鄒婷婷，徐振林，楊金易，王 弘，孫遠明，沈玉棟

(華南農(nóng)業(yè)大學 食品學院/廣東省食品質(zhì)量安全重點實驗室，廣東 廣州 510642)

“民以食為天，食以安為先”，與生命健康息息相關的食品安全問題不僅是民眾生活的底線，更是國家發(fā)展的基礎和人類發(fā)展的要求。然而，自 2000 年之后，“瘦肉精”、“蘇丹紅”、“毒黃瓜”、“染色饅頭”、“地溝油”、“三聚氰胺”、“塑化劑”、“速生雞”等重大食品安全事件被曝光，引發(fā)了公眾對食品安全問題的強烈關注。食品安全惡性事件的頻現(xiàn)，給我國經(jīng)濟和人民生命財產(chǎn)造成重大損失。這主要與我國目前的食品安全法律不健全、食品安全監(jiān)管不力和食品安全監(jiān)測技術及設備落后等現(xiàn)狀有關。針對食品安全問題，目前國際上常用的檢測方法多為儀器分析法，儀器法雖可以滿足精準檢測的要求，但樣品前處理較復雜、成本高、耗時長，無法滿足現(xiàn)場樣品高通量的快速篩查要求。而快檢分析法因能彌補儀器法的不足，以及低成本實現(xiàn)樣品的現(xiàn)場快速檢測，逐漸成為食品安全檢測的熱門技術。

表面增強拉曼光譜(Surface Enhanced Raman Spectroscopy，SERS)技術作為一種新型的快速檢測技術，承載了豐富的化學指紋信息，具有靈敏度高、熒光背景低、不受水干擾，可實現(xiàn)痕量無損檢測、便攜式設備等優(yōu)點。其檢測是基于在合適頻率的入射光照射下，吸附在SERS基底上的分子與金屬表面等離子體發(fā)生等離子共振而引起分子拉曼散射明顯增強的原理[1]。上述特點使得SERS成為一種強有力的分析檢測技術，在環(huán)境監(jiān)測[2]、食品安全[3]、生物技術[4]、表面科學[5]等領域顯示出巨大的應用潛力?；诮t外波長激光的SERS技術能達到單分子檢測[6]水平，該技術在食品安全檢測方面得到日益廣泛和深入的研究。本文介紹了表面增強拉曼光譜技術的發(fā)展歷程、增強機理、基底的分類及應用和檢測模式，對SERS檢測技術在食品中有害小分子物質(zhì)、食源性致病菌、重金屬污染和真菌毒素等領域的應用進展進行了綜述，并對目前存在的問題和今后的研究趨勢進行了總結和展望。

1 SERS的發(fā)展歷程

拉曼散射最早由印度物理學家拉曼(C.V.Raman)于20世紀20年代末發(fā)現(xiàn)。然而，早期拉曼光譜的應用因拉曼譜線強度弱和檢測靈敏度有限而受到限制。直至60年代激光器的產(chǎn)生，近紅外波長激光代替可見光的使用有效避免了在可見光下的熒光干擾問題，攻克了拉曼光譜信號弱的不足。1974年英國南安普頓大學的Fleischmann 等[7]研究吡啶分子在粗糙銀電極基底上的拉曼光譜時，發(fā)現(xiàn)吡啶分子的拉曼信號被大大增強，得出通過某種方式可以增強待測物拉曼信號的結論，但未進一步探討其增強機制。1977年Van Duyne[8]和 Creighton 等[9]對Fleischmann的實驗結果進行系統(tǒng)分析，得到了粗糙銀電極是增強吡啶分子拉曼信號的主要原因，使拉曼光譜獲得突破性進展。此后，人們將這種分子吸附于特定金屬表面而使拉曼信號大大增強的現(xiàn)象稱為表面增強拉曼散射(SERS)。

