕體重的效果，成為糖尿病研究的熱點[11]。

聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)是最常用的一種修飾劑，其毒性小、無抗原性、具有良好的兩親性和生物相容性，目前已獲FDA認(rèn)可。PEG化具有以下優(yōu)點：增加溶解度、降低或消除免疫原性、減小水解酶降解的可能性、降低腎臟清除速率、改變藥物體內(nèi)分布和動力學(xué)參數(shù)、提高穩(wěn)定性等。早期研究一般將相對分子質(zhì)量較大的PEG綴合至多肽鏈來實現(xiàn)長效化[12-14]，但相對分子質(zhì)量過大會阻礙多肽與受體的相互作用，引起生物活性的直線下降[15]。因此，選擇合適相對分子質(zhì)量的PEG具有十分重要的意義。目前，修飾GLP-1多肽的PEG的相對分子質(zhì)量均在2 000以上，低于1 000的PEG綴合鮮有報道。因此，本研究選用平均相對分子質(zhì)量分別為350、550和750的單甲氧基聚乙二醇(mPEG)，進行長效化GLP-1受體激動劑的設(shè)計與合成。

在前期工作中，本課題組設(shè)計并合成了一系列半胱氨酸替換的GLP-1類似物并對其進行小鼠體內(nèi)降糖活性篩選，結(jié)果表明，Cys17-Gly8-GLP-1(7-36)-NH2、Cys26-Gly8-GLP-1(7-36)-NH2、Cys34-Gly8-GLP-1(7-36)-NH2和Cys37-Gly8-GLP-1(7-37)-NH2這4個GLP-1類似物的活性較好[16]。因此將這4條肽鏈作為化學(xué)修飾的母肽鏈，通過馬來酰亞胺連接臂與不同相對分子質(zhì)量的mPEG進行交聯(lián)，設(shè)計并合成了12個衍生物，結(jié)構(gòu)如圖1所示。

Figure1 Structures of PEGylation GLP-1 receptor agonistsI-1-I-12

1 合成路線設(shè)計

1.1 多肽合成路線設(shè)計

采用Rink樹脂作為固相載體，合成C末端為酰胺鍵的肽鏈，合成路線見路線1。其余衍生物的合成路線與其類似并采用相應(yīng)的氨基酸進行耦合反應(yīng)。

1.2 PEG綴合連接臂和綴合多肽的合成路線設(shè)計

3個不同長度的單甲基化PEG通過Gabriel合成法將一端的羥基變成氨基，接著與馬來酰亞胺反應(yīng)得到相應(yīng)的馬來酰亞胺PEG小分子，再與半胱氨酸改構(gòu)的GLP-1類似物綴合得到目標(biāo)產(chǎn)物。小分子合成路線如路線2所示，短鏈PEG-多肽綴合物的合成路線如路線3所示。

Scheme1 Synthetic route of Gly8-Cys17-GLP-1(7-36)-NH2on Fmoc-Rink Amide-MBHA Resin

Scheme2 Synthetic route of mPEG-maleimide (mPEG-MAL)

Scheme3 General synthetic route of PEG GLP-1 conjugates

2 實驗部分

2.1 試劑、儀器及動物

mPEG(平均相對分子質(zhì)量為350、550和750,美國Fluka-aldrich公司)；制備級甲醇(美國Tedia公司)；色譜純?nèi)姿?上海阿拉丁試劑公司)；其余試劑均為市售分析純。

RY-1熔點儀(天津市新天光分析儀器技術(shù)有限公司)；Bruker-ACF-300核磁共振儀(瑞士Bruker公司)；C18反相柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，UPLC H-Class-TQD液質(zhì)聯(lián)用儀(美國Waters公司)；TM型血糖監(jiān)測儀和血糖試紙(長沙三諾生物傳感有限公司)；C18反相制備柱(340 mm×28 mm，5 μm)，6A制備型反相高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)。

昆明種小鼠，雌雄各半，質(zhì)量20～30 g，由上海杰思捷實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK(滬)2012-0006。所有動物實驗均符合動物倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 多肽合成

