鄭倩男,馮長(zhǎng)梅,吳 桐,周紅兵,石松利,*

(1.包頭醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,包頭醫(yī)學(xué)院蒙中藥性物質(zhì)與功能研究所,內(nèi)蒙古包頭 014060; 2.安徽省榮軍醫(yī)院,安徽懷遠(yuǎn) 233400; 3.內(nèi)蒙古北方重工集團(tuán)有限公司醫(yī)院,內(nèi)蒙古包頭 014060)

高脂血癥是體內(nèi)脂類(lèi)代謝紊亂導(dǎo)致血脂水平超過(guò)正常范圍的一種疾病,多由于人們生活方式及飲食習(xí)慣導(dǎo)致[1]。肝臟是人體重要的代謝器官,承載脂類(lèi)、糖、蛋白質(zhì)代謝,過(guò)量攝入高脂食物,會(huì)造成脂肪積存肝細(xì)胞內(nèi),引起肝細(xì)胞腫大、脂肪浸潤(rùn)性炎癥等肝損傷和功能異常[2],因此,如何通過(guò)飲食調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、改善肝損傷的發(fā)生引起人們的廣泛關(guān)注。油脂作為人類(lèi)三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一,是必需氨基酸的來(lái)源和溶質(zhì)性維生素的載體,其攝入量和脂肪酸構(gòu)成對(duì)人體血脂水平的變化有很大影響[3]。大量研究表明植物油中的不飽和脂肪酸具有降血脂、預(yù)防脂肪肝等作用[4-6],也因此天然植物油成為降血脂和改善肝損傷的研究熱點(diǎn)。

扁桃屬植物約52～53個(gè)種,廣泛分布于世界各地。扁桃仁中高含量的單不飽和脂肪酸對(duì)高脂血癥患者的血脂和載脂蛋白水平有良好的調(diào)節(jié)作用[7],當(dāng)扁桃作為食物,有助于維護(hù)健康的血脂水平[8]、提高抗氧化能力[9]和緩解肝損傷[10]。本實(shí)驗(yàn)組研究的是蒙古高原特有的阿拉善荒漠種——蒙古扁桃(Amygdalusmongolica),蒙名烏蘭-布衣勒斯,隸屬薔薇科扁桃屬,是具有地區(qū)特色的中蒙藥資源[11-12]。蒙古扁桃以種仁入藥,前期研究表明:蒙古扁桃種仁富含總黃酮、蛋白質(zhì)、粗脂肪、酚類(lèi)、黃酮、有機(jī)酸、多糖、α-維生素E等營(yíng)養(yǎng)和藥用成分[13-16];含油率量高達(dá)40%以上,其主要成分是以油酸和亞油酸為主的不飽和脂肪酸,理化性質(zhì)優(yōu)良[17];重金屬含量較低,在急性毒理實(shí)驗(yàn)中尚未見(jiàn)明顯的中毒癥狀[18];蒙古扁桃水煎液及其石油醚提取物具有調(diào)節(jié)血脂和增強(qiáng)抗氧化作用[19-21]。然而其對(duì)由高脂血癥引起的肝臟損傷的機(jī)制尚不明確,通過(guò)飼喂高脂飼料誘導(dǎo)建立大鼠高脂血癥模型,較系統(tǒng)的探討了蒙古扁桃油對(duì)受試模型組的臟器系數(shù)、肝臟組織的脂質(zhì)過(guò)氧化作用,并對(duì)肝臟病理切片進(jìn)行觀察,以期對(duì)蒙古扁桃油的保護(hù)肝臟作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),為更廣泛利用蒙古扁桃油資源和開(kāi)發(fā)新品種的植物油提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Wistar大鼠 SPF級(jí),雄性,體質(zhì)量(90±20) g,由內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供,生產(chǎn)許可證書(shū):SCXK(蒙)2002-0001,飼養(yǎng)條件:室溫(25±2) ℃。相對(duì)濕度55%±2%。高脂飼料:基礎(chǔ)飼料77.4%、豬油10%、蛋黃粉10%、膽固醇2%、豬膽鹽0.5%、丙硫氧嘧啶0.1%;蒙古扁桃 蒙古扁桃采摘于內(nèi)蒙古阿拉善雅布賴戈壁,經(jīng)內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院石松利教授鑒定為薔薇科植物蒙古扁桃(Amygdalusmongolica)的干燥成熟種子;總膽固醇(TC)試劑盒(批號(hào):AUZ2732)、甘油三酯(TG)試劑盒(批號(hào):AUZ1433)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒(批號(hào):AUZ2822)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒(批號(hào):AUZ2994) 美國(guó)貝克曼公司;丙二醛(MDA)試劑盒(批號(hào):20150505)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號(hào):20150506)、谷胱甘肽(GSH)試劑盒(批號(hào):20150503) 南京建成生物工程研究所。石油醚(分析純) 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；特級(jí)初榨橄欖油 山東魯花集團(tuán)有限公司，基礎(chǔ)飼料 北京科澳協(xié)力飼料有限公司；蛋黃粉(批號(hào):20150310)、膽固醇(批號(hào):20150309) 鄭州龍晨食品添加劑有限公司；豬膽鹽(批號(hào):20150312) 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；丙硫氧嘧啶片(批號(hào):1402F09) 上海朝暉藥業(yè)有限公司。

Trace DSQII氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Thermo Fisher;全自動(dòng)脫帽離心機(jī) GENIUS 5K-D 長(zhǎng)沙鑫奧儀器;Olympus AU640全自動(dòng)生化分析儀 日本奧林巴斯公司;LEICA RM2235 BiOTek酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司;NP-T生物組織自動(dòng)脫水機(jī)、NP-B型生物組織包埋機(jī) 孝感市諾普電子科技有限責(zé)任公司;熒光顯微鏡 ZEISS Microlmaging GmbH37081 Gottingen,X-Cite SERIES120激發(fā)器;照相機(jī) AxioCamMR5。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蒙古扁桃油制備 蒙古扁桃種子放入55 ℃的烘箱中8 h,去雜,去殼,取其種仁粉碎。采用索氏提取器提取蒙古扁桃油,加入一定比例的60～90 ℃石油醚,放置水浴鍋中進(jìn)行提取后,抽濾,濃縮至干,然后將濃縮的溶液放入105 ℃的烘箱中干燥2 h,冷卻后放置4 ℃冰箱中冷藏,靜置后取上清液,即為蒙古扁桃油,備用[22]。

1.2.2 蒙古扁桃的油脂肪酸成分分析 GC條件:TR-35MS色譜柱,進(jìn)樣口溫度250 ℃,載氣流量:1 mL/min,分流比為100∶1,程序升溫,柱箱溫度起始40 ℃,停留1 min,升溫速度20 ℃/min,升溫至280 ℃,停留3 min。MS條件:離子源EI,全掃描,掃描范圍:1～600 amu[22]。

1.2.3 動(dòng)物分組與模型建立 80只Wistar雄性大鼠,以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)一周以適應(yīng)新的生存環(huán)境后,將大鼠隨機(jī)分為8組(見(jiàn)表1),每組10只;除空白對(duì)照組和蒙古扁桃油對(duì)照組給予基礎(chǔ)飼料,其他各組大鼠均供給高脂飼料,建立高脂血癥大鼠模型,于5周后眼眶后靜脈取血測(cè)定血脂水平,與空白對(duì)照組比較,高脂模型組、橄欖油對(duì)照組、蒙古扁桃油組(A:10、B:7.5、C:5、D:2.5 mL/kg)的TC和LDL-C顯著升高說(shuō)明高脂血癥大鼠模型成功建立;從第6周開(kāi)始進(jìn)行灌胃,空白對(duì)照組、高脂模型組給予生理鹽水,各組大鼠均按體質(zhì)量供給實(shí)驗(yàn)樣品(蒙古扁桃油、橄欖油),自由飲水。

1.2.4 動(dòng)物血樣本采集及指標(biāo)測(cè)定 連續(xù)喂養(yǎng)大鼠5周,末次進(jìn)食后禁食12 h,眼眶靜脈叢采血2～3 mL,按照試劑盒方法進(jìn)行操作,檢測(cè)TC、TG、HDL-C、LDL-C的含量。

1.2.5 動(dòng)物肝臟樣本采集及肝臟指數(shù)的計(jì)算 腹主動(dòng)脈放血處死大鼠,觀察其整體形態(tài),取出肝臟組織,同時(shí)稱(chēng)量,肝臟指數(shù)按公式(1)計(jì)算。

式(1)

1.2.6 肝臟勻漿制備及指標(biāo)測(cè)定 取肝臟組織塊在冰冷的生理鹽水中漂洗,除去血液,濾紙拭干,以質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入0.9%生理鹽水,冰水浴條件下,機(jī)械勻漿,制備10%的勻漿液,300 r/min離心10 min,取上清液,按照試劑盒方法進(jìn)行操作,測(cè)肝組織MDA含量、SOD活性、GSH含量。