圖1 球形金屬納米顆粒表面等離子體共振[11](A)與光驅(qū)電荷轉(zhuǎn)移模型[12](B)示意圖Fig.1 Schematic illustration of surface plasmon resonance for a mental sphere[11](A)and schamatic diagram of the photo-driven charge-transfer mode[12](B)B:①ceation of an e-h pair in the metal(在金屬中創(chuàng)建e-h 對)；②tunneling of the hole from the metal to the molecule(空穴從金屬轉(zhuǎn)移到分子中)；③tunneling of the hole back to the metal(空穴又回到金屬)；④recombination eletron and hole to give all emitted photon(電子-空穴的復合產(chǎn)生激發(fā)光子)

1.1 SERS的增強機理

雖然SERS的應用非常廣泛，但其復雜的增強機理至今尚未完全清楚，目前人們認同的增強機理有物理增強和化學增強兩種。物理增強即電磁場增強機理，主要受金屬表面等離子體共振(圖1A)導致的局域電場增強影響；化學增強即電荷轉(zhuǎn)移機理，主要受金屬與分子間的電荷轉(zhuǎn)移(圖1B)所導致的極化率改變影響，要求分子與基底之間的距離足夠近[10-12]。根據(jù)報道，SERS效應是兩者共同作用的結果，但化學增強的增強因子一般在100倍左右，貢獻較小，其主要貢獻是來源于納米結構的等離子體共振引起的電磁增強，理論上增強因子可達到1014倍，但對于SERS增強機理的普遍適用尚需進一步探索。常見的SERS增強材料有貴金屬、過渡金屬、半導體、量子點和石墨烯等，其中貴金屬具有較強的電磁增強作用，而半導體、量子點和石墨烯只有化學增強作用。然而，不論是何種增強效果，金屬表面必須具有合適的粗糙程度，納米基底的粒徑、形貌和分布狀況對SERS的增強效應也起著舉足輕重的作用。這大大激發(fā)了人們開發(fā)納米結構的SERS活性基底的興趣。

1.2 SERS基底的分類

近年來，研究者通過物理和化學方法控制納米結構的形狀、尺寸和組成，致力于制備各種優(yōu)異的SERS基底。目前，制備SERS活性基底的材料有金屬納米材料(貴金屬和過渡金屬)和非金屬納米材料(半導體、石墨烯和量子點等)。依據(jù)材料的組成，SERS活性基底可分為單一SERS活性基底和復合SERS活性基底。單一SERS基底是指利用一種材料制備的基底，復合SERS基底是利用兩種或兩種以上材料制備的基底。

在諸多材料中，以貴金屬應用最多，其中又以Au、Ag最為常見。隨著納米技術的發(fā)展，許多不同形貌的金銀納米顆粒(如納米線、納米棒、納米片、納米星、納米花等)已被報道[13-17]。Bian和Lu等[18-19]分別借助電沉積法和液相還原法合成了含有凹面花瓣和普通的花狀銀納米粒子，通過對羅丹明6G(R6G)拉曼信號的檢測對該SERS基底的性能進行評價，檢出限分別為10-12、10-7mol/L；驗證了不同粒徑形貌的納米基底對SERS增強效應有較大影響的結論。除了傳統(tǒng)貴金屬的SERS增強效果顯著外，半導體材料在SERS活性增強方面也有巨大潛力[20-22]。Wang等[20]合成了非晶態(tài)和晶態(tài)的ZnO納米籠，以探針分子4-MBA、4-MPY和4-ATP研究此兩種基底的SERS活性，發(fā)現(xiàn)非晶態(tài)ZnO納米籠的SERS增強活性強于晶態(tài)ZnO納米籠，前者的增強因子(EF)高達6.62×105，這是首次在非晶半導體材料中觀察到如此顯著的SERS活性。Li等[23]以不銹鋼纖維為固相載體，用簡單的水熱法在其表面合成ZnO納米棒，再在室溫下通過離子濺射將Au納米粒子修飾到ZnO納米棒上，形成Au-ZnO納米棒復合基底(圖2)，將該SERS基底應用于結晶紫(CV)和孔雀石綠(MG)的檢測，增強因子(EF)分別為2.76×105和5.3×105，檢出限分別為0.103 nmol/L 和0.241 nmol/L，低于國家標準檢測方法的最低檢出濃度(0.5 μg/kg)。此外，本課題組[24]以醋酸鋅和六次甲基四胺為原料通過綠色環(huán)保的水熱法在氧化銦錫(ITO)玻璃上制備出頂端多孔ZnO納米棒(圖3)，目前正與其他SERS增強材料結合以開發(fā)出新型基底，為其他研究者提供相關借鑒。

