王曉明，梁國棟，王巖，楊玉波，劉峰

吉林省腫瘤醫(yī)院結(jié)直腸胃腹部外科，長春 130012

結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤之一，隨著人們生活水平的提高，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，研究表明結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展受多種基因和分子調(diào)控，其發(fā)病機制仍未完全清楚[1]。因此尋找具有特異性及敏感性的生物標志物具有重要的臨床意義。微小RNA（microRNA，miRNA）是一種大小為21～23個堿基的單鏈小分子RNA，通過對靶向mRNA的降解和翻譯水平的調(diào)控，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著原癌基因和抑癌基因的雙重作用[2-3]。已有研究表明，miRNA-16在某些惡性腫瘤（如前列腺癌、肺癌及慢性淋巴細胞白血病）中均表達下降[4-6]，提示miRNA-16是具有抑癌作用的一類miRNA，然而在結(jié)腸癌中miRNA-16如何發(fā)揮抑癌基因的作用及具體機制尚不明確。本研究分析miRNA-16在結(jié)腸癌組織和正常結(jié)腸組織中的表達情況，并探討miRNA-16在結(jié)腸癌細胞增殖、侵襲、周期和凋亡中的作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2015年12月至2016年12月于吉林省腫瘤醫(yī)院接受結(jié)腸手術(shù)的30例結(jié)腸癌患者的結(jié)腸癌組織、癌旁組織（距腫瘤邊緣2 cm以內(nèi)）及正常結(jié)腸組織標本。30例結(jié)腸癌患者中，男13例，女17例；年齡41～60歲，中位年齡48歲；低分化17例，中高分化13例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例。所有患者術(shù)前均未行化療或放療。

1.2 細胞系和相關(guān)試劑

人結(jié)腸癌細胞系SW480購自北京醫(yī)學(xué)科學(xué)院細胞庫。IMDM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶均購自美國HyClone公司，Cell Culture Insert購自美國Millipore公司，Matrigel膠、膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）試劑盒及細胞周期試劑盒均購自美國BD公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 將SW480細胞置于含10%胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素的IMDM培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中每2～3天傳代一次。

1.3.2 RT-PCR檢測基因表達水平 應(yīng)用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。miRNA-16探針序列為5'-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3'，GAPDH引物序列為5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR）條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，65 ℃退火 15 s，72 ℃延伸 32 s，共30個循環(huán)。應(yīng)用熒光定量PCR儀檢測基因表達，應(yīng)用2－△△Ct法計算目的基因的相對表達量?！鰿t值=目的基因Ct值－內(nèi)參基因Ct值，△△Ct值=轉(zhuǎn)染組△Ct值－對照組△Ct值。將基因產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描電泳結(jié)果。每次實驗平行做5個樣本，實驗重復(fù)3次。

1.3.3 細胞轉(zhuǎn)染 按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染說明書，將miRNA-16特異性過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至對數(shù)生長期的無血清培養(yǎng)的SW480細胞作為轉(zhuǎn)染組，以未轉(zhuǎn)染的細胞作為對照組，4 h后兩組均更換為含體積分數(shù)為20%胎牛血清的完全新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3.4 細胞增殖檢測 收集對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染組和對照組細胞，調(diào)整細胞濃度為1×104/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，48 h后加入20 μl噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）孵育4 h，去除上清液，應(yīng)用150 μl的二甲基亞砜溶解MTT，在波長為570 nm處檢測細胞的吸光度（optical density，OD）值，根據(jù)OD值的大小計算細胞增殖率，細胞增殖率=（OD48h－OD0h）/OD48h×100%。實驗重復(fù)3次。

1.3.5 細胞侵襲檢測 將Matrigel膠與無血清的IMDM培養(yǎng)基以1∶5比例稀釋，將400 μl細胞懸液加入Transwell小室的上室，800 μl全血清加入下室，37℃孵育48 h，去除Matrigel膠，4%多聚甲醛固定10 min，0.005%結(jié)晶紫染色40 min。200倍顯微鏡下觀察透過膜的細胞數(shù)，隨機取5個視野計數(shù)取平均值。實驗重復(fù)3次。

1.3.6 細胞周期檢測 將SW480細胞轉(zhuǎn)染48 h后用胰酶消化，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）洗滌細胞2次，將細胞懸液緩慢加入預(yù)冷的70%乙醇中固定，4℃過夜后離心收集細胞，加入500 μl PI避光孵育30 min，應(yīng)用流式細胞儀Cell Quest軟件檢測細胞周期。每次實驗平行做5個樣本，實驗重復(fù)3次。

1.3.7 細胞凋亡檢測 取對數(shù)生長期的SW480細胞，采用胰酶消化，1000 r/min離心5 min，棄上清，1×binding buffer洗滌細胞沉淀1次，100 μl 1×binding buffer重懸細胞，加入5 μl AnnexinV-FITC及5 μl PI染色，室溫避光孵育15 min，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。每次實驗平行做5個樣本，實驗重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件對-數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織、癌旁組織和正常結(jié)腸組織中miRNA-16表達水平的比較

