段智紅,袁圣亮,呂應年,2,*,吳科鋒,2

(1.廣東海洋醫(yī)藥研究院,廣東醫(yī)科大學,廣東湛江 524023; 2.廣東天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室,廣東醫(yī)科大學,廣東湛江 524023)

海藻是一類重要的海洋生物資源,目前國際應用的海藻年工業(yè)產(chǎn)值達到50億美元以上,其中90%用作人類食品補充物質(zhì)[1]。可食性海藻能提供優(yōu)良的多糖、蛋白質(zhì)、脂肪酸、礦物質(zhì)、微量元素等營養(yǎng)成分,成為沿海居民普遍食用的海洋風味食品來源,尤其在亞洲國家,包括中國、日本、韓國、泰國等,每年消費大量海藻類食品。我國是海藻消費大國,其中紫菜、龍須菜(也稱海發(fā)菜)以及海帶等大型可食用海藻年產(chǎn)量數(shù)以千噸計[2-3]。

可食用大型海藻不僅含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì),還含有多種天然色素,按照藻體的外觀顏色可把這些可食用海藻分為三類:紅藻(Rhodophyta)、綠藻(Chlorophyta)和褐藻(Ochrophyta)。海藻中的天然色素主要包括葉綠素類(Chlorophyll)、胡蘿卜素類(Carotenoids)以及藻膽蛋白類(藻紅蛋白Phycoerythrin、藻藍蛋白Phycocyanin)等有色成分[4-6]。其中葉綠素是海藻進行光合作用的主要色素,在海藻中含量豐富,具有多種生物功能。葉綠素作為海洋食品的功能性成分,研究其結構、含量、分布以及生理活性對于人類健康具有重要意義。

近年來,人們對葉綠素及其衍生物的化學成分、生物活性、測定方法、生物合成及臨床應用等方面進行了大量研究[7-9],本文選取消費量居前的六種可食性大型海藻,包括紅藻類海發(fā)菜(Gracilarialemaneiformis)和紫菜(Porphyra,Nori),褐藻類海帶(Laminaria,Kombu)和裙帶菜(Undaria,Wakame),以及綠藻類滸苔(Enteromorpha,Aonori)和石莼(Ulva,Sea lettuce),綜述這些海藻中葉綠素及衍生物的分布、結構及活性,為我國海藻經(jīng)濟的發(fā)展提供參考。

1 海藻中葉綠素及其衍生物的種類和含量

海藻中的葉綠素在光合作用的光吸收中起核心作用,其吸收大部分的紅光和紫光,并反射綠光,因此葉綠素自身呈現(xiàn)綠色。海藻中葉綠素衍生物的種類及含量和生長環(huán)境有關。海藻生長區(qū)域的海水溫度、氮磷含量、光照強度、光照時間等因素會對海藻葉綠素及其衍生物產(chǎn)生影響[10]。江籬屬海藻龍須菜在富氮環(huán)境中,會吸收過量的氮儲存在體內(nèi),當環(huán)境中缺乏氮源時,體內(nèi)的氮會慢慢釋放出來,供應海藻生長及生理需求,此時龍須菜藻體內(nèi)的色素含量下降,藻體出現(xiàn)“黃化”現(xiàn)象,光合同化效率下降[11],表明環(huán)境因素的改變會導致海藻的葉綠素含量發(fā)生改變,也從側(cè)面反映出海藻中的葉綠素成分復雜多變。

由于可食性海藻的物質(zhì)成分對人體健康有影響,準確分析海藻中化學成分含量及結構具有重要意義?，F(xiàn)代化的分離純化技術和儀器分析手段為檢測海藻中的化學成分提供了技術保障?？墒承院Ｔ逶辖?jīng)有機溶劑提取分離、柱層析純化得到各種葉綠素衍生物。葉綠素類衍生物的化學結構鑒定方法主要有高效液相色譜-飛行時間-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-TOF-MS),考慮到檢測化合物的極性,質(zhì)譜檢測的離子源采用電噴霧(ESI)和大氣壓化學電離源(APCI)。六種常見可食性大型海藻中的葉綠素及衍生物的化學結構已被鑒定,化合物種類和含量結果如表1[12-13]所示。