2.2.1 樹脂溶脹 稱取Fmoc-Rink Amide-MBHA Resin(0.182 g，0.1 mmol，取代度0.55 mmol/g)，二氯甲烷溶脹30 min后，分別用甲醇和二氯甲烷沖洗干凈。

2.2.2 9-笏甲氧羰基(Fmoc)的脫除 向含有樹脂的反應(yīng)管中加入0.1 mol/L HOBt的25%哌啶-DMF溶液7 mL，微波加熱反應(yīng)5min，脫保護完成后，用DMF 7 mL清洗樹脂4次。

2.2.3 Fmoc保護的氨基酸的耦合 按肽序?qū)⑾鄳?yīng)氨基酸(0.5 mmol)、HOBt(81 mg，0.6 mmol)、HBTU(227.5 mg，0.6 mmol)和DIPEA(0.175 mL 1.2 mmol)溶于N-甲基吡咯烷酮(NMP)10 mL，加入盛有樹脂的反應(yīng)管中，氮氣鼓泡，微波加熱15 min。耦合完成后，用DMF 7 mL清洗樹脂4次。

2.2.4 目標(biāo)肽序的延長 根據(jù)目標(biāo)多肽的氨基酸序列，重復(fù)上述的脫保護和耦合步驟，依次耦合相應(yīng)的氨基酸，直到多肽鏈耦合完畢，獲得綴有多肽鏈的樹脂。

2.2.5 多肽的切割 將綴有多肽鏈的樹脂置于多肽反應(yīng)器中，加入切割劑Reagent K(TFA-苯甲硫醚-水-苯酚-乙二硫醇82.5∶5∶5∶5∶2.5)，4 ℃振蕩1 h后，常溫振蕩3 h，抽濾，收集濾液。將濾液加入5倍體積量的冰乙醚析出白色固體，冷凍離心得到相應(yīng)的多肽粗品。

2.2.6 多肽的純化 將待檢測多肽用50%乙腈水溶液溶解，配制成10 mg/mL的溶液，采用制備液相進行多肽的純化。按以下色譜條件進行純化，色譜柱：C18反相制備柱(340 mm×28 mm，5 μm)；流動相A：0.1%三氟醋酸水溶液，流動相B：0.1%三氟醋酸乙腈溶液；波長：214 nm；流速：5 mL/min。根據(jù)不同多肽性質(zhì)選擇不同線性梯度洗脫方法，如B 30%～90% 0～30 min。

2.3 PEG綴合連接臂合成

2.3.1 單甲氧基聚乙二醇對甲苯磺酸酯(mPEG-OTs)的合成 將平均相對分子質(zhì)量為350的mPEG-OH 3.50 g(10 mmol)和三乙胺4 mL溶于二氯甲烷30 mL中，在冰浴條件下用恒壓滴液漏斗向反應(yīng)瓶中緩慢滴對甲苯磺酰氯7.60 g(40 mmol)的二氯甲烷20 mL溶液，滴加完畢后，恢復(fù)至室溫并攪拌反應(yīng)6 h，待反應(yīng)完全后，減壓蒸除溶劑，粗品柱色譜分離得純品(甲醇-二氯甲烷)，最終得mPEG-OTs 4.55 g，產(chǎn)率為90.9%。1H NMR(DMSO-d6,300 MHz)δ:7.49(2H,d,J=8.1 Hz,Ar-H),7.13(2H,d,J=8.1 Hz,Ar-H),4.13(2H,t,J=5.0 Hz,-CH2OTs),3.50(multi H,s,backbone -CH2CH2O-),3.06(3H,s,-OCH3),2.29(3H,s,Ar-CH3)。ESI-MS(m/z):561.4(n=8,[M+H]+)，605.3(n=9,[M+H]+)，649.3(n=10,[M+H]+)，693.3(n=11,[M+H]+)。

平均相對分子質(zhì)量為550的mPEG-OH 5.50 g按照上述方法，以相同比例和條件進行投料反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后濃縮得到粗品經(jīng)過柱色譜后，得到產(chǎn)物6.62 g，產(chǎn)率94.4%。1H NMR(DMSO-d6,300 MHz)δ:7.49(2H,d,J=8.1 Hz,Ar-H),7.13(2H,d,J=8.1 Hz,Ar-H),4.13(2H,t,J=5.0 Hz,-CH2OTs),3.50(multi H,s,backbone -CH2CH2O-),3.01(3H,s,-OCH3),2.29(3H,s,Ar-CH3)。ESI-MS(m/z):716.3(n=12,[M+H]+)，760.4(n=13,[M+H]+)，803.4(n=14,[M+H]+)，847.5(n=15,[M+H]+)。

平均相對分子質(zhì)量為750的mPEG-OH 7.50 g按照上述方法，以相同比例和條件進行投料反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后濃縮得到粗品經(jīng)過柱色譜后，得到產(chǎn)物8.11g，產(chǎn)率89.9%。1H NMR(DMSO-d6,300 MHz)δ:7.49(2H,d,J=8.1 Hz,Ar-H),7.13(2H,d,J=8.1 Hz,Ar-H),4.13(2H,t,J=5.0 Hz,-CH2OTs),3.50(multi H,s,backbone -CH2CH2O-),3.01(3H,s,-OCH3),2.29(3H,s,Ar-CH3)。ESI-MS(m/z):869.0(n=15,[M+H]+)，913.0(n=16,[M+H]+)，957.2(n=17,[M+H]+)，1 001.2(n=18,[M+H]+)。

2.3.2 單甲氧基聚乙二醇鄰苯二甲酰胺(mPEG-phthalimide)的合成 將mPEG350-OTs 3.01 g和鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽1.10 g溶于DMF 15 mL，氮氣保護下升溫到100 ℃反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸去溶劑得到黃色油狀物，溶于二氯甲烷20 mL中，過濾除去不溶物，蒸除溶劑得粗品，柱色譜分離得純品(甲醇/二氯甲烷)，最終得mPEG-phthalimide 2.20 g，產(chǎn)率為74.3%。1H NMR(DMSO-d6,300 MHz)δ:7.84(4H,m,Ar-H),3.38(multi H,s,backbone -CH2CH2O-),3.21(3H,s,-OCH3)。ESI-MS(m/z):536.4(n=8,[M+H]+)，580.3(n=9,[M+H]+)，624.3(n=10,[M+H]+)，668.4(n=11,[M+H]+)。

mPEG550-OTs 4.70 g按照上述方法，以相同比例和條件進行投料反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后濃縮得到粗品經(jīng)過柱色譜后，得到產(chǎn)物3.69 g，產(chǎn)率79.7%。1H NMR(DMSO-d6,300 MHz)δ:7.84(4H,m,Ar-H),3.5(multi H,s,backbone -CH2CH2O-),3.24(3H,s,-OCH3)。ESI-MS(m/z):690.4(n=12,[M+H]+)，734.5(n=13,[M+H]+)，778.4(n=14,[M+H]+)，822.5(n=15,[M+H]+)。

mPEG750-OTs 6.81 g按照上述方法，以相同比例和條件進行投料反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后濃縮得到粗品經(jīng)過柱色譜后，得到產(chǎn)物4.21 g，產(chǎn)率62.4%。1H NMR(DMSO-d6,300 MHz)δ:7.84(4H,m,Ar-H),3.51(multi H,s,backbone -CH2CH2O-),3.24(3H,s,-OCH3)。ESI-MS(m/z):756.5(n=15,[M+H]+)，800.5(n=16,[M+H]+)，844.3(n=17,[M+H]+)，888.4(n=18,[M+H]+)。

2.3.3 單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺(mPEG-maleic acid)的合成 將mPEG350-phthalimide 2.20 g和80%的水合肼5 mL溶于乙醇15 mL，升溫到80 ℃回流2 h。減壓蒸去溶劑得到mPEG350-NH2粗品1.32 g。將mPEG350-NH2粗品1.32 g和順丁烯二酸酐0.45 g溶于冰醋酸，升溫到120 ℃回流反應(yīng)6 h。減壓蒸去溶劑并經(jīng)柱色譜純化，得到產(chǎn)物0.74g，產(chǎn)率62.3%。1H NMR(DMSO-d6,300 MHz)δ:6.63(2H,s,-CH=CH-),3.56(multi H,s,backbone -CH2CH2-),3.23(3H,s,-OCH3)。ESI-MS(m/z):530.2(n=8,[M+H]+)，574.2(n=9,[M+H]+)，618.3(n=10,[M+H]+)，662.3(n=11,[M+H]+)。

