蔣慧穎,馬玉仙,曾文治,雷鄭延,周 歡,劉芷君,倪 莉,楊江帆,*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院,中國烏龍茶產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心,福建農(nóng)林大學(xué)茶葉科技與經(jīng)濟研究所,福建福州 350002;2.福州大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)研究所,福建福州 350108)

茶色素是一類以兒茶素為主的茶多酚類化合物經(jīng)酶促氧化或非酶促氧化的植物酚性色素,含多酚類化合物、糖類、氨基酸等多種組分,依顏色可分為茶黃素類、茶紅素類、茶褐素類,是茶葉中的多酚類物質(zhì)在加工過程中,經(jīng)復(fù)雜變化所形成的水溶性氧化產(chǎn)物[1-2]。茶色素具有多方面的健康功效,在醫(yī)藥與食品等領(lǐng)域極具開發(fā)潛力。

肥胖嚴(yán)重危害人體健康,中國已成為全球第一肥胖國家,人數(shù)已超美國[3]。茶葉具有降脂減肥功效,產(chǎn)生作用的有茶多酚、茶色素等物質(zhì)[4-5],即茶黃素、茶紅素與茶褐素也是茶葉中降脂減肥的功能性成分,能降低血液粘度,防治心血管疾病、高血脂以及脂代謝紊亂等疾病[6]。在茶黃素與茶紅素研究方面,Miyata等連續(xù)4周用茶黃素和茶紅素灌胃高脂飲食大鼠發(fā)現(xiàn),其肝臟中膽固醇濃度降低。實驗中,茶紅素能夠加快排泄酸性甾體,通過促進糞便排泄類固醇,從而減少肝臟脂質(zhì)的含量[7]。此外王文祥證明,茶黃素對肥胖大鼠胰島素抵抗具有影響[8]。茶褐素研究方面,普洱茶茶褐素可顯著調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠血清中相關(guān)生化指標(biāo),減少肝臟脂肪堆積,抑制脂肪肝生成[9-10]。四川邊茶茶褐素可明顯降低高血脂小鼠的血脂水平[6]。兩項研究均表明,茶褐素能使高脂飲食實驗鼠血清脂質(zhì)含量水平得以改善,原因之一是其能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶[11]。

腸道內(nèi)正常微生物在平衡人體健康和疾病的過程中起重要作用[12],寄居在腸道內(nèi)的菌群有著十分強大、廣譜的底物降解能力,與肥胖等慢性病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。茶葉被攝入人體后,大多數(shù)活性物質(zhì)無法直接被消化、吸收和利用,這是由于,在茶葉加工過程中,大量單體兒茶素在多酚氧化酶的作用下,發(fā)生氧化聚合等變化,并生成復(fù)雜的聚合態(tài)氧化產(chǎn)物,但人體并不具備相應(yīng)的消化酶,造成一些高分子聚合物的生物利用率不高[13-14],轉(zhuǎn)而進入大腸。目前,茶黃素、茶紅素和茶褐素這些高分子聚合物對高脂飲食大鼠腸道菌群的影響,及是否是茶葉中調(diào)節(jié)高脂飲食大鼠腸道菌群的功能性成分,尚未有所研究。

前人對茶黃素、茶紅素與茶褐素的降脂減肥機理研究主要圍繞生物化學(xué)和細胞生物學(xué)方面展開,而其不易為宿主所消化吸收轉(zhuǎn)而進入到腸道,故本實驗應(yīng)用高通量測序技術(shù),從腸道菌群這個嶄新的角度,對高脂飲食大鼠腸道內(nèi)容物腸道菌群進行生物信息學(xué)分析,探究茶黃素、茶紅素與茶褐素對高脂飲食大鼠腸道菌群的影響,以期為茶葉中調(diào)節(jié)肥胖的功能性成分提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶黃素、茶紅素、茶褐素,食品級 美國Amresco公司;TIANamp Stool DNA Kit糞便基因組DNA提取試劑盒(離心柱型) 天根生化科技(北京)有限公司;生理鹽水(0.9%氯化鈉溶液) 福州市倉山區(qū)好又惠醫(yī)藥商店;SPF級雄性Wistar大鼠 體質(zhì)量(160±20) g,上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司;基礎(chǔ)飼料(3.82 kcal/gm) 福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心;高脂飼料(45% fat,4.73 kcal/gm) 江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司。