圖2 在不銹鋼纖維上合成Au-ZnO納米棒的過程(A)及Au-ZnO納米棒的SEM圖像 (B)[23]Fig.2 Fabrication process for the Au-ZnO NRs on the stainless steel fiber(A)and SEM image of Au-ZnO NRs (B)[23]

2 SERS檢測模式

2.1 SERS直接檢測技術

SERS直接檢測技術，即無標記檢測技術，其原理是利用目標分子與金屬表面結合，使待測物靠近基底表面，從而達到增強目標分子拉曼信號的目的。借助SERS豐富的指紋譜圖性質(zhì)，可對待測目標物指紋區(qū)特征性單一譜帶(分子指紋)進行分析，方法具有操作簡便、數(shù)據(jù)分析簡單的優(yōu)勢。如鄭華軍[25]采用液相還原法合成了SERS活性較高的花狀銀納米顆粒，之后將納米銀溶膠轉(zhuǎn)移到單晶硅片上，在真空干燥的條件下得到組裝在硅片上的花狀納米銀SERS襯底，將一定濃度的R6G滴于SERS襯底，待有機試劑揮發(fā)后即可進行檢測。但SERS直接檢測技術也存在弊端，如背景噪聲相對略強，對目標分析物結構及所帶電荷性質(zhì)有特殊要求等[26]。例如，王珊等[27]利用SERS技術檢測食用油中的苯并芘，但由于苯并芘分子不含能與金屬配位或鍵合的官能團，從而增加了SERS技術對其直接檢測的難度，所以需對基底進行衍生化，研究者們選擇以納米金修飾的氨基改性硅烷化的擔體作為表面增強拉曼光譜的活性基底，以實現(xiàn)食用油中苯并芘的快速檢測。因此，直接檢測技術適用于體系較為簡單以及能與SERS基底產(chǎn)生相互作用的樣品檢測。

圖4 SERS納米探針的制備(A)及競爭性SERS免疫分析方案(B)[30]Fig.4 Preparation of SERS nanoprobes(A)and scheme of the competitive SERS immunoassay for clenbuterol(B)[30]

2.2 SERS間接檢測技術

SERS間接檢測技術，是一種主要針對散射截面積較小的離子和小分子的檢測方法，其利用具有拉曼活性的有機分子與目標物結合后增強目標物拉曼活性以達到對目標物靈敏檢測的目的[28-29]，包括標記SERS檢測和SERS傳感檢測等。Zhu等[30]采用標記SERS檢測技術，在膠體金上標記4,4'-聯(lián)吡啶(DP)和克倫特羅抗體制備SERS納米探針，以游離的克倫特羅和包被于固相載體上的克倫特羅競爭SERS納米探針上的克倫特羅抗體后，通過檢測DP的拉曼強度間接實現(xiàn)克倫特羅的定量檢測(圖4)。楊涵茹[31]利用基于表面反應的SERS傳感器實現(xiàn)了自來水中亞硝酸根離子的檢測，以IP6@Ag NPs(IP6，穩(wěn)定劑植酸鈉)作為SERS活性基底，通過對巰基苯胺(PATP)與亞硝酸根離子在酸性條件下的偶氮反應，分析反應前后偶氮苯的SERS特征峰強度變化以實現(xiàn)定量分析。SERS間接檢測技術不僅操作簡便快速、靈敏度高、適于多組分分析，還可彌補SERS直接檢測技術的不足，實現(xiàn)非拉曼散射體的檢測；但也存在受體制備耗時、成本高，對基底的生物相容性要求高，以及基底的可重復性和保存時間難控制等缺陷。