mPEG550-phthalimide 2.77 g按照上述方法，以相同比例和條件進行投料反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后濃縮得到粗品經(jīng)過柱色譜后，得到產(chǎn)物0.95 g，產(chǎn)率60.1%。1H NMR(DMSO-d6,300 MHz)δ:6.63(2H,s,-CH=CH-),3.57(multi H,s,backbone -CH2CH2-),3.23(3H,s,-OCH3)。ESI-MS(m/z):618.3(n=10,[M+H]+)，622.3(n=11,[M+H]+)，706.4(n=12,[M+H]+)，750.4(n=13,[M+H]+)。

mPEG750-phthalimide 4.21 g按照上述方法，以相同比例和條件進行投料反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后濃縮得到粗品經(jīng)過柱色譜后，得到產(chǎn)物1.05 g，產(chǎn)率55.8%。1H NMR(DMSO-d6,300 MHz)δ:6.63(2H,s,-CH=CH-),3.56(multi H,s,backbone -CH2CH2-),3.23(3H,s,-OCH3)。ESI-MS(m/z):706.3(n=12,[M+H]+)，750.3(n=13,[M+H]+)，794.3(n=14,[M+H]+)，828.4(n=15,[M+H]+)。

2.4 PEG-多肽綴合物的合成

將PEG馬來酰亞胺小分子溶于DMSO，配成約10 mg/mL的溶液，將合成的多肽鏈溶解于DMSO，兩溶液混合后，加入DIEPA 20 μL，室溫下攪拌反應(yīng)過夜，液質(zhì)監(jiān)測反應(yīng)情況。色譜條件為：C18反相柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動相A：0.1%甲酸水溶液，流動相B：0.1%甲酸乙腈溶液，流動相梯度：流動相B 10%～90%，2 min，B 90%～90%，3 min；流速為0.3 mL/min；紫外檢測波長為214 nm。反應(yīng)監(jiān)測結(jié)束后，反應(yīng)液使用含有1%三氟乙酸的乙腈溶液稀釋后進入制備液相色譜進行純化，色譜條件為：C18反相柱(340 mm×28 mm，5 μm)；流動相A：0.1%三氟醋酸水溶液，流動相B：0.1%三氟醋酸乙腈溶液；流動相梯度：流動相B 40%～80%，30 min；80%～85%，10 min；85%～95%，10 min；95%～40%，10 min；流速為5 mL/min，檢測波長為214 nm。收集溶液，旋干乙腈，凍干即得純品。所有PEG-多肽綴合物均按上述方法進行綴合和純化。合成的12個目標(biāo)化合物的熔點、外觀和ESI-MS質(zhì)譜數(shù)據(jù)見表1。

