毛 瑜,龍遠(yuǎn)春,鄧澤元,張 兵,李紅艷

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047)

零余子(Dioscoreaopposita),俗稱山藥蛋,是植物薯蕷葉腋間的珠芽,是山藥的重要部位之一。零余子的外形呈球狀或卵圓狀,顏色呈淡黃色且有光澤,氣味淡而不苦[1]。據(jù)研究報(bào)道,零余子中含有多酚、皂苷、黃酮、尿囊素、氨基酸、淀粉、多糖、山藥素等多種營養(yǎng)物質(zhì)[2-3]。此外,零余子還具有一定的抗氧化作用[4]、降血糖作用[5]和抑制動脈粥樣硬化作用[6]等。

黃酮類化合物是零余子中重要的抗氧化成分,其提取方法的選擇至關(guān)重要。一般來說,黃酮類化合物的提取方法有回流、超聲、微波、超臨界、膜分離等[7]。關(guān)于零余子中黃酮類化合物的提取,目前已有部分報(bào)道。如廖兆貴[8]和屈亞娟[9]采用回流方法,呂鵬[10]采用超聲方法對零余子中的黃酮類化合物提取進(jìn)行研究。但是,微波提取方法目前沒有報(bào)道。微波提取方法可以通過瞬時穿透加熱[11],使植物細(xì)胞快速破碎,同時具有高效性、環(huán)保性、耗能低、污染小、操作方便,時間短等優(yōu)點(diǎn)[12-13]。

因此,本研究采用微波提取零余子中黃酮類化合物,并利用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件及對采用最佳工藝提取的黃酮進(jìn)行抗氧化活性比較,旨在為零余子的深入開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

瑞昌零余子(Dioscoreaopposita)江西省贛州市;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 阿拉丁公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、無水甲醇、無水乙醇 分析純。

722G可見分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司;TQ-400Y粉碎機(jī) 永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司;DGG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;G80F20CN2L-B8(R0)微波爐 佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 零余子粉的制備 將零余子洗凈,在60 ℃下烘干至恒重,粉碎,過60目篩,備用。

1.2.2 零余子黃酮提取液的制備 準(zhǔn)確稱取零余子粉末樣品1.0 g,按一定液料比加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液,置于微波爐中微波提取一定時間,將提取液趁熱抽濾得澄清濾液,并將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,最后用50%甲醇定溶于到10 mL比色管。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對零余子黃酮提取量的影響 分別選取30%、40%、50%、60%、70%、80%六種不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇為提取劑,在液料比30∶1 mL/g,功率400 W,時間40 s條件下測定黃酮提取量。

1.2.3.2 液料比對零余子黃酮提取量的影響 分別選取不同的液料比15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 mL/g,在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%,功率400 W,時間40 s條件下測定黃酮提取量。

1.2.3.3 微波功率對零余子黃酮提取量的影響分別選取不同的微波功率320、400、480、560 W,在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%,液料比30∶1 mL/g,時間40 s條件下測定黃酮提取量。

1.2.3.4 微波時間對零余子黃酮提取量的影響 在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%,液料比30∶1 mL/g,微波功率400 W的條件下,分別選取不同的微波時間10、20、30、40 s測定黃酮提取量。

1.2.4 響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化工藝 根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ),選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、微波功率、微波時間四個因素,采用四因素三水平的響應(yīng)面分析方法,因素與水平見表1。

表1 微波提取山藥零余子響應(yīng)曲面分析因素與水平Table 1 Coded values and factors of response surface analysis of microwave extraction of flavