韋豪華,張紅玲,李興太

(大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連 116600)

線(xiàn)粒體(Mitochondrion,MT)作為真核細(xì)胞中最重要的細(xì)胞器之一,具有提供能量、產(chǎn)生活性氧(Reactive oxygen species,ROS)及調(diào)控細(xì)胞凋亡三大生物學(xué)功能,在細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、凋亡和衰老的過(guò)程中,發(fā)揮著十分重要的作用[1],其不僅作為生命活動(dòng)的樞紐和核心,同時(shí)也是活性氧(ROS)的主要來(lái)源和自由基損傷最敏感的靶部位,而這些ROS又與健康長(zhǎng)壽有著十分密切的關(guān)系[2-4]。許多文獻(xiàn)表明,MT的功能狀態(tài)在很大程度上決定了細(xì)胞的生死存亡[5]。MT功能紊亂被證實(shí)和許多人類(lèi)常見(jiàn)疾病相關(guān),如糖尿病、心臟病、腫瘤、神經(jīng)退行性改變和衰老等[6]。另外,ROS水平的失調(diào)是引起MT發(fā)生損傷的主要途徑之一[7]。ROS由機(jī)體的正常耗氧如呼吸及某些細(xì)胞所介導(dǎo)的免疫功能連續(xù)產(chǎn)生[8],ROS的生成與清除(由抗氧化酶和抗氧化劑)之間保持平衡(氧化還原平衡)對(duì)健康具有十分重要的意義[9]。在線(xiàn)粒體自由基衰老理論中[10],這些ROS是蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸損傷的主要原因[11]。此外,研究表明MT與癌癥之間有著密切的聯(lián)系。ROS對(duì)調(diào)節(jié)正常細(xì)胞過(guò)程很重要,其過(guò)量或不足所致的氧化還原失衡是疾病發(fā)病機(jī)制的誘因,包括癌癥的發(fā)生和進(jìn)展,ROS與細(xì)胞氧化應(yīng)激被認(rèn)為是癌癥發(fā)生的誘導(dǎo)物[12]。對(duì)于如何清除與調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體活性氧對(duì)保護(hù)MT具有十分重要的意義,尋求更加有效且天然的抗氧化劑與研發(fā)防癌保健產(chǎn)品也成為了研究的熱門(mén)與重點(diǎn)。

刺參是海參的一種,刺參(Stichopusjaponicus)屬棘皮動(dòng)物門(mén)、海參綱、刺參科生物,被譽(yù)為參中之冠。本草中記載“刺參有補(bǔ)腎益精、養(yǎng)血潤(rùn)燥、止血消炎之功效”。刺參多產(chǎn)于中國(guó)的山東和大連。其含多糖、皂苷、膠原蛋白、多肽和氨基酸等成分[13]。刺參多糖是刺參的重要活性成分之一,刺參多糖主要存在于刺參的體壁中,研究表明[14]刺參多糖中的單糖以巖藻糖、氨基半乳糖、葡萄糖醛酸為主,其對(duì)調(diào)控人體生理功能等具有非常重要的意義,主要表現(xiàn)在抗腫瘤、抗凝血、抗血栓、抗血脂、抗氧化以及增強(qiáng)免疫等活性作用[15]。而目前對(duì)刺參多糖在各方面的藥理作用研究比較廣泛,但是對(duì)其在MT保護(hù)方面的研究與報(bào)道比較少。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