1.2.7 肝臟病理組織學(xué)檢查 大鼠肝臟摘除后迅速放置4%多聚甲醛24 h后,在梯度酒精(75%、85%、95%、100%)和二甲苯中脫水與透明,浸蠟包埋后,制片(約7 μm厚),切片在二甲苯中脫蠟后,蘇木精-伊紅(HE)染色,脫水,中性樹(shù)膠封片,顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,以x±s(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示,采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行差異顯著性比較,p<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 量效關(guān)系

將不同劑量的蒙古扁桃油組數(shù)據(jù)的均值導(dǎo)入Origin 8.5軟件中擬合蒙古扁桃油的量效關(guān)系曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒙古扁桃油的脂肪成分分析

蒙古扁桃油中含有11種脂肪酸其種類(lèi)多于含6種脂肪酸的橄欖油。蒙古扁桃油中不飽和脂肪酸占總量的76.66%,其中油酸占23.81%,亞油酸占47.11%。飽和脂肪酸以棕櫚酸為主,SFA的含量為22.16%(見(jiàn)表2);橄欖油中不飽和脂肪酸占總量的80.19%,其中油酸占67.39%,亞油酸占12.0%。飽和脂肪酸以棕櫚酸和硬脂酸為主,含量分別為10.56%、2.63%(見(jiàn)表2)。

表2 蒙古扁桃油中脂肪酸組成Table 2 Fatty acid composition of Amygdalus mongolica oil

不飽和脂肪酸分為單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸,兩者均能促進(jìn)血清TC、TG和LDL-C下降,已證實(shí)亞油酸具有調(diào)節(jié)體脂肪儲(chǔ)存及降低血脂的功能[23],油酸有明顯的降脂作用[24]。蒙古扁桃油的不飽和脂肪酸含量略低于橄欖油的不飽和脂肪酸,然多不飽和脂肪酸占不飽和脂肪酸的比例遠(yuǎn)大于橄欖油的,亞油酸為人體自身不能合成的必需脂肪酸。因此,蒙古扁桃油可作功能性保健品進(jìn)行開(kāi)發(fā)。

2.2 蒙古扁桃油對(duì)高脂血癥大鼠血脂水平的影響

由表3可知,給藥干預(yù)5周后,與空白對(duì)照組比較,蒙古扁桃油對(duì)照組血清TC、LDL-C的含量升高不顯著,說(shuō)明蒙古扁桃油不影響血脂水平;正常機(jī)體通過(guò)血中脂類(lèi)的利用和轉(zhuǎn)化、貯存之間的動(dòng)態(tài)關(guān)系來(lái)維持一定的血脂水平,而高脂成分的攝入可以打破這種平衡,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高脂飼料喂養(yǎng)法建立試驗(yàn)性高脂血癥大鼠模型。高脂飼料喂食10周,高脂模型組TC、LDL-C含量極顯著高于空白對(duì)照組(p<0.01),表明本試驗(yàn)建立的高脂血癥模型確實(shí)可信,同時(shí)印證長(zhǎng)期高脂膳食可以導(dǎo)致高脂血癥的形成。

表3 蒙古扁桃油對(duì)高脂血癥大鼠血脂水平的影響(x±s,n=10)Table 3 Effect of Amygdalus mongolica oil on serum lipid(x±s,n=10)

與高脂模型組比較,10 mL/kg蒙古扁桃油組的TC和LDL-C的含量極顯著降低(p<0.01),7.5 mL/kg蒙古扁桃油組的TC和LDL-C的含量顯著降低(p<0.05或p<0.01),5.0 mL/kg和2.5 mL/kg蒙古扁桃油的TC和LDL-C的含量降低不顯著。說(shuō)明隨著劑量的增加,蒙古扁桃油降低TC、LDL-C含量越顯著,即給藥劑量與效果呈正效關(guān)系;在指標(biāo)TC和LDL-C方面,10 mL/kg蒙古扁桃油組與橄欖油對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異,說(shuō)明蒙古扁桃油和橄欖油具有相似的降血脂作用。

2.3 不同劑量蒙古扁桃油對(duì)大鼠肝臟指數(shù)的影響

肉眼檢查發(fā)現(xiàn)(見(jiàn)圖1),空白對(duì)照組肝臟體積及質(zhì)量均在正常范圍,表面光滑,色紅潤(rùn)有光澤,質(zhì)韌富有彈性。高脂模型組肝臟體積較空白對(duì)照組均有所增大,質(zhì)量增加,肝包膜緊張,表面淡黃,肝緣變鈍,觸之較對(duì)照組略軟相對(duì)彈性較差,切面淡黃色有油膩感,呈典型脂肪肝形態(tài)。與高脂模型組相比,給藥組顏色及組織彈性介于高脂模型組與空白對(duì)照組之間,均有不同程度的變化。