Table1 MS data of PEGylation GLP-1 receptor agonistsI-1-I-12

Compd.mp/℃AppearanceESI-MS,m/znMolecular weightCalcd.Found I-1191-195White solid567856783 719.93 763.93 807.93 851.93 719.93 763.93 807.93 851.9[M+3H]3+ 1 240.9[M+3H]3+ 1 258.6[M+3H]3+ 1 270.3[M+3H]3+ 1 285.0[M+4H]4+930.9[M+4H]4+942.0[M+4H]4+952.9[M+4H]4+963.9[M+3H]3+ 1 240.6[M+3H]3+ 1 255.3[M+3H]3+ 1 270.3[M+3H]3+ 1 285.0[M+4H]4+930.8[M+4H]4+941.9[M+4H]4+952.9[M+4H]4+963.8 I-2198-202White solid910111291011123 895.93 939.93 983.94 027.93 895.93 939.93 983.94 027.9[M+3H]3+ 1 299.6[M+3H]3+ 1 314.3[M+3H]3+ 1 328.9[M+3H]3+ 1 343.8[M+4H]4+974.9[M+4H]4+985.9[M+4H]4+996.9[M+4H]4+ 1 007.9[M+3H]3+ 1 299.6[M+3H]3+ 1 314.3[M+3H]3+ 1 328.9[M+3H]3+ 1 343.7[M+4H]4+974.8[M+4H]4+985.7[M+4H]4+996.7[M+4H]4+ 1 008.0 I-3134-140White solid16171819161718194 227.94 271.94 315.94 359.94 226.94 270.94 314.94 358.9[M+4H]4+ 1 058.0[M+4H]4+ 1 068.9[M+4H]4+ 1 080.0[M+4H]4+ 1 090.9[M+5H]5+846.4[M+5H]5+855.2[M+5H]5+863.9[M+5H]5+872.8[M+4H]4+ 1 057.9[M+4H]4+ 1 068.5[M+4H]4+ 1 079.8[M+4H]4+ 1 090.8[M+5H]5+846.2[M+5H]5+855.2[M+5H]5+863.9[M+5H]5+872.7 I-4203-207White solid6789789103 741.83 785.83 829.83 873.83 772.83 816.83 860.83 904.8[M+2H]2+ 1 871.9[M+2H]2+ 1 893.9[M+2H]2+ 1 915.9[M+2H]2+ 1 937.9[M+3H]3+ 1 258.6[M+3H]3+ 1 273.2[M+3H]3+ 1 287.9[M+3H]3+ 1 302.6[M+2H]2+ 1 871.3[M+2H]2+ 1 893.5[M+2H]2+ 1 916.1[M+2H]2+ 1 938.1[M+3H]3+ 1 258.5[M+3H]3+ 1 272.8[M+3H]3+ 1 288.0[M+3H]3+ 1 302.6 I-5212-215White solid89101191011123 832.83 876.83 920.83 964.83 860.83 904.83 948.83 992.8[M+2H]2+ 1 917.4[M+2H]2+ 1 939.4[M+2H]2+ 1 961.4[M+2H]2+ 1 982.4[M+3H]3+ 1 287.9[M+3H]3+ 1 302.6[M+3H]3+ 1 317.2[M+3H]3+ 1 331.9[M+2H]2+ 1 917.1[M+2H]2+ 1 939.1[M+2H]2+ 1 961.9[M+2H]2+ 1 983.0[M+3H]3+ 1 287.9[M+3H]3+ 1 302.4[M+3H]3+ 1 316.5[M+3H]3+ 1 331.9

(Continued)