-80 ℃超低溫冰箱 青島海爾特種電冰柜有限公司;Sigma 3-18K高速冷凍離心機 德國Sigma公司;AU2700全自動生化分析儀 奧林巴斯(中國)有限公司;TE601-L電子天平 德國賽多利斯公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;高壓蒸汽滅菌鍋 致微(廈門)儀器有限公司;SW-CJ-IFD型凈化工作臺 蘇州凈化;XW-80A振蕩器 上海馳康電子有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物飼養(yǎng) 大鼠5只一籠飼養(yǎng),控制室溫22～26 ℃,室內(nèi)濕度50%～70%,明暗交替條件為12/12 h光照循環(huán)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,按體重以隨機區(qū)組設(shè)計分組法,分為正常對照組(C組)、模型對照組(HF組)、茶黃素組(TF組)、茶紅素組(TR組)和茶褐素組(TB組)共5組,每組各10只。各組均自由飲水?dāng)z食,并于每日9:00依大鼠體重計算灌胃量進行灌胃。飼養(yǎng)飼料及灌胃情況為,C組:基礎(chǔ)飼料+蒸餾水;HF組:高脂飼料+蒸餾水;TF組:高脂飼料+茶黃素;TR組:高脂飼料+茶紅素;TB組:高脂飼料+茶褐素。茶色素的人體推薦量為0.045 g/kg[15],故按照保健食品評審規(guī)范的規(guī)定,選擇不超過人體推薦量30倍的用量,即1.35 g/kg進行灌胃。C組與HF組灌胃相同質(zhì)量的蒸餾水。

1.2.3 脂肪重量的測定 取1.2.2中大鼠的附睪脂肪、腸系膜脂肪與腹膜后脂肪,稱重記錄。

1.2.4 血脂的測定 從1.2.2中大鼠的腹部主動脈收集10～20 mL血液,用高速冷凍離心機,經(jīng)4000 r/min離心后,取上清分裝于5 mL離心管中,利用全自動生化分析儀檢測大鼠血清中高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)的值,計算大鼠動脈粥樣硬化指數(shù)(AI=(TC-HDL-C)/HDL-C)[17]。

1.2.5 腸道內(nèi)容物總DNA提取與腸道菌16S rDNA測序分析 在無菌條件下,取出1.2.2中大鼠的腸道(盲腸及結(jié)腸)內(nèi)容物于15 mL離心管中,用生理鹽水按1∶10的體積比進行稀釋,振蕩器振蕩7 min以上至其均勻,得到腸道內(nèi)容物樣品。按試劑盒說明書步驟,提取其微生物總DNA。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度與濃度,取適量樣品于離心管中,用無菌水稀釋至1 ng/μL。以稀釋后的DNA為模板,依16S rDNAV3-V4區(qū)序列,用帶Barcode的特異引物(引物序列為515F 5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′和806R 5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)進行PCR擴增。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行等量混樣,使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,對目的條帶使用膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構(gòu)建,將構(gòu)建好的文庫經(jīng)Qubit和Q-PCR定量,文庫合格后,運用HiSeq2500 PE250進行上機測序。

將各組的樣品數(shù)據(jù)從下機數(shù)據(jù)中拆分出來,截去Barcode與引物序列之后,以FLASH拼接樣品reads,過濾成高質(zhì)量Tags數(shù)據(jù)。進行Tags截取與長度過濾,處理去除嵌合體序列,得到最終的有效數(shù)據(jù)。使用Uparse軟件對樣品的全部Effective Tags進行聚類,默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類成為操作單元(OTUs)?；跇悠稯TU結(jié)果,使用Qiime軟件(Version 1.7.0),計算樣本ACE指數(shù)與chao指數(shù),分析其物種豐度;計算Shannon指數(shù),表示其alpha多樣性。同時選取OTUs的代表性序列,用Mothur方法與SILVA的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫對其進行物種注釋且獲得分類學(xué)信息,在phylum(門)與genus(屬)分類水平上,統(tǒng)計樣本的群落結(jié)構(gòu)組成并進行分析[18-23]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理組大鼠肥胖相關(guān)指標(biāo)的比較

