于治凡，劉英華，肖均財，王明偉

1榮成市中醫(yī)院外科，山東 榮成 264300

2湖北省腫瘤醫(yī)院病理科，武漢 430079

甲狀腺癌是一種常見的發(fā)生于頭頸部的內分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率呈上升趨勢，在女性中發(fā)病尤為突出，越來越引起人們的關注[1-2]。甲狀腺癌的治療目前仍以外科手術為主，但術后復發(fā)率較高。由于中藥材具有安全、不良反應輕和藥源豐富等特點，國內外學者們越來越關注從中藥材中尋找和研發(fā)抗腫瘤藥物。

山慈菇是蘭科植物杜鴉蘭Gremastra appendiculata（D.Don）Makino、獨蒜蘭Pleione bulbocodioides（Franch.）Rolfe或云南獨蒜蘭Pleione yunnanensisRolfe的干燥假鱗莖，含有菲類、苷類、芳香類和糖類等多種化合物，具有解毒消腫的功效[3]。臨床上山慈菇已作為抗腫瘤的中藥，常用于治療乳腺癌、胃癌和結腸癌等多種惡性腫瘤[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，山慈菇對甲狀腺癌細胞的增殖具有抑制作用[6]，但關于山慈菇調控甲狀腺癌細胞增殖及凋亡的機制尚不完全清楚。本研究采用不同濃度的山慈菇處理甲狀腺癌SW579細胞，觀察其對SW579細胞增殖和凋亡的影響，并分析B細胞淋巴瘤因子-2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）的表達情況，探討其分子機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 制備山慈菇提取液

將粉碎的山慈菇用去離子水浸泡2 h，采用水煎法制備提取液，用旋轉蒸發(fā)儀對水提液進行濃縮，得到濃度為1 g/ml的山慈菇提取液。經高壓滅菌后，4℃保存?zhèn)溆?。用培養(yǎng)基稀釋到所需濃度。

1.2 主要試劑和儀器

山慈菇購自武漢生物制品研究所，人甲狀腺癌SW579細胞株購自中國科學院細胞庫，RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清均購自美國Hyclone公司，噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）試劑盒和膜聯(lián)蛋白（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡試劑盒均購自美國Invitrogen公司，兔抗Bcl-2抗體、β-actin抗體、羊抗兔二抗均購自美國Santa Cruz公司，流式細胞儀購自美國BD公司，酶標儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 在RPMI-1640培養(yǎng)基（含100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素和10%胎牛血清）中培養(yǎng)SW579細胞，置于相對濕度為95%、溫度為37℃、CO2含量為5%的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每隔2天更換一次培養(yǎng)基。待細胞生長至對數生長期時，采用0.25%胰蛋白酶在37℃水浴中消化5 min，然后用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）清洗，離心收集細胞，用培養(yǎng)基重懸細胞，以細胞密度（1∶3）～（1∶5）的比例進行傳代培養(yǎng)。

1.3.2 細胞增殖檢測 取上述培養(yǎng)的對數生長期細胞，經0.25%胰蛋白酶消化，重懸細胞液，按每孔1×105個細胞接種于96孔板上，每孔100 μl，經培養(yǎng)箱培養(yǎng)后，加入不同濃度的山慈菇提取液，使山慈菇終濃度為10、20、40、80、160 mg/ml，同時以只加培養(yǎng)液的處理組為對照組。培養(yǎng)48 h后，加入15 μl MTT（5 mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清，加入100 μl二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO），完全溶解后在酶標儀490 nm處測每組的吸光值A，計算細胞增殖抑制率：細胞增殖抑制率=（1－實驗組A/對照組A）×100%。實驗重復3次。

1.3.3 細胞凋亡檢測 收集經10 mg/ml和20 mg/ml山慈菇處理48 h的SW579細胞和只加培養(yǎng)液處理48 h的對照組SW579細胞，0.25%胰蛋白酶消化后，離心收集細胞。經PBS洗滌，加入100 μl結合緩沖液重懸，使細胞濃度為1×106/ml。然后分別加入5 μl Annexin V-FITC和2 μl PI，避光處理15 min后，流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況。實驗重復3次。

1.3.4 蛋白質印跡法（Western blot）檢測Bcl-2蛋白表達 收集經10 mg/ml和20 mg/ml山慈菇處理48 h的SW579細胞，采用RAPI裂解液提取各組細胞的總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳，轉聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF），采用 1%牛血清白蛋白（bovine serum albumins，BSA）封閉后加入 Bcl-2和β-actin抗體（1∶1000），過夜后加入羊抗兔二抗（1∶2000），孵育1 h后，增強化學發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色。以β-actin為內參，采用Image J軟件計算Bcl-2與β-actin的灰度值之比，即為Bcl-2蛋白的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0軟件對-數據進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 山慈菇對SW579細胞的增殖抑制作用