Compd.mp/℃AppearanceESI-MS,m/znmolecular weightCalcd.Found I-6233-237White solid17181920171819204 230.84 274.84 318.84 362.84 229.84 273.84 317.84 361.8[M+3H]3+ 1 411.3[M+3H]3+ 1 425.9[M+3H]3+ 1 440.6[M+3H]3+ 1 455.3[M+4H]4+ 1 058.4[M+4H]4+ 1 069.4[M+4H]4+ 1 080.4[M+4H]4+ 1 091.4[M+3H]3+ 1 411.8[M+3H]3+ 1 425.5[M+3H]3+ 1 439.6[M+3H]3+ 1 455.3[M+4H]4+ 1 058.4[M+4H]4+ 1 069.3[M+4H]4+ 1 080.6[M+4H]4+ 1 091.7 I-7184-189White solid678956783 741.83 785.83 829.83 873.83 689.83 733.83 777.83 821.8[M+2H]2+ 1 871.5[M+2H]2+ 1 893.9[M+2H]2+ 1 917.9[M+2H]2+ 1 938.7[M+3H]3+ 1 230.9[M+3H]3+ 1 245.6[M+3H]3+ 1 260.3[M+3H]3+ 1 274.9[M+2H]2+ 1 871.5[M+2H]2+ 1 893.4[M+2H]2+ 1 916.9[M+2H]2+ 1 938.3[M+3H]3+ 1 230.8[M+3H]3+ 1 245.5[M+3H]3+ 1 260.0[M+3H]3+ 1 274.0 I-8194-199White solid8910118910113 805.83 849.83 893.83 937.83 791.83 835.83 879.83 923.8[M+2H]2+ 1 903.8[M+2H]2+ 1 925.9[M+2H]2+ 1 947.9[M+2H]2+ 1 969.9[M+3H]3+ 1 264.9[M+3H]3+ 1 279.6[M+3H]3+ 1 294.2[M+3H]3+ 1 308.9[M+2H]2+ 1 903.8[M+2H]2+ 1 925.9[M+2H]2+ 1 947.7[M+2H]2+ 1 970.1[M+3H]3+ 1 264.3[M+3H]3+ 1 279.6[M+3H]3+ 1 294.0[M+3H]3+ 1 308.7 I-9203-207White solid9101112101112133 828.83 872.83 916.83 960.83 870.83 914.83 958.84 002.8[M+2H]2+ 1 915.4[M+2H]2+ 1 937.4[M+2H]2+ 1 959.4[M+2H]2+ 1 981.4[M+3H]3+ 1 291.3[M+3H]3+ 1 305.9[M+3H]3+ 1 320.6[M+3H]3+ 1 335.2[M+2H]2+ 1 915.0[M+2H]2+ 1 937.2[M+2H]2+ 1 958.9[M+2H]2+ 1 981.2[M+3H]3+ 1 291.3[M+3H]3+ 1 305.9[M+3H]3+ 1 320.5[M+3H]3+ 1 335.6 I-10164-166White solid678956783 858.03 902.03 946.03 990.03 825.03 859.03 903.03 947.0[M+3H]3+ 1 287.0[M+3H]3+ 1 301.7[M+3H]3+ 1 316.3[M+3H]3+ 1 331.0[M+4H]4+957.2[M+4H]4+965.8[M+4H]4+976.8[M+4H]4+987.8[M+3H]3+ 1 287.3[M+3H]3+ 1 301.8[M+3H]3+ 1 316.8[M+3H]3+ 1 331.0[M+4H]4+957.3[M+4H]4+965.7[M+4H]4+976.4[M+4H]4+987.9 I-11240-242White solid78910789103 876.03 920.03 964.04 008.03 832.03 876.03 920.03 964.0[M+3H]3+ 1 293.0[M+3H]3+ 1 307.7[M+3H]3+ 1 322.3[M+3H]3+ 1 337.0[M+4H]4+959.0[M+4H]4+970.0[M+4H]4+981.0[M+4H]4+992.0[M+3H]3+ 1 293.6[M+3H]3+ 1 307.6[M+3H]3+ 1 322.6[M+3H]3+ 1 336.7[M+4H]4+958.9[M+4H]4+970.1[M+4H]4+980.9[M+4H]4+991.8 I-12232-236White solid10111213111213144 008.04 052.04 096.04 140.04 074.04 118.04 162.04 206.0[M+4H]4+ 1 003.0[M+4H]4+ 1 014.0[M+4H]4+ 1 025.0[M+4H]4+ 1 036.0[M+5H]5+815.8[M+5H]5+824.6[M+5H]5+833.4[M+5H]5+842.2[M+4H]4+ 1 003.0[M+4H]4+ 1 014.3[M+4H]4+ 1 025.2[M+4H]4+ 1 036.3[M+5H]5+815.8[M+5H]5+824.7[M+5H]5+833.7[M+5H]5+842.3

nrepresents the number of back bone “CH2CH2O” units in a PEG monomer

3 降糖活性評價

3.1 受體激動活性研究

GLP-1衍生物的受體激動活性是其發(fā)揮多種生理作用的前提，因而優(yōu)先對已合成的GLP-1衍生物的受體激動活性進行研究。實驗室前期通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，構(gòu)建了高度表達GLP-1受體的HEK293細(xì)胞[17]，該細(xì)胞株可在GLP-1衍生物的作用下，產(chǎn)生大量cAMP。本研究以Ex-4和Gly8-GLP-1(7-36)-NH2為對照，通過試劑盒測定衍生物刺激細(xì)胞后生成的cAMP量，評估衍生物的受體激動活性。

3.2 正常小鼠單次給藥單次給糖實驗

為了初步評估衍生物的體內(nèi)降糖活性，以Ex-4和Liraglutide組為陽性對照，進行單次給藥單次給糖實驗，即在小鼠給糖前30 min腹腔給藥，檢測從給藥至給糖后2 h期間其血糖變化，評估化合物的降糖活性。