3 SERS在食品安全檢測中的應用

3.1 SERS在食品有害小分子檢測中的應用

非法添加劑、農(nóng)獸藥殘留均為食品中常見的有害小分子物質(zhì)，一些不法商家為提高產(chǎn)品的產(chǎn)量和銷量，往往會在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖以及生產(chǎn)加工過程中添加此類有害物質(zhì),如近年來曝光的蘇丹紅辣椒醬、三聚氰胺奶粉和塑化劑飲料、速生雞等事件，給食品安全帶來了巨大威脅。因此，快速鑒別食品中是否含有有害小分子物質(zhì)對食品安全的保障具有重要意義，而SERS技術可滿足這一檢測要求，并已在有害物質(zhì)的檢測中得到廣泛應用(表1)。

Mecker等[32]采用檸檬酸鈉包覆的金納米顆粒作為SERS的基底，開發(fā)了一種用于現(xiàn)場檢測三聚氰胺的方法，在以異丙醇為提取溶劑的條件下，可以消除基質(zhì)對基體的干擾，通過由添加異丙醇而形成的金納米顆粒附聚物可使三聚氰胺的拉曼信號增強105，該方法對嬰兒配方奶粉、乳糖、聚維酮、乳清蛋白、麥麩和小麥面筋的檢出限為100～200 mg/L。Jahn等[33]采用一種表面改性的Ag納米顆粒作為SERS基底檢測食品中的蘇丹紅染料，通過在SERS基底表面組裝一層親脂分子(含硫醇基團，對貴金屬表面有高親和性)，形成一疏水單層，在進行檢測時，疏水單層吸附水不溶性分子(蘇丹紅染料)，從而克服了水環(huán)境下檢測偶氮染料蘇丹紅的局限性。實驗結果表明，方法檢出限為 3.2 μmol/L，在辣椒粉中的檢出限為9.0 μmol/L。

Müller等[34]采用表面增強拉曼光譜技術檢測柑橘和香蕉表皮的殺菌劑噻苯咪唑殘留，結果顯示，市場中香蕉的噻苯咪唑使用量在安全范圍內(nèi)，柑橘皮樣品含量則嚴重超標，檢出量為78 mg/kg。Furini等[35]通過優(yōu)化SERS活性基底，發(fā)現(xiàn)銀溶膠在多菌靈的SERS檢測中效果最好，此條件下檢出的濃度可達6.54×10-8mol/L。Wijaya等[36]對未經(jīng)處理的蘋果表皮和蘋果汁中的殺蟲劑啶蟲脒殘留進行了SERS檢測，檢出量分別為2.5 μg/L和3 μg/L，遠低于最高限定濃度。

Li等[37]采用SERS標記技術的原理，開發(fā)了一種基于表面增強拉曼散射(SERS)的超靈敏競爭性免疫色譜法(ICA)，用于檢測組織和尿液中的呋喃它酮代謝物(AMOZ)，方法可在15 min內(nèi)完成測定，檢出限低至0.28 pg/mL。Chen等[38]將直立的金納米棒與SERS相結合測定水溶液和魚樣品中的孔雀石綠(MG)和結晶紫(CV)及其混合物，檢測結果表明，該方法能區(qū)分水溶液和魚樣品中的MG、CV及其混合物，且檢出限均為1 mg/L。馬海寬等[39]利用表面增強拉曼光譜(SERS)和靜電富集(EP)相結合的技術，實現(xiàn)了水環(huán)境中磺胺甲基嘧啶、丁胺卡那霉素、恩諾沙星和環(huán)丙沙星的有效富集和快速痕量檢測，4種抗生素的最低檢出濃度均小于10-7mol/L。

