賈利剛，褚兆蘋，田菲，韓華，代聰偉，王蓓，張媛

河北省人民醫(yī)院婦科，石家莊 050051

宮頸癌是女性常見的一種惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于乳腺癌。近些年來雖然宮頸癌篩查技術不斷普及推廣，但其發(fā)病率仍呈上升趨勢并趨于年輕化[1-3]。目前宮頸癌發(fā)生的分子機制尚不明確，但腫瘤細胞的惡性增殖、細胞凋亡受限制、細胞周期紊亂是宮頸癌等惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因之一[4]。X連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）是Rajcan-Separovic等[5]發(fā)現(xiàn)的一種凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP），能夠選擇性地通過調(diào)控天冬氨酸蛋白水解酶的活性，進而抑制細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，IAP可以參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6]。細胞周期蛋白D1（cyclin D1）是與G1期密切相關的細胞周期蛋白，通過正向調(diào)控G1期向S期轉(zhuǎn)換，促使細胞惡性增殖，因此與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[7]。存活蛋白（survivin）是目前發(fā)現(xiàn)的IAP家族中抗凋亡活性最強的抑制因子之一，在眾多腫瘤組織中高表達，是眾多學者認為的最有希望成為腫瘤治療的靶點之一[8-9]。本研究采用免疫組織化學法檢測XIAP、cyclin D1及survivin在宮頸癌組織中的表達，并分析其與宮頸癌患者臨床特征的關系，旨在為宮頸癌的治療提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年1月至2018年1月于河北省人民醫(yī)院行手術切除并經(jīng)病理確診的68例宮頸癌患者的宮頸癌組織標本。68例患者中，≤50歲36例，＞50歲32例；年齡43～70歲，平均（55.8±3.5）歲；分化程度：高分化22例，中分化15例，低分化31例；腫瘤直徑≥4 cm 28例，＜4 cm 40例；國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟分期：IA期37例，IB～ⅡA期31例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例。另選取68例因子宮肌瘤而行子宮切除術患者的正常宮頸組織作為對照。所有患者術前均未接受過任何化療、放療及生物治療等。

1.2 主要試劑及材料

兔抗人XIAP、cyclin D1及survivin多克隆抗體均購自美國Abcam公司，DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物技術有限公司。

1.3 免疫組化法檢測XIAP、cyclin D1及survivin的表達情況

將石蠟切片于二甲苯及100%、95%、90%、85%、75%乙醇中分別浸泡5 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌2次。1%過氧化氫室溫孵育10 min后，PBS洗滌3次。將切片置于枸櫞酸鈉緩沖液中，并于微波爐中加熱15 min，PBS洗滌3次。加入山羊抗血清，室溫封閉10 min，一抗過夜孵育，次日PBS洗滌3次后，二抗室溫孵育30 min，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵蛋白工作液孵育30 min，PBS洗滌3次。DAB顯色后，蘇木素復染，梯度酒精脫水，中性樹脂封片觀察。以PBS代替一抗進行染色作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判斷

XIAP及survivin蛋白主要定位于細胞質(zhì)，cyclin D1蛋白主要定位于細胞核，當出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒時提示為陽性表達。高倍顯微鏡下隨機觀察每張切片中的5個視野，采用雙盲法對染色的細胞進行計數(shù)。細胞染色強度評分：未著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞所占百分比評分：根據(jù)陽性細胞占視野細胞總數(shù)的百分比進行評分，≤25%為0分，26%～50%為1分，51%～75%為2分，≥76%為3分。根據(jù)細胞染色程度評分與陽性細胞所占百分比評分的乘積判斷免疫組化結(jié)果[9]，0～1分為陰性（－），2～3分為弱陽性（+），4～6分為中等陽性（++），6分以上為強陽性（+++），其中2分及以上為陽性表達。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman相關分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織和正常宮頸組織中XIAP、cyclin D1、survivin陽性表達率的比較

宮頸癌組織中XIAP、cyclin D1、survivin的陽性表達率均明顯高于正常宮頸組織，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。（表1）

表1 宮頸癌組織和正常宮頸組織中XIAP、cyclin D1及survivin陽性表達率的比較[n（%）]

2.2 XIAP、cyclin D1及survivin陽性表達與宮頸癌患者臨床特征的關系

臨床分期為IB～ⅡA期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、低分化宮頸癌患者的XIAP和survivin陽性表達率均明顯高于臨床分期為IA期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、中高分化的患者，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；不同年齡、腫瘤直徑宮頸癌患者的XIAP和survivin陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。不同年齡、腫瘤直徑、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和分化程度宮頸癌患者的cyclin D1陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表2）