2.1.1 不同處理組大鼠體重與Lee’s指數(shù)的比較 體重是直觀反映大鼠肥胖的指標(biāo),而Lee’s指數(shù)是依成年大鼠體重(g)及體長(cm)來評價成年大鼠肥胖程度,指數(shù)越大,肥胖程度越高[24]。實驗前各組大鼠體重并無顯著差異(p>0.05),結(jié)束時HF組大鼠體重與C組相比,極顯著升高(p<0.01),TF組、TR組和TB組大鼠體重雖高于C組,但較HF組顯著下降(p<0.05)。分析發(fā)現(xiàn),HF組大鼠Lee’s指數(shù)極顯著高于C組(p<0.01),而TF組、TB組和TR組較C組高,且與HF組存在極顯著差異(p<0.01)(如圖1)。即,高脂飲食的同時灌胃茶黃素、茶紅素與茶褐素能抑制大鼠體重及Lee’s指數(shù)增長。

圖1 各組大鼠體重變化與Lee’s指數(shù)Fig.1 Variation of body weight of rats and Lee’s index in rats注:C組與HF組比較,#p<0.05差異顯著,##p<0.01差異極顯著;TF、TR、TB組三組與HF組比較,*p<0.05差異顯著,**p<0.01差異極顯著。表1、圖2、圖3、圖5同。

2.1.2 不同處理組大鼠脂肪重量的比較 脂肪組織是能量儲存的重要器官,而大鼠體重與脂肪組織的重量密不可分。實驗中,高脂飼料誘導(dǎo)HF組大鼠體內(nèi)總脂肪堆積相比C組,極顯著升高(p<0.01),其腹膜后脂肪、腸系膜脂肪以及附睪脂肪重量均為最高;而TF組、TR組和TB組雖比C組堆積更多,但比HF組均顯著減少(p<0.05或p<0.01)(如圖2)。說明茶黃素、茶紅素與茶褐素能減少高脂飲食大鼠體內(nèi)脂肪堆積。

圖2 各組大鼠脂肪重量對比Fig.2 Variation of comparison of fat weight in rats

2.1.3 不同處理組大鼠血脂的比較 大鼠血脂主要包括總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)以及甘油三酯(TG)等,含量過高會引起冠心病、動脈粥樣硬化等肥胖相關(guān)疾病,而動脈粥樣硬化指數(shù)(AI)為醫(yī)學(xué)中用以觀察動脈硬化程度的指標(biāo),依TC與HDL-C,數(shù)值越大程度越高。表1說明,HF組大鼠TC和HDL-C較C組高,故AI指數(shù)也較C組極顯著升高(p<0.01),而其余各組TC、HDL-C含量與AI指數(shù)均較HF組有所下降(p<0.05或p<0.01)。此外,HF組較C組的TG和LDL-C含量極顯著升高(p<0.01),其余組雖較C組有所升高,但較HF組均極顯著降低(p<0.01)。即從血脂水平表明,茶黃素、茶紅素與茶褐素能調(diào)節(jié)高脂飲食大鼠體內(nèi)血脂。

表1 大鼠AI指數(shù)及TG、TC、HDL-C、LDL-C含量比較Table 1 Atherosclerosis index and content of TG，TC，HDL-C，LDL-C in rats

綜上說明,茶黃素、茶紅素及茶褐素能抑制高脂飲食大鼠體重、Lee’s指數(shù)與脂重的增長,調(diào)節(jié)血脂,具有降脂減肥功效。

2.2 不同處理組大鼠腸道內(nèi)容物腸道菌群物種豐度及多樣性分析

結(jié)合ACE指數(shù)和chao指數(shù)對各組大鼠腸道內(nèi)微生物的物種豐度開展評估(如圖3)。HF組的ACE指數(shù)與chao指數(shù)均極顯著低于C組(p<0.01),而TF組、TR組和TB組雖低于C組,但高于HF組,且TR組與TB組差異顯著(p<0.05)。此外,以反映alpha多樣性的Shannon指數(shù),來估算大鼠腸道中微生物多樣性可知,各組大鼠Shannon指數(shù)均低于C組,且HF組的Shannon指數(shù)達到極顯著(p<0.01),但TF組、TR組和TB組的Shannon指數(shù)較HF組相對更高,其中TR組和TB組顯著高于HF組(p<0.05)。以上分析表明,茶黃素、茶紅素和茶褐素能抑制高脂飲食導(dǎo)致的腸道菌群物種豐度降低,并能抑制菌群多樣性的降低。