3.3 正常小鼠單次給藥多次給糖實驗

為了進一步探索衍生物的體內(nèi)長效化降糖活性，以Ex-4和Liraglutide組為陽性對照，進行單次給糖后進行多次腹腔糖耐量實驗，每隔3小時腹腔注射葡萄糖并測定給糖后的血糖，一共給糖3次，從而評估衍生物的降糖活性和長效化時間。

4 結(jié)果與討論

4.1 受體激動活性研究

修飾不會導(dǎo)致GLP-1生物活性的喪失。此外，4條母肽鏈進行不同長度的PEG小分子修飾后，隨著PEG相對分子質(zhì)量的增加，衍生物的受體激動活性呈現(xiàn)輕微的下降趨勢，原因可能是PEG側(cè)鏈在一定程度上影響了GLP-1與受體的相互作用。另外，肽鏈C端綴合PEG的衍生物激動活性略優(yōu)于接近N端PEG化衍生物，盡管不同綴合位置對總體受體激動活性影響不大。

Compd. EC50/(pmol/L)Compd. EC50/(pmol/L)Ex-41.8±0.8Gly8-GLP-1(7-36)-NH25.6±0.9* I-15.8±1.3* I-76.3±1.7* I-28.0±1.1* I-88.7±1.2* I-310.8±1.0* I-911.6±1.7* I-47.4±0.9* I-102.4±1.5 I-59.1±1.4* I-116.6±0.8* I-612.6±2.4* I-129.2±1.1*

*P<0.05vsEx-4 group

4.2 正常小鼠單次給藥單次給糖實驗

由圖2可知，給藥后所有衍生物在腹腔糖耐量期間均具有較好的降糖活性，效果與陽性對照藥相當(dāng)。

4.3 正常小鼠單次給藥多次給糖實驗

由圖3可知，給藥后衍生物在第1輪腹腔糖耐量期間均具有較好的降糖活性，效果與陽性對照藥相當(dāng)，第2次給糖后，降糖效果均呈現(xiàn)輕微下降趨勢，但15 min后的血糖均在10 mmol/L以下。在第3次糖耐量期間，各個衍生物的長效化活性呈現(xiàn)明顯差異，其中優(yōu)選化合物I-12降糖活性的下降程度最小，與陽性對照藥Ex-4和Liraglutide相當(dāng)。

5 結(jié) 論

早期研究中綴合GLP-1多肽鏈的PEG的相對分子質(zhì)量均在2 000以上，低于1 000的PEG修飾鮮有報道。本研究選用平均相對分子質(zhì)量為350、550和750的mPEG分別綴合到GLP-1肽鏈上，設(shè)計并合成了12個目標(biāo)化合物，所有化合物的結(jié)構(gòu)和純度經(jīng)質(zhì)譜和液相色譜分析確證。所有多肽鏈均通過微波促進Fmoc/tBu正交保護策略固相方法合成，經(jīng)反相制備高效液相系統(tǒng)純化得到肽鏈純品，PEG側(cè)鏈則通過馬來酰亞胺基團作為連接臂，與肽鏈中的巰基反應(yīng)得到目標(biāo)化合物。本研究對化合物進行初步活性評價，受體激動活性研究結(jié)果表明，大部分衍生物的受體激動活性都得到了保持，說明短鏈PEG修飾不會導(dǎo)致GLP-1生物活性喪失。4條母肽鏈進行不同長度的PEG小分子修飾后，隨著PEG相對分子質(zhì)量的增加，衍生物的受體激動活性呈現(xiàn)輕微的下降趨勢，原因可能是PEG側(cè)鏈在一定程度上影響了GLP-1與受體的相互作用。單次給藥單次給糖實驗表明，所有衍生物均具有較好的降糖活性，效果與陽性對照相當(dāng)。單次給藥多次給糖實驗表明，優(yōu)選化合物I-12的降糖活性維持時間最長，與陽性對照藥Ex-4和Liraglutide相當(dāng)，具有成為GLP-1類似物新藥分子的潛力。將相對分子質(zhì)量較小的PEG結(jié)構(gòu)與修飾過的GLP-1多肽鏈綴合這一思路也為今后GLP-1受體激動劑的長效化設(shè)計與研發(fā)提供方向。