3.2 SERS在食源性致病菌檢測中的應用

常見的食源性致病菌有鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、福氏志賀氏菌、大腸桿菌O157∶H7、李斯特菌以及布魯氏菌等。這些致病菌通過污染水和食物引起人類的食源性疾病。目前，食源性疾病被認為是發(fā)達國家和發(fā)展中國家最重要的公共衛(wèi)生問題。因此，加強食品中致病菌的檢測對保障人民的食品安全具有重要意義。

目前，我國傳統(tǒng)的食源性致病菌的檢測是基于微生物形態(tài)學，但此方法存在耗時長、操作繁瑣等缺點，不適用于現(xiàn)場檢測。Xu等[55]發(fā)現(xiàn)細菌細胞膜表面有大量的生化成分，可作為菌種快速識別和鑒定的標志。該研究利用SERS對臨床病人和環(huán)境中分離獲得的4種基因型的7株副溶血弧菌進行了鑒定，結果表明，每株細菌均有區(qū)別于其他菌株的特征峰，說明該方法在單個菌種樣品和多菌種混合樣品中均能得到良好的鑒定結果。Wu等[56]基于SERS標記檢測的原理，開發(fā)了一種基于適配體識別的磁性輔助表面增強拉曼光譜生物傳感器，與常規(guī)拉曼光譜檢測金黃色葡萄球菌的結果(檢出限為10 cells/mL)相比，該方法具有更高的靈敏度，可實現(xiàn)金黃色葡萄球菌的單細胞檢測。Wang等[57]基于萬古霉素修飾改性的Fe3O4@Ag 磁性納米粒和作為二次增強粒子的等離子體激元 Au@Ag 納米粒的聯(lián)合使用，研發(fā)了一種可方便檢測不同致病菌的SERS生物傳感器。此體系將修飾改性的Fe3O4@Ag磁性納米粒子作為細菌捕捉工具和SERS信號放大平臺，用磁鐵分離形成的磁性納米粒子-細菌復合物，然后將Au@Ag 納米粒擴散到復合物上，通過Fe3O4@Ag磁性納米粒和Au@Ag 納米粒的協(xié)同增強，在細菌表面產(chǎn)生大量熱點，致使細菌的SERS信號極大增強。基于這種雙重強化策略，可保證細菌檢測的重復性和靈敏度。研究結果顯示，該方法耐受的pH值范圍廣(pH 3.0～11.0)，檢測時間短(30 min)，選擇性高，檢出限為5×102cells/mL。

3.3 SERS在重金屬污染檢測中的應用

隨著水體和土壤污染問題的日益嚴重，由重金屬導致的食品安全問題引發(fā)越來越多的關注。重金屬離子通過食物鏈累積并貯存在生物體內(nèi)，當被人體吸收后，可通過與人體內(nèi)蛋白質(zhì)結合使其失活的方式嚴重影響人們的生命安全。

Eshkeiti等[58]在硅晶片上印刷粒徑為140 nm的Ag納米粒子作為一種新型SERS基底，并用于有害重金屬的檢測，通過比較有毒重金屬HgS、CdS和ZnO在新型SERS基底和硅晶片上的拉曼信號強度，發(fā)現(xiàn)新型SERS基底在增強重金屬拉曼強度方面具有很大優(yōu)勢，適用于樣品中有毒重金屬的檢測。Zhao等[59]在石墨烯納米片上合成金納米粒子，以石墨烯為拉曼探針分子檢測水樣中的Pb2+，方法檢出限為1 nmol/L，線性范圍為5 nmol/L～4 μmol/L。Yang等[60]開發(fā)了一種以CoFe2O4@Ag納米顆粒為磁性基底的表面增強拉曼光譜傳感器，主要由巰基修飾的單鏈DNA(SSDNA)、單壁碳納米管(SWCNT)及CoFe2O4@Ag納米顆粒3部分組成；單壁碳納米管作為拉曼探針，在CoFe2O4@Ag納米顆粒為基底的情況下有很強的拉曼信號峰。該傳感器的主要檢測原理為：巰基修飾的單鏈DNA通過Ag—S鍵結合在磁性基底CoFe2O4@Ag上后，單鏈DNA和單壁碳納米管通過堿基和碳納米管之間的π-π堆積連接，最終得到一個螺旋纏繞的結構。當Hg2+存在時，單鏈DNA捕獲Hg2+形成胸腺嘧啶-Hg2+-胸腺嘧啶(T-Hg2+-T)堿基對，同時會使單壁碳納米管解離出來，導致拉曼信號減弱，傳感器上單壁碳納米管的拉曼信號隨著Hg2+含量的增加而減少，可實現(xiàn)Hg2+的定量檢測，該方法的檢出限為0.84 pmol/L，SERS峰強度與汞離子濃度在1 pmol/L～100 nmol/L呈良好的線性關系。