清潔級(jí)SD雄性大鼠(合格證號(hào):2007 6A007) 6只,六周齡,體重190～220 g,由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;干刺參 購(gòu)自大連曉芹食品有限公司;木瓜蛋白酶(Papain Papaya,80萬(wàn)U/g) 北京索萊寶科技有限公司;氯化十六烷基吡啶(CPC) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;硫代巴比妥酸(TBA)、1,1,3,3-四乙氧基丙烷(TEP) 美國(guó)Sigma公司;菲洛嗪(Ferrozine) 英國(guó)Alfa Aesar公司;氮藍(lán)四唑(NBT)、牛血清白蛋白 荷蘭Boehringer Mannheim 公司;考馬斯亮藍(lán)G-250、吩嗪硫酸甲酯(PMS) 美國(guó)Fluka 公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris) 美國(guó)Gibco公司;N-(2-羥乙基)哌嗪-N′-2-乙烷磺酸(HEPES) 德國(guó)Merck公司;三氯乙酸(TCA)、乙酸鈉、半胱氨酸鹽酸鹽 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;還原型輔酶I(NADH) 上海源葉生物科技有限公司;乙二胺四乙酸(EDTA) 天津市化學(xué)試劑一廠;2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

UV-24520紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司;KQ-50E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;XW-80A旋渦混合器 上海精密實(shí)業(yè)有限公司;DY89-1型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī) 寧波新芝科器研究所;TGL-18M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司;水浴恒溫振蕩器 常州國(guó)華電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SJCP的提取及其多糖含量的測(cè)定 精確稱(chēng)取10 g刺參干粉,加入60 mL丙酮溶液,于4 ℃浸泡24 h,取出揮干。向揮干的刺身干粉中加入1 g木瓜蛋白酶和300 mL 0.1 mol/L的乙酸鈉緩沖液(pH6.0,含EDTA和半胱氨酸鹽酸鹽的濃度為5 mmol/L),置于60 ℃中水浴24 h。取出冷卻后,10000 r/min離心5 min,收集上清液。向上清液中加16 mL 10%的CPC溶液,充分?jǐn)嚢韬箪o置24 h,待分層后在6000 r/min離心20 min,收集沉淀。用20 mL NaCl乙醇溶液(3 mol/L NaCl溶液∶乙醇=100∶15 v/v),將沉淀完全溶解。向溶解液中加入40 mL 95%乙醇溶液,此時(shí)溶液呈紅褐色,充分?jǐn)嚢柚笥? ℃ 靜置過(guò)夜。待溶液分層后便可取出,在6000 r/min離心20 min,離心之后得到粗多糖沉淀,再用80%和95%乙醇溶液清洗該沉淀2～3次后,60 ℃烘干2 h,即可得到SJCP。然后采用硫酸苯酚法[16]測(cè)定SJCP的多糖含量。

1.2.2 肝線(xiàn)粒體的制備 利用差速離心法分離大鼠肝線(xiàn)粒體[17],從處死的大鼠體內(nèi)取出肝臟,用預(yù)冷的生理鹽水將血跡清洗,然后將鼠肝放入預(yù)冷的分離介質(zhì)(含有0.5 mmol/L EDTA、0.25 mol/L 蔗糖、3 mmol/L HEPES,pH7.4)中在勻漿器中進(jìn)行勻漿,結(jié)束后將其放入臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)中于4 ℃,1000×g離心10 min,然后取上清液放入新的離心管中,在12000×g離心10 min,棄上清取沉淀并將沉淀研開(kāi),再加分離介質(zhì)后于12000×g離心10 min,重復(fù)上一步,最后得到的沉淀即為線(xiàn)粒體,加一定分離介質(zhì)制成懸液后于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 丙二醛(MDA)含量的測(cè)定 MDA是線(xiàn)粒體脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物,本實(shí)驗(yàn)采用TBA顯色法對(duì)MDA的含量進(jìn)行測(cè)定[18]。反應(yīng)體系分為調(diào)零管、空白管、對(duì)照管以及樣品管,包含有5 mmol·L-1FeSO4和6 mmol·L-1的維生素C(VC)(空白管不加FeSO4和VC),以及不同濃度(0.003、0.007、0.013、0.027 mg/mL)的SJCP(對(duì)照管不加)和100 μL的線(xiàn)粒體懸液,再用pH7.4、0.1 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液(PBS)補(bǔ)充體積到2 mL,在37 ℃水浴60 min,取出后再加入0.5 mL 20%的TCA結(jié)束反應(yīng),隨后分別倒入離心管后在5000×g條件下離心10 min,結(jié)束后取2 mL上清液,然后再加1 mL 0.67%的TBA,在100 ℃條件下煮沸10 min,調(diào)零管只加3 mL PBS用于調(diào)零,于532 nm處測(cè)定其吸光度A,最后以1,1,3,3-四乙氧基丙烷(TEP)含量作為外標(biāo),回歸后分析計(jì)算MDA的含量。SJCP的作用以對(duì)MDA的抑制率(IR)用公式(1)進(jìn)行計(jì)算。

MDA IR(%)=(MDA含量對(duì)照-MDA含量SJCP)/(MDA含量對(duì)照-MDA含量空白)×100

式(1)

1.2.4 Fe2+的螯合能力 本實(shí)驗(yàn)將試管分為空白、對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照及樣品組,在試管中按順序加入不同濃度的EDTA溶液(0.6 mg·mL-1)或SJCP溶液、0.1 mL 0.375 mmol·L-1FeSO4溶液、0.1 mL 2.25 mmol·L-1Ferrozine,最后均用Hepes緩沖液將體積補(bǔ)充到3 mL,旋渦混勻后,室溫靜置20 min,于562 nm處測(cè)定吸光度A,以EDTA為陽(yáng)性對(duì)照,所得結(jié)果以螯合率表示[19],按公式(2)計(jì)算。

Fe2+螯合率(%)=[(A對(duì)照-ASJCP或EDTA)/A對(duì)照]×100

式(2)

式(3)

1.2.6 羥自由基(·OH)清除能力的測(cè)定 Fenton反應(yīng)體系包含7.5 mmol·L-1硫酸亞鐵、5 mmol·L-1鄰二氮菲、0.2 mmol· L-1PBS和不同濃度的SJCP、1%的H2O2。實(shí)驗(yàn)分成調(diào)零、空白、對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照及樣品管,以BHT為陽(yáng)性對(duì)照,各管在加入H2O2之后開(kāi)始反應(yīng),均放在37 ℃水浴60 min,測(cè)定536 nm處Fe2+-鄰二氮菲復(fù)合物的吸光度值[21]。SJCP對(duì)·OH的清除能力通過(guò)公式(4)計(jì)算。

·OH SR(%)=(A1-A0)/(A2-A0)×100

式(4)

式中,A0為對(duì)照;A1為SJCP或者BHT;A2為空白。

1.2.7 過(guò)氧化氫(H2O2)清除能力的測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和樣品組共三組,SJCP對(duì)H2O2的清除作用根據(jù)Zhao等[22]方法測(cè)定。0.1 mmol·L-1H2O2與1.0 mL不同濃度的SJCP或 0.5 mg/mL的BHT混合,再加入50 μL 3%鉬酸銨、5 mL 2 mol/L硫酸和3.5 mL 1.8 mol/L碘化鉀。配制完成靜置3 min后采用滴定法,用5 mmol·L-1的NaS2O3溶液滴定各組樣品至黃色消失為止,本實(shí)驗(yàn)需記錄滴定前后NaS2O3溶液的體積,得出消耗體積為最終結(jié)果。用BHT作為陽(yáng)性對(duì)照,最后結(jié)果用清除率表示,按公式(5)計(jì)算:

H2O2SR(%)=[(V對(duì)照-VSJCP或BHT)/V對(duì)照]×100

式(5)

1.2.8 還原力的測(cè)定 以BHT為陽(yáng)性對(duì)照,取不同濃度的SJCP于試管中,加入0.5 mL 0.2 mol/L、pH6.6的PBS緩沖液和0.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液,加去離子水補(bǔ)足至1.5 mL,于50 ℃水浴20 min后取出冷卻,再加入1.0 mL 10% TCA,5000 r/min離心5 min,然后取上清1.5 mL,再分別加入0.1 mL 0.1%的FeCl3溶液,最后加水補(bǔ)足至2 mL,漩渦混勻后靜置10 min,測(cè)定700 nm處吸光值,吸光度越大,則表示其還原力越強(qiáng)[23]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 SJCP的多糖含量分析