結(jié)腸癌組織、癌旁組織和正常結(jié)腸組織中miRNA-16的表達水平分別為（0.375±0.156）、（1.000±0.020）和（0.941±0.102），3組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=304.978，P＜0.01）；結(jié)腸癌組織中miRNA-16的表達水平明顯低于癌旁組織和正常結(jié)腸組織（t=21.766，P＜0.01；t=16.633，P＜0.01）。

2.2 結(jié)腸癌組織中miRNA-16的表達水平與結(jié)腸癌患者臨床特征的關(guān)系

有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、疾病進展結(jié)腸癌患者結(jié)腸癌組織的miRNA-16表達水平均低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、疾病未進展的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。不同年齡、性別、分化程度、結(jié)腸癌家族史、腫瘤直徑、腫瘤部位、TNM分期的結(jié)腸癌患者結(jié)腸癌組織的miRNA-16表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

2.3 轉(zhuǎn)染組和對照組細胞中miRNA-16表達水平的比較

RT-PCR檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組中miRNA-16凝膠條帶的亮度明顯強于對照組，其灰度值分別為（2.20±0.23）和（1.01±0.02），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.986，P＜0.01）。

2.4 miRNA-16過表達對SW480細胞增殖和侵襲能力的影響

MTT檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組和對照組細胞的增殖率分別為（0.78±0.12）%和（0.81±0.28）%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。Transwell實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組中穿透Matrigel膠的SW480細胞數(shù)量為（28.0±3.0），明顯少于對照組的（91.0±4.0），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.617，P＜0.01）。

2.5 miRNA-16過表達對SW480細胞周期的影響

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組和對照組中G1期、S期及G2期細胞所占比例比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

2.6 miRNA-16過表達對SW480細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組細胞的早期凋亡率為（13.770±3.460）%，明顯高于對照組的（1.250±0.410）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=13.917，P＜0.01）；轉(zhuǎn)染組和對照組細胞的晚期凋亡率分別為（3.210±1.120）%和（2.980±1.450）%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.486，P=0.631）。

表1 結(jié)腸癌組織中miRNA-16的表達水平與結(jié)腸癌患者臨床特征的關(guān)系（n=30）

表2 對照組和轉(zhuǎn)染組中G1期、S期和G2期SW480細胞所占比例的比較（%，±s）

表2 對照組和轉(zhuǎn)染組中G1期、S期和G2期SW480細胞所占比例的比較（%，±s）

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3 討論

miRNA-16缺失、突變甚至重排與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[7-8]。近年來國內(nèi)外研究表明，miRNA-16在多種實質(zhì)性腫瘤組織中均呈低表達，其表達水平與腫瘤的發(fā)展階段呈負相關(guān)[9-12]。本研究結(jié)果顯示，miRNA-16在結(jié)腸癌組織中低表達，且其表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，但miRNA-16對結(jié)腸癌細胞生物學(xué)影響的研究結(jié)論不一。

細胞黏附和侵襲是腫瘤細胞發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的重要因素，本研究通過體外實驗探索了miRNA-16過表達對結(jié)腸癌細胞遠處轉(zhuǎn)移的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可以抑制結(jié)腸癌細胞和組織的侵襲能力。楊天權(quán)等[13]在裸鼠模型中發(fā)現(xiàn)，miRNA-16通過調(diào)控NF-κB1、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）的表達，抑制膠質(zhì)瘤細胞的侵襲和生長。Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-16-1-3p通過調(diào)控Twist1的表達，抑制胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。

本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中miRNA-16的表達水平明顯低于癌旁組織和正常結(jié)腸組織（P＜0.01），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、疾病進展結(jié)腸癌患者結(jié)腸癌組織的miRNA-16表達水平均低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、疾病未進展的患者（P＜0.05）。汪旭東等[15]研究證實，miRNA-16在肺腺癌細胞中低表達，并可以抑制肺腺癌細胞增殖，促進肺腺癌細胞早期凋亡。Patel等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-16通過下調(diào)抑制癌基因BMI1，誘導(dǎo)乳腺癌細胞線粒體依賴的細胞凋亡。本研究進一步探討了miRNA-16過表達對結(jié)腸癌細胞增殖、侵襲、周期和凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染組和對照組的細胞增殖率和細胞周期比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但miRNA-16過表達能夠抑制結(jié)腸癌細胞侵襲，促進結(jié)腸癌細胞早期凋亡。

本研究具有一定的局限性。已有研究報道，miRNA-16低表達與腫瘤預(yù)后具有一定的關(guān)系，miRNA-16可以通過調(diào)控Bcl-2蛋白的表達，逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細胞的耐藥性[17-18]，這部分研究在本文中并未體現(xiàn)，更多的試驗（例如體內(nèi)動物和臨床試驗等）亟待開展。

綜上所述，miRNA-16在多種腫瘤的發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用，對miRNA-16的深入研究將為相關(guān)腫瘤的治療提供新的思路并有望成為結(jié)腸癌靶向治療的新靶點。