3.4 SERS在真菌毒素檢測中的應用

真菌毒素是由產(chǎn)毒真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，具有極強的毒性和致癌、致畸、致突變作用，是世界各地的農(nóng)產(chǎn)品和食品的主要污染物之一，主要包括黃曲霉毒素、展青霉素、伏馬菌素、赭曲霉毒素A等。真菌毒素會通過被污染的谷物、飼料和由這些飼料喂養(yǎng)的動物性食品進入食物鏈，對人畜的健康造成極大威脅。因此建立快速高效、經(jīng)濟靈敏的檢測方法已成為當前的研究重點。

李琴[61]構建了基于適配體識別和磁分離輔助的用于快速檢測黃曲霉毒素B1(AFB1)的SERS傳感器，通過磁珠組裝構建的檢測探針和SERS標記探針共同競爭AFB1，根據(jù)標記探針SERS強度的變化達到快速檢測AFB1的目的，該傳感器的檢出限為0.4 pg/mL。Lee等[62-63]使用有效的銀枝晶對磨碎玉米樣品中的伏馬菌素進行分類和定量分析，發(fā)現(xiàn)其靈敏度和特異性均優(yōu)于常規(guī)拉曼檢測技術。

4 總結與展望

作為一種新興的快速檢測方法，表面增強拉曼光譜技術因可以提供物質(zhì)的指紋圖譜和低成本、高靈敏度、操作簡單、對樣品檢測無損且不受水干擾等優(yōu)點，成為食品安全檢測領域近幾年的研究熱點。然而，SERS技術的發(fā)展與應用仍存在許多問題亟待解決：①對SERS機制的本質(zhì)認識不充分，相比實驗和應用所取得的進展，SERS理論研究相對滯后；②目前常用的SERS基底材料為貴金屬或貴金屬和其它材料的復合物，基底成本較高；③因SERS基底重現(xiàn)性和穩(wěn)定性較差，使得SERS技術的應用難以廣泛商業(yè)化和標準化，利用SERS技術進行食品安全快速檢測的市場推廣較難大范圍進行；④目前SERS 技術僅對食品中某些有害物質(zhì)進行了檢測和鑒定，尚無建立食品中多種違禁物的“拉曼光譜指紋”數(shù)據(jù)庫，對于未建立指紋圖譜的物質(zhì)較難檢測。

SERS技術在食品安全檢測方面的發(fā)展趨勢主要包括對表面增強拉曼光譜機制的進一步探索以及食品中有害物質(zhì)SERS譜圖庫的建立。可以預見，未來通過對SERS機理的深入認識，可合成排列更規(guī)則、尺寸更均一、重現(xiàn)性更好、靈敏度更高、成本更合理的SERS活性基底，從而解決SERS技術應用于食品安全快速檢測重現(xiàn)性差、穩(wěn)定性差和成本高的問題。通過廣泛的收集和匯總食品中多種有害物質(zhì)的SERS譜圖，建立可搜索、可操作的數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)絡平臺，不僅可跨越時間和地區(qū)的界限，實現(xiàn)多研究機構資源共享，還能滿足食品安全檢測中現(xiàn)場快速準確檢測的需求，實現(xiàn)SERS技術更大范圍的市場推廣。