MTT檢測結果顯示，山慈菇濃度為0、10、20、40、80、160 mg/ml時，對SW579細胞的增殖抑制作用呈先上升后下降的趨勢。山慈菇濃度為0、10、20 mg/ml時，對SW579細胞的增殖抑制率隨著濃度的增加而提高，且在山慈菇濃度為20 mg/ml時的細胞增殖抑制率最高；山慈菇濃度為40、80、160 mg/ml時，對SW579細胞的增殖抑制率隨著濃度的增大而減小。經計算，半數抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）為 11.59 mg/ml。（圖 1）

圖1 不同濃度山慈菇提取液作用于SW579細胞后的增殖抑制率

2.2 山慈菇對SW579細胞凋亡的影響

經10 mg/ml和20 mg/ml山慈菇處理的SW579細胞的凋亡率分別為（25.56±1.62）%和（58.85±2.26）%，均高于對照組的（8.05±1.05）%，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（圖2）

圖2 不同組別SW579細胞的凋亡情況

2.3 山慈菇對Bcl-2蛋白表達的影響

Western blot檢測結果顯示，經10 mg/ml和20 mg/ml山慈菇處理的SW579細胞中Bcl-2蛋白表達水平均低于對照組。（圖3）

圖3 Western blot檢測Bcl-2蛋白表達情況

3 討論

甲狀腺癌作為內分泌系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一，每年新發(fā)病例占所有惡性腫瘤發(fā)病的1%～5%[7]，已成為發(fā)病率增長最快的實體瘤，其發(fā)病與性別、年齡、家族史等多種因素有關[8-9]。近年來，有關甲狀腺癌發(fā)生、發(fā)展和轉移的研究取得了重大進展[10-12]。目前，甲狀腺癌的治療方法主要有手術、化療、放療以及基因治療，但是這些治療方法都會導致術后不良反應。由于中藥具有不良反應輕、有效的特點，中藥抗腫瘤的研究越來越受到學者們的關注[13]。

山慈菇在中國為常用的抗腫瘤中藥，可以通過多種分子機制達到抗腫瘤效應。研究發(fā)現(xiàn)，山慈菇能夠抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移[14]。研究報道，山慈菇提取物對結腸癌HT29細胞有明顯的促凋亡作用，其機制可能與上調Cyt-C、caspase 3、Bax蛋白和下調Bcl-2蛋白的表達有關[4]。研究報道，山慈菇抑制甲狀腺癌SW579細胞增殖與NIS基因表達上調有關[15]。Bcl-2是Bcl-2家族中一種重要的抑制細胞凋亡的因子，它是位于線粒體、內質網以及核膜上的一種內膜蛋白，能夠通過抑制鈣離子釋放從而阻止核酸內切酶的活化，發(fā)揮抗凋亡作用[16]。

本研究采用不同濃度（10、20、40、80和160 mg/ml）的山慈菇作用于甲狀腺癌SW579細胞48 h，結果發(fā)現(xiàn)山慈菇濃度為0、10、20 mg/ml時，隨著濃度的增加，山慈菇對SW579細胞的增殖抑制作用增強，具有明顯的濃度依賴性。經計算，IC50為11.59 mg/ml。本研究采用10 mg/ml和20 mg/ml的山慈菇進行細胞凋亡實驗，結果發(fā)現(xiàn)，經10 mg/ml和20 mg/ml山慈菇處理48 h后的SW579細胞的凋亡率分別為（25.56±1.62）%和（58.85±2.26）%，均高于對照組的（8.05±1.05）%，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Western blot檢測結果顯示，經10 mg/ml和20 mg/ml山慈菇處理48 h的SW579細胞中Bcl-2蛋白表達水平均低于對照組。表明山慈菇提取液的加入下調了Bcl-2蛋白的表達水平。

Bcl-2抗凋亡信號通路通過激活Bcl-2的表達，減少氧自由基的產生和脂質氧化物的形成，抑制線粒體釋放促凋亡的蛋白質細胞色素C和凋亡誘導因子，抑制促凋亡的Bax/Bak細胞毒作用。Bcl-2能夠結合Apaf-1和caspase 9，并維持其非活化狀態(tài)，阻止caspase級聯(lián)反應，從而抑制細胞凋亡。山慈菇提取液對甲狀腺癌細胞的促凋亡機制還有待進一步研究。

綜上所述，低濃度的山慈菇提取液對甲狀腺癌細胞具有增殖抑制作用和促進細胞凋亡的作用，且其促凋亡機制可能與下調Bcl-2蛋白的表達有關。