圖3 各組大鼠腸道內(nèi)容物腸道菌群的物種豐度及多樣性Fig.3 Bacterial abundance and Bacterial diversity of gut microbiota in rats

2.3 不同處理組大鼠腸道內(nèi)容物腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 大鼠腸道內(nèi)容物腸道菌群在門水平上的相對豐度 基于RDP與BLAST同源性序列比對聚類的方法,五組大鼠在門水平上主要劃分為:厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、柔膜菌門(Tenericutes)、放線菌門(Actinobacteria)、脫鐵桿菌門(Deferribacteres)等,以及部分無法確定分類地位的細菌(unclassifiedbacteria)或相對豐度較低的細菌(如圖4)。Firmicutes、Bacteroidetes和Proteobacteria占到測序序列總數(shù)的96.4%。結(jié)果表明,高脂飲食使大鼠腸道內(nèi)的Firmicutes、Proteobacteria與Actinobacteria升高,Bacteroidetes和Verrucomicrobia減少,而高脂飲食的同時,攝入茶黃素、茶紅素和茶褐素可對改善大鼠腸道內(nèi)的這一趨勢起作用。

圖4 大鼠腸道內(nèi)容物腸道菌群在門水平上的相對豐度Fig.4 Relative abundance of gut microbiota in rats at the revel of phylum

大鼠腸道內(nèi)Firmicutes與Bacteroidetes是門水平上相對豐度最高的兩個菌門,共同促進宿主吸收或儲存能量,Firmicutes相對豐度與機體肥胖具有顯著的正相關(guān)性,而Bacteroidetes則呈顯著負相關(guān)態(tài)勢,這在許多文獻中已有報道[25-28]。研究結(jié)果表明,茶黃素、茶紅素和茶褐素能調(diào)節(jié)高脂飲食大鼠Firmicutes和Bacteroidetes,即HF組大鼠Firmicutes的相對豐度最高,Bacteroidetes最低,且其體內(nèi)一些肥胖相關(guān)指標(biāo)亦最高,而TF組、TR組和TB組大鼠腸道內(nèi)Firmicutes有所升高,Bacteroidetes得以下降,與HF組相比起到一定的抑制作用。Firmicutes與Bacteroidetes的比值(F/B值)是衡量肥胖的指標(biāo),肥胖個體的F/B值較正常個體高[29-30]。實驗中,C組的F/B值顯著低于HF組(p<0.05),TR組與TB組高于C組,但顯著低于HF組(p<0.05),TF組雖不顯著,但亦較HF組低。說明茶黃素、茶紅素與茶褐素能降低高脂飲食大鼠F/B值,與相關(guān)研究結(jié)果一致[30-31](如圖5)。

圖5 大鼠腸道內(nèi)容物腸道菌群中厚壁菌門與擬桿菌門的相對豐度以及F/B值Fig.5 Relative abundance of Firmicutes and Bacteroidetes and F/B value of gut microbiota in rats