圖1 肝臟直觀形態(tài)Fig.1 Macroscopic morphology of the liver

臟器系數(shù)變化一般反映臟器的腫大、充血、增生肥大、萎縮等,是損傷較為敏感的指標(biāo)[25]。由表4可知,與空白對(duì)照組比較,飼喂基礎(chǔ)飼料-蒙古扁桃油對(duì)照組肝系數(shù)顯著升高(p<0.05)。說(shuō)明高劑量蒙古扁桃油可誘導(dǎo)大鼠肝臟病變;研究表明高脂飼料喂養(yǎng)大鼠可使其肝臟系數(shù)增大[25],與空白對(duì)照組比較,高脂模型組肝系數(shù)極顯著升高(p<0.01),符合高脂飲食造成的肝臟脂肪堆積;與高脂模型組比較,10和7.5 mL/kg蒙古扁桃油組大鼠的肝系數(shù)顯著降低(p<0.05)。5.0和2.5 mL/kg蒙古扁桃油組極顯著性降低(p<0.01)。說(shuō)明不同劑量的蒙古扁桃油組都能很好的降低肝系數(shù),尤其是低劑量蒙古扁桃油效果更佳;5.0和2.5 mL/kg蒙古扁桃油組肝系數(shù)與橄欖油對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異,說(shuō)明低劑量的蒙古扁桃油和橄欖油具有相似的降低肝系數(shù)作用。

表4 蒙古扁桃油對(duì)大鼠肝臟指數(shù)的影響(x±s,n=10)Table 4 Effect of Amygdalus mongolicaoil on liver index(x±s,n=10)

2.4 蒙古扁桃油對(duì)高脂血癥大鼠肝臟組織MDA、SOD、SOD/MDA和GSH影響

肝臟是物質(zhì)合成與代謝、能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換的重要樞紐[26],其自身抗氧化能力高低與肝臟對(duì)脂類(lèi)的合成與代謝密切關(guān)系。MDA是生物體內(nèi)氧化反應(yīng)產(chǎn)生的代謝物,其含量與與生物體內(nèi)過(guò)氧化的程度呈正相關(guān),組織中MDA的增加可損傷肝細(xì)胞,間接反映肝臟受到損傷的程度[27-28]。SOD是人體重要的抗氧化物酶,能夠抵抗脂質(zhì)過(guò)氧化物及其中間產(chǎn)物對(duì)機(jī)體的損傷[29];在細(xì)胞中,GSH作為抗氧化劑主要發(fā)揮清除體內(nèi)自由基、抗氧化及調(diào)節(jié)物質(zhì)作用[30];兩者共同阻止脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)所致的肝細(xì)胞損傷。

表5 蒙古扁桃油對(duì)高脂血癥大鼠肝臟組織MDA、SOD、SOD/MDA和GSH影響(x±s,n=10)Table 5 Effect of Amygdalus mongolica oil on the activities of MDA,SOD,SOD/MDA and GSH in liver of rats(x±s,n=10)

與空白對(duì)照組比較,飼喂基礎(chǔ)飼料-蒙古扁桃油對(duì)照組的MDA、SOD、SOD/MDA升高不顯著,GSH降低也不顯著。表明10 mL/kg蒙古扁桃油對(duì)肝臟無(wú)顯著的影響;與空白對(duì)照組比較,高脂模型組大鼠肝臟組織的MDA含量極顯著升高,SOD/MDA比值極顯著下降(p<0.01)。說(shuō)明高脂飲食導(dǎo)致肝臟損傷;與高脂模型組比較,10 mL/kg蒙古扁桃油組大鼠肝臟組織MDA含量極顯著降低(p<0.01),SOD/MDA、GSH含量極顯著升高(p<0.01),SOD含量顯著升高(p<0.05)。7.5 mL/kg蒙古扁桃油組大鼠肝臟組織MDA含量極顯著降低(p<0.01),SOD/MDA顯著升高(p<0.05)。5.0 mL/kg蒙古扁桃油組大鼠肝臟組織MDA含量極顯著降低(p<0.01),SOD/MDA極顯著升高(p<0.01)。2.5 mL/kg蒙古扁桃油組大鼠肝臟組織MDA含量極顯著降低(p<0.01),SOD、MDA顯著升高(p<0.05),SOD/MDA極顯著升高(p<0.01)。說(shuō)明蒙古扁桃油降低MDA含量,同時(shí)對(duì)提高SOD、GSH活性的作用具有劑量選擇性;10 mL/kg蒙古扁桃油組與橄欖油對(duì)照組相比,MDA含量變化不顯著,說(shuō)明蒙古扁桃油與橄欖油抵抗肝臟損傷作用相似。