表1 可食性海藻的葉綠素及其衍生物種類及含量Table 1 Varieties and contents of chlorophyll and its derivatives in edible

2 海藻中葉綠素及其衍生物的結構及轉(zhuǎn)化

葉綠素分子是由兩部分組成的:核心部分是一個卟啉環(huán)(Porphyrin ring),其功能是光吸收;另一部分是一個很長的脂肪烴側(cè)鏈,稱為植醇(葉綠醇,Phytol),葉綠素用這種側(cè)鏈插入到類囊體膜。與含鐵的血紅素基團不同的是,葉綠素卟啉環(huán)中含有一個鎂原子。葉綠素分子通過卟啉環(huán)中單鍵和雙鍵的改變來吸收可見光。鎂原子居于卟啉環(huán)的中央,偏向于帶正電荷,與其相聯(lián)的氮原子則偏向于帶負電荷,因而卟啉具有極性,是親水的,可以與蛋白質(zhì)結合。植醇是一個親脂的脂肪鏈,它決定了葉綠素的脂溶性。自然界中的葉綠素根據(jù)分子母環(huán)骨架和支鏈的差別可分為葉綠素a、b、c、d、f以及原葉綠素等,各種葉綠素之間的結構差別較小[14-15]。

海藻中葉綠素和其他高等植物中分離的葉綠素化學結構相同,為鎂卟啉化合物,從六種大型海藻中分離鑒定的葉綠素衍生物主要骨架有葉綠素a、b、c1、c2和紫紅素,基本骨架結構見圖1。葉綠素衍生物的取代基結構見表2。

表2 海藻中葉綠素及其衍生物的化學結構Table 2 Chemical structure of chlorophyll and its derivatives in algae

圖1 海藻中葉綠素基本結構Fig.1 Basic structure of chlorophyll in algae

葉綠素很不穩(wěn)定,光、酸、堿、氧、氧化劑等都會使其分解,產(chǎn)生各種葉綠素衍生物[16]。葉綠素分子(Chlorophyll)在高溫蒸汽或微波加熱下,容易脫去酯基,生成焦葉綠素(Pyrochlorophyll);在酸性條件下,容易失去卟啉環(huán)中的鎂生成脫鎂葉綠素(Pheophytin);在堿性環(huán)境下發(fā)生水解,脫去植基,轉(zhuǎn)變?yōu)槊撝不~綠素(Chlorophyllide);脫鎂葉綠素遇堿性條件能進一步脫去植基,生成脫鎂葉綠酸(Pheophorbide)。葉綠素分子的α-H位點在生理條件下易被羥基取代,生成羥基葉綠素的衍生物。葉綠素a衍生物在加熱條件下發(fā)生異構化,形成葉綠素a′,而且在經(jīng)過熱燙、微波、蒸汽以及烘烤處理后,異構體葉綠素a′達到最大值,并且葉綠素b′比葉綠素a′更容易生成[17]。

葉綠素本身呈綠色,遇酸后卟啉環(huán)中的鎂離子被氫離子置換,生成褐色的脫鎂葉綠素,這是海藻制品色澤褐變的原因。葉綠素在堿性溶液中水解生成綠色水溶性的脫植基葉綠素,這項化學反應可應用于海藻制品護色工藝,用堿處理保持海藻的色澤鮮綠。

可見,葉綠素分子中的活性位點,如鎂原子、酯鍵以及羰基的α-H在生理代謝過程中或提取分離的理化條件下容易斷裂或失去,形成多種葉綠素的衍生物[18-19]。以葉綠素a為例,其在生理代謝或理化條件下可形成衍生物,葉綠素及衍生物的轉(zhuǎn)化如圖2。

圖2 葉綠素及衍生物結構轉(zhuǎn)化Fig.2 Chemical transformation of chlorophyll and its derivatives

3 葉綠素及其衍生物的生理活性

從海藻中提取分離的葉綠素類衍生物具有多種生理活性[20],可用于食品化妝品以及醫(yī)藥產(chǎn)品等領域。

3.1 抗氧化活性

葉綠素的抗氧化活性和結構中的卟啉環(huán)、植基鏈以及擴展的鍵合雙鍵有關,尤其是卟啉環(huán)結構,它是葉綠素a化合物具有抗氧化活性的必要結構[21]。Lanfer marquez等[22]制備了不同的葉綠素衍生物,并觀察其抗氧化活性,結果發(fā)現(xiàn)葉綠素b的衍生物比葉綠素a的抗氧化活性更強,其分子結構的醛基取代甲基后導致了更強的抗氧化活性。Cho等[23]發(fā)現(xiàn)從滸苔中提取的葉綠素a的衍生物脫鎂葉綠素a具有比海藻多酚更強的抗氧化活性。Cahyan等[24]從褐藻中提取焦脫鎂葉綠酸a(Pyropheophytin a),檢測出其抗氧化活性比化學合成抗氧劑維生素E和BHT(丁基羥基甲苯)更強。Yuan等[13]從紅藻海發(fā)菜中提取分離并鑒定了葉綠素成分,主要包括葉綠素a的衍生物羥基脫鎂葉綠酸、羥基脫鎂葉綠素、脫鎂葉綠素等化合物,并檢測其抗氧化活性,發(fā)現(xiàn)從海發(fā)菜中提取的葉綠素衍生物具有清除DPPH自由基、羥基自由基的活性,表明該類化合物具有較強的抗氧化活性。

3.2 抗炎活性

生命機體的免疫系統(tǒng)在刺激作用下會釋放多種炎癥因子,包括一氧化氮(NO)、前列腺素2(PGE2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-1b(IL-1b)、活性氧(ROS)[25]。海藻中的天然色素具有抗炎活性,其中巖藻黃素的抗炎活性報道較多,葉綠素衍生物的抗炎活性報道較少。從滸苔中分離的脫鎂葉綠酸a能夠抑制12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯(TPA)導致的超氧自由基,從而抑制小鼠巨噬細胞的炎癥反應[26-27]。脫鎂葉綠酸a(PPBa)及其衍生物羥基脫鎂葉綠酸a(HOPPBa)、銅脫鎂葉綠酸a(CuPPBa)能通過抑制炎癥應答，達到抑制腫瘤的作用,分別用致癌誘導劑二甲基苯蒽(DMBA)和12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯(TPA)處理ICR小鼠,建立小鼠皮膚癌模型,然后局部給藥PPBa(劑量160 nmol),治療小鼠和對照組相比,顯著降低小鼠皮膚癌的發(fā)病數(shù)和發(fā)病程度,實驗結果表明，PPBa及其衍生物抗腫瘤機制與抑制炎癥應答降低炎癥因子超氧陰離子產(chǎn)生、抑制白介素活性有關?？墒承院衷宓募状继崛∥锞哂袕姷目寡谆钚?能夠抑制脂多糖誘導的RAW 264.7 巨噬細胞炎性反應,通過抑制iNOS(誘導性一氧化氮合成酶)以及COX-2(環(huán)氧合酶-2)的表達,抑制并清除炎性反應中生成的炎性因子NO,實驗結果表明，發(fā)揮抗炎活性的化學成分為兩種葉綠素衍生物脫鎂葉綠酸a和脫鎂葉綠素a[28]。

3.3 抗腫瘤活性

從紫菜和滸苔中分離純化的脫鎂葉綠素a(Pheophytin a)可用于治療鼠傷寒沙門氏菌相關的致癌作用,因其能抑制鼠傷寒中UMUC基因表達,可用于開發(fā)成預防皮膚癌的化療藥物[29-30]。

脫鎂葉綠酸a可作為光動能化療藥物及輔助藥物的報道很多。Yoon等[31]報道，脫鎂葉綠酸a可作為光動能化療藥物,用于治療人皮膚癌。該制劑對人皮膚癌細胞A431和G361細胞株都有明顯的抑制作用,能分別激活兩種細胞的ERK1/2通路和p38蛋白,發(fā)揮其抑制腫瘤增殖的作用。在移植瘤動物模型中,該制劑表現(xiàn)出強大的自我吞噬以及凋亡作用,從而達到抑制腫瘤的治療效果。Tang等[32]報道，脫鎂葉綠酸a作為光動能用于耐藥性肝癌的治療,其機制是通過抑制p糖蛋白介導的耐藥性JNK激酶活性。

Chypre等[33]報道葉綠素衍生物脫鎂葉綠酸a和紫紅素-18(Purpurin 18)能束縛重組的RANKL,并抑制ELISA反應中的 RANK-RANKL 相互反應,從而抑制模型細胞的 RANKL-依賴活性,阻止RANK-表達前體細胞分化成破骨細胞。這項研究為卟啉環(huán)類小分子化合物作為非肽類治療劑用于靶向治療RANK and RANKL提供了思路。

3.4 抗神經(jīng)活性

脫鎂葉綠酸a是從褐藻中提取分離的一種葉綠素類衍生物,能夠用于治療神經(jīng)性疾病如阿爾茲海默癥,它能促進PC12細胞分化。脫鎂葉綠素a及其類似物Vitamin B12衍生物能促進PC12細胞的神經(jīng)突增生[34],其活性可能與化合物的分子量低有關,低分子量的葉綠素衍生物容易并入細胞內(nèi),從而促進神經(jīng)突增生。

3.5 抗變態(tài)反應

Yoshioka等[35]報道，從褐藻中分離提取的葉綠素c2具有抗變態(tài)反應。純化的葉綠素c2能夠抑制RBL-2H3細胞的脫粒作用,從而產(chǎn)生抗變態(tài)反應效果,但葉綠素a和葉綠素b卻沒有這樣的作用。脫鎂葉綠酸a對某些人群還有導致過敏作用。

3.6 其他生物活性

綠藻中的葉綠素衍生物能促進哺乳動物體內(nèi)二噁英毒素的排泄,可用于防治有機脂類化合物中毒[5]。

條斑紫菜的甲醇提取物含有大量葉綠素衍生物,研究結果表明,此提取物對赤潮微藻的生長具有顯著抑制作用且具有濃度依賴性,同時致使米氏凱倫藻、中肋骨條藻和塔瑪亞歷山大藻等3種赤潮微藻體積變小、運動能力下降、藻細胞出現(xiàn)空洞、細胞破碎和色素減褪等現(xiàn)象。赤潮微藻細胞內(nèi)的葉綠素、可溶性蛋白質(zhì)和多糖含量顯著減低[36]。

4 應用和展望

海藻資源豐富、生長快速且含有大量陸地植物所缺乏的生物活性物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì),這些特性決定了海藻具有巨大的經(jīng)濟開發(fā)價值。海藻的價值不僅體現(xiàn)在食用方面,還廣泛應用于海洋工業(yè)原料、海洋保健藥物、化學化工、飼料肥料、污水凈化、食品加工和美容護膚等諸多方面。海藻中的葉綠素含量豐富、用途廣泛,但由于其對光、熱、酸、堿、酶等理化因素敏感,應用受到限制。因此,用現(xiàn)代科技手段提取并純化葉綠素及其衍生物,并對其結構加以化學修飾,制成結構明確、性質(zhì)穩(wěn)定的葉綠素單體或混合制劑,是葉綠素類新產(chǎn)品的研究熱點,尤其是在功能性食品、醫(yī)藥、化妝品等方面有良好的開發(fā)前景。