刺參多糖作為刺參的有效活性成分之一,具有抗腫瘤、抗氧化等非常重要的藥理作用。因此,其有可能參與機(jī)體的能量代謝,而且刺參多糖的含量高于其他海參種類(lèi),多糖組分中巖藻糖和硫酸基的比例亦高于其他海參,硫酸化程度較大,硫酸基的含量占多糖含量的30%左右[24],本實(shí)驗(yàn)以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品,采用硫酸苯酚法[16]來(lái)測(cè)定SJCP的多糖含量,回歸后得到的多糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=0.0711x-0.00007,由此算出SJCP的多糖含量為30%,而考慮到硫酸基的影響,實(shí)際上SJCP中的多糖含量約為60%左右。

2.2 SJCP對(duì)鼠肝線(xiàn)粒體MDA生成的影響

MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化(Lipid Peroxidation,LPO)的最終產(chǎn)物,脂質(zhì)在Fe2+的作用下會(huì)產(chǎn)生MDA,其在體外會(huì)影響MT呼吸鏈復(fù)合物及MT內(nèi)關(guān)鍵酶活性。另外,LPO可通過(guò)對(duì)線(xiàn)粒體膜、膜蛋白及線(xiàn)粒體DNA的作用導(dǎo)致線(xiàn)粒體損傷,而線(xiàn)粒體損傷及功能障礙與很多疾病有關(guān)[25]。由表1可知,用Fe2+/Vit C 系統(tǒng)處理鼠肝MT后,產(chǎn)物MDA含量明顯增多,SJCP對(duì)MDA生成的抑制作用隨著其質(zhì)量濃度的增加逐漸增強(qiáng)。當(dāng)達(dá)到一定的質(zhì)量濃度即在SJCP濃度為0.027 mg/mL時(shí),其抑制率較高達(dá)到48.36%,與對(duì)照組進(jìn)行比較存在極顯著性差異(p<0.01),說(shuō)明SJCP具有一定的抗氧化活性,能夠在一定程度上抑制MT發(fā)生LPO。丙二醛(MDA)是有機(jī)化合物,并且是氧化應(yīng)激的標(biāo)記物。ROS降解多不飽和脂質(zhì),形成MDA[26]。在后面的實(shí)驗(yàn)中也證明了SJCP能夠清除一些主要的ROS自由基,而且SJCP與金屬螯合能力是顯著的,具有良好的抗氧化能力,也很好地說(shuō)明了SCJP對(duì)LPO的抑制作用。

表1 SJCP對(duì)鼠肝線(xiàn)粒體MDA生成的影響Table 1 Effect of SJCP on MDA generation

2.3 SJCP對(duì)Fe2+螯合能力的影響

鐵和過(guò)氧化氫反應(yīng)生成羥自由基后所進(jìn)行的一系列反應(yīng)稱(chēng)之為Fenton反應(yīng)。Fe2+螯合力測(cè)定的原理則是在這個(gè)反應(yīng)之前,通過(guò)金屬螯合會(huì)使過(guò)渡金屬酶的濃度下降,阻止ROS的過(guò)量產(chǎn)生,防止脂質(zhì)過(guò)氧化的發(fā)生。所以,Fe2+螯合力測(cè)定在抗氧化性能測(cè)定中十分重要。由表2可知,隨著SJCP質(zhì)量濃度的增加,其對(duì)Fe2+的螯合率也隨之增大,在SJCP質(zhì)量濃度為0.033 mg/mL時(shí),其吸光度與對(duì)照組相比有顯著性差異(p<0.05),此時(shí)其螯合率僅為6.53%;當(dāng)SJCP質(zhì)量濃度為0.333 mg/mL時(shí),其吸光度與對(duì)照組相比有極顯著性差異(p<0.01),此時(shí)螯合率可達(dá)到30.86%,而與EDTA對(duì)Fe2+的螯合率相比則相對(duì)較弱,說(shuō)明SJCP具有一定的螯合能力。金屬螯合又是一種重要的抗氧化特性[27-28]。金屬螯合能力是極顯著(p<0.01)的,其減少了在LPO中起催化作用的過(guò)渡金屬的濃度。另外,含有以下兩個(gè)或更多個(gè)官能團(tuán)結(jié)構(gòu)的化合物:-OH、-SH、-COOH、-PO3H2、C=O、-NR2、-S-和-O-,是有利的結(jié)構(gòu)-功能構(gòu)型,可顯示出金屬螯合活性[29-30]。而SJCP就含有-OH、C=O、-S-等官能團(tuán),因此具有一定的金屬離子螯合能力。