2.5 蒙古扁桃油對(duì)大鼠肝臟病理變化的影響

空白對(duì)照組肝細(xì)胞排列成整齊規(guī)則的細(xì)胞條索,以中央靜脈為中心呈輻射狀排列,肝竇清晰可見(jiàn),未見(jiàn)肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴,無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);高脂模型組肝索增寬排列較紊亂,肝血竇變窄甚至消失,肝小葉內(nèi)可見(jiàn)大片甚至彌漫性脂肪變性的肝細(xì)胞,病變以中央靜脈周?chē)顬槊黠@。肝細(xì)胞腫脹呈多邊形,細(xì)胞核受脂滴擠壓偏向細(xì)胞一側(cè);各給藥小組肝細(xì)胞索排列不同程度的趨于規(guī)則、整齊,肝血竇受擠壓程度有所減輕趨勢(shì),脂變肝細(xì)胞數(shù)目減少,胞漿內(nèi)脂滴減少或消失,尤其是2.5 mL/kg蒙古扁桃油組肝小葉體積及形態(tài)更接近正常(見(jiàn)圖2)。

圖2 各組肝臟HE染色石蠟切片圖(×100)Fig.2 High fat diet induced hepatic steatosis(×100)

2.6 量效關(guān)系及相關(guān)參數(shù)

擬合蒙古扁桃油的量效關(guān)系(見(jiàn)圖3)得到函數(shù)關(guān)系見(jiàn)表6),綜合分析各劑量組對(duì)TC、LDL-C、MDA的效應(yīng)變化:隨著劑量的逐漸增加,TC、LDL-C含量降低越明顯,MDA含量升高越明顯。

圖3 蒙古扁桃油劑量變化與TC、LDL-C、MDA值的量效關(guān)系Fig.3 The relationship between dosage change of Amygdalus mongolica oil and values of TC,LDL-C,MDA

表6 蒙古扁桃油劑量變化與TC、LDL-C、MDA值的函數(shù)關(guān)系Table 6 The function relationship between dosage change ofAmygdalus mongolica oil and values of TC,LDL-C,MDA

量效關(guān)系是在不同的劑量下產(chǎn)生不同的效果的變化規(guī)律,通常是在一定的劑量范圍內(nèi),效果隨著劑量的增加而增加或降低。本試驗(yàn)通過(guò)曲線擬合,得出TC、LDL-C和MDA與蒙古扁桃油劑量Y的經(jīng)驗(yàn)方程,從而可以預(yù)測(cè)2.5 mL/kg≤Y≤10 mL/kg范圍內(nèi)TC、LDL-C和MDA所能達(dá)到的理論值,該理論值可作為蒙古扁桃油劑量確定提供參考依據(jù)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用高脂飲食誘導(dǎo)大鼠高脂血癥模型,比較蒙古扁桃油與橄欖油的成分、對(duì)高脂血癥大鼠降血脂作用以及肝臟功能的影響。結(jié)果顯示:蒙古扁桃油比橄欖油富含F(xiàn)UFA。相同劑量的蒙古扁桃油比橄欖油降血脂作用更突出。5.0和2.5 mL/kg蒙古扁桃油組與橄欖油抑制肝臟指數(shù)下降作用相似。通過(guò)對(duì)大鼠肝臟組織的檢測(cè)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)蒙古扁桃油能夠降低肝臟組織MDA水平(p<0.05),同時(shí)提高SOD、GSH的活力(p<0.05)。10 mL/kg蒙古扁桃油組與橄欖油抗肝臟損傷相似,并且隨著劑量越低,蒙古扁桃油抵抗肝臟損傷越顯著。肝臟HE染色表明蒙古扁桃油能保護(hù)肝臟,低劑量效果更優(yōu)。擬合量效關(guān)系曲線顯示:TC、LDL-C與劑量呈負(fù)效關(guān)系,MDA與劑量呈正效關(guān)系。研究表明蒙古扁桃油富含不飽和脂肪酸具有降血脂作用,可能通過(guò)增強(qiáng)肝臟組織抗氧化酶和抗氧化劑的活力,有效發(fā)揮肝臟修復(fù)高脂血癥肝臟組織的能力,可作為功能食用油輔助高脂血癥和脂肪肝的治療。