表2 XIAP、cyclin D1及survivin陽性表達與68例宮頸癌患者臨床特征的關系

2.3 宮頸癌組織中XIAP、cyclin D1及survivin表達情況的相關性

經(jīng)Spearman相關性分析，宮頸癌組織中XIAP與cyclin D1的表達呈顯著正相關（r=0.656，P＜0.01），XIAP與survivin的表達呈顯著正相關（r=0.745，P＜0.01），cyclin D1與survivin的表達呈顯著正相關（r=0.672，P＜0.01）。

3 討論

XIAP是IAP家族中唯一能夠同時抑制起始階段和效應階段的IAP[10]。XIAP通過選擇性調(diào)控caspase 3、caspase 7、caspase 9蛋白的表達，進而抑制細胞凋亡。XIAP在正常組織中幾乎不表達，而在乳腺癌、宮頸癌、肺癌、肝癌等腫瘤組織中高表達[6]。本研究采用免疫組織化學法檢測68例宮頸癌組織及68例正常宮頸組織中XIAP的表達情況，結(jié)果顯示，宮頸癌組織中XIAP的陽性表達率明顯高于正常宮頸組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），說明XIAP在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮促進作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，臨床分期為IB～ⅡA期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、低分化宮頸癌患者的XIAP陽性表達率明顯高于臨床分期為IA期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、中高分化的患者，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示宮頸癌組織中XIAP的表達可能與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及分化程度有關。已有研究表明，XIAP抑制劑蒽貝素能夠通過上調(diào)caspase 3和caspase 9的表達，誘導宮頸癌HeLa細胞凋亡[11]。說明XIAP抑制劑目前已逐漸被應用于宮頸癌的治療中。

cyclin D1是與G1期密切相關的細胞周期蛋白。cyclin D1先在G1期表達，與細胞周期依賴性蛋白激酶4（cyclin-dependent protein kinases 4，CDK4）/細胞周期依賴性蛋白激酶6（cyclin-dependent protein kinases 6，CDK6）結(jié)合形成復合物，促使Rb蛋白磷酸化及核轉(zhuǎn)錄因子E2F進入細胞核，促進與細胞增殖相關基因的轉(zhuǎn)錄[7]。楊琳等[12]研究表明，p27kip1和p57kip2表達下降及cyclin D1表達升高可用于評估宮頸癌的惡性程度。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組織中cyclin D1的陽性表達率明顯高于正常宮頸組織（P＜0.01）。這一結(jié)果與楊琳等[12]的研究結(jié)果基本一致，即cyclin D1高表達預示著宮頸惡性病變。本研究還發(fā)現(xiàn)，不同年齡、腫瘤直徑、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和分化程度宮頸癌患者的cyclin D1陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），可能與樣本量較少有關。survivin是1997年Ambrosini等[8]通過基因庫篩選分離出來的IAP，是目前發(fā)現(xiàn)的分子量最小而凋亡抑制活性最強的凋亡抑制因子。目前的研究顯示，survivin能夠通過抑制caspase 3和caspase 9的活性進而抑制細胞凋亡，或者通過調(diào)控細胞周期進而促進腫瘤細胞的增殖[8]。survivin在除了胚胎組織外的所有正常組織中幾乎不表達，而在膠質(zhì)瘤、肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌中高表達[8]。Zhou等[13]研究顯示，survivin在正常宮頸、宮頸炎、宮頸尖銳濕疣、宮頸上皮內(nèi)瘤變、宮頸鱗癌組織中的陽性表達率依次呈上升趨勢。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組織中survivin的陽性表達率明顯高于正常宮頸組織（P＜0.01）。本研究還發(fā)現(xiàn)，臨床分期為IB～ⅡA期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、低分化宮頸癌患者的survivin陽性表達率明顯高于臨床分期為IA期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、中高分化的患者，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示宮頸癌組織中survivin的陽性表達率與腫瘤分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關。本研究中Spearman相關性分析結(jié)果顯示，宮頸癌組織中XIAP、cyclin D1及survivin的表達兩兩呈顯著正相關。楊德華等[14]研究表明，原發(fā)性肝癌組織中XIAP和survivin的表達呈正相關。凌春等[15]研究表明，沉默白血病K562細胞中survivin的表達能夠下調(diào)XIAP的表達，進而使細胞凋亡，并造成細胞周期阻滯。崔宏[16]的研究表明，結(jié)直腸腺瘤中cyclin D1和survivin的表達呈正相關。Xie等[17]研究表明，RNA干擾survivin的表達后能夠提高順鉑誘導的膠質(zhì)瘤U87細胞凋亡，與下調(diào)cyclin D1表達有關。提示通過下調(diào)survivin的表達，進而抑制XIAP及cyclin D1的表達，可能成為宮頸癌基因治療的靶點之一。綜上所述，XIAP、cyclin D1及survivin在宮頸癌中高表達，且其表達兩兩呈顯著正相關，XIAP和survivin的表達與宮頸癌的臨床分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關。XIAP、cyclin D1及survivin在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。