2.3.2 大鼠腸道內(nèi)容物腸道菌群在屬水平上的相對豐度 對大鼠腸道內(nèi)容物腸道菌群從屬水平上進行進一步探究(如圖6)。HF組大鼠乳桿菌屬(Lactobacillus)相對豐度低于C組,而TF組、TR組與TB組的相對豐度雖低于C組,卻高于HF組,說明灌胃茶黃素、茶紅素和茶褐素后高脂飲食大鼠腸道內(nèi)Lactobacillus的相對豐度升高,與Sato等研究結(jié)果一致,研究發(fā)現(xiàn),乳桿菌屬的升高可降低實驗鼠體重與脂肪含量[32-37],表明本研究中的Lactobacillus升高與高脂飲食大鼠體重和脂肪含量的下降或存在關(guān)聯(lián)性。腸道細胞更新所需最大的營養(yǎng)成分是丁酸鹽,而大鼠腸道內(nèi)毛螺菌屬(Lachnospiraceae)豐度的升高會使腸道內(nèi)丁酸鹽含量升高,本研究中Lachnospiraceae相對豐度高低趨勢與類似研究相同[38-39],具體表現(xiàn)為TF組、TR組和TB組大鼠Lachnospiraceae雖較C組下降,但較HF組有所升高,說明茶黃素、茶紅素與茶褐素促進了高脂飲食大鼠腸道內(nèi)Lachnospiraceae相對豐度提高,增加丁酸鹽含量,向腸道細胞供給充足養(yǎng)分,保證腸道正常生理功能,減少血液中細菌抗原載荷量,從而緩解肥胖相關(guān)慢性炎癥[40]?，F(xiàn)有探究發(fā)現(xiàn),瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae)與代謝紊亂存在關(guān)聯(lián),其在肥胖宿主腸道內(nèi)的相對豐度較高[39],本研究中HF組大鼠Ruminococcaceae相對豐度比C組更高,但TF組、TR組與TB組低于HF組,說明茶黃素、茶紅素與茶褐素對高脂飲食大鼠腸道內(nèi)Ruminococcaceae相對豐度的增多有抑制作用。而HF組大鼠腸道內(nèi)的Akkermansia菌較C組呈明顯降低態(tài)勢,TF組、TR組和TB組的相對豐度較C組低但有所回升,說明茶黃素、茶紅素與茶褐素也使高脂飲食大鼠腸道內(nèi)Akkermansia菌得以調(diào)控,與Everard A等學(xué)者所證明的Akkermansia菌具有調(diào)節(jié)機體代謝功能等作用的結(jié)果相同[43]。此外與Zhang等相關(guān)實驗相同[44-45],TF組、TR組與TB組大鼠的脫硫弧菌(Desulfovibrio)等與HF組相比有所減少,說明茶黃素、茶紅素與茶褐素對高脂飲食大鼠腸道內(nèi)的Desulfovibrio等致病菌的生成也具有抑制作用。

圖6 大鼠腸道內(nèi)容物腸道菌群在屬水平上的相對豐度Fig.6 Relative abundance of gut microbiota in rats at the revel of genus

3 結(jié)論

本研究從腸道菌群的角度,研究茶黃素、茶紅素、茶褐素高脂飲食大鼠腸道菌群的影響,探究其對茶葉調(diào)節(jié)高脂飲食大鼠腸道菌群能否起到作用。結(jié)果表明,對高脂飲食大鼠灌胃茶黃素、茶紅素和茶褐素,能在一定程度上抑制大鼠體重(p<0.05)與Lee’s指數(shù)(p<0.01)增長,降低脂肪重量(p<0.05或p<0.01),調(diào)節(jié)血脂,使TC、HDL-C、LDL-C、TG含量以及AI指數(shù)下降(p<0.05或p<0.01),起到抑制肥胖功效。在此基礎(chǔ)上,運用高通量測序技術(shù)對高脂飲食大鼠腸道內(nèi)容物腸道菌群進行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),大鼠腸道菌群的物種豐度、多樣性以及腸道菌群結(jié)構(gòu)得以調(diào)節(jié)。

研究中,高脂飲食誘導(dǎo)肥胖后,同時灌胃茶黃素、茶紅素與茶褐素的大鼠腸道菌群豐度顯著提高,其ACE指數(shù)與chao指數(shù)高于HF組,且TR組與TB組差異顯著(p<0.05);此外,其腸道菌群多樣性顯著增加,即Shannon指數(shù)較HF組相對更高,且TR組和TB組顯著高于HF組(p<0.05);從其腸道菌群結(jié)構(gòu)上分析可知,門水平上各組大鼠Firmicutes的相對豐度降低,Bacteroidetes的相對豐度增加,F/B比值則顯著降低(p<0.05);屬水平上Ruminococcaceae的相對豐度下降,Lactobacillus、Akkermansia菌和Lachnospiraceae的相對豐度存在不同程度回升。

綜上所述,茶黃素、茶紅素與茶褐素對高脂飲食大鼠腸道內(nèi)容物腸道菌群具有影響,對茶葉調(diào)節(jié)高脂飲食大鼠腸道菌群起到一定的正向調(diào)節(jié)作用。而關(guān)于其在人體內(nèi)是否存在相同效果仍待進一步驗證。