表2 SJCP對(duì)Fe2+螯合能力的影響Table 2 Effect of SJCP on Fe2+

2.4 SJCP對(duì)的影響

表3 SJCP對(duì)的清除作用Table 3 Scavenging effect of SJCP against

表4 SJCP對(duì)·OH的清除作用Table 4 Scavenging effect of SJCP against

表5 SJCP對(duì)H2O2的清除作用Table 5 Scavenging effect of SJCP against

2.5 SJCP對(duì)還原力的影響

研究表明,物質(zhì)的還原力越強(qiáng),其抗氧化性就越強(qiáng)。在氧化還原反應(yīng)中,物質(zhì)能提供出電子而自身發(fā)生氧化的能力稱(chēng)為還原力,是作為物質(zhì)抗氧化活性的一個(gè)重要表現(xiàn)[36]。在實(shí)驗(yàn)中,通過(guò)還原Fe3+來(lái)測(cè)定SJCP的還原力,吸光度越高還原力越大,由表6可知,SJCP的還原力隨著質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng),但和BHT組相比較弱。另外,還原力大的物質(zhì)可作為良好的電子供體,提供的電子不僅能夠?qū)e3+還原為Fe2+,而且可與自由基結(jié)合使其成為更穩(wěn)定的物質(zhì)[37]。這也是SJCP這種外源性抗氧化劑抑制LPO進(jìn)而保護(hù)MT的可能機(jī)制之一。

表6 SJCP對(duì)還原力的影響Table 6 Effect of SJCP on reducing

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,SJCP能夠在一定濃度范圍內(nèi)很好地抑制線(xiàn)粒體MDA的生成,說(shuō)明其能夠防止機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的發(fā)生。而且SJCP具有一定的Fe2+螯合能力和還原力,更重要的是其能很好地清除3種主要的ROS,并隨著質(zhì)量濃度的增大清除能力也增強(qiáng),但遠(yuǎn)不如BHT強(qiáng),說(shuō)明其具有溫和的抗氧化作用。因此,SJCP可能通過(guò)一定的Fe2+螯合能力和還原力、溫和的抗氧化作用保證機(jī)體的氧化還原平衡,保護(hù)MT進(jìn)而預(yù)防癌癥的發(fā)生。隨著近年來(lái)對(duì)海參研究的深入,發(fā)現(xiàn)海參不僅僅可以作為上等的美味,而且在功能保健及疾病預(yù)防等方面發(fā)揮著重要的作用。刺參多糖作為刺參的重要活性成分之一,其多糖結(jié)構(gòu)特殊,同時(shí)具有許多人工合成類(lèi)藥物所不具備的藥理作用,結(jié)合近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)如何保護(hù)線(xiàn)粒體預(yù)防一些疾病研究的熱度而言,未來(lái)或許可以從保護(hù)MT的角度對(duì)刺參多糖有更深入的研究,從而研發(fā)出能以刺參多糖為主要功能因子的更好防治癌癥等一些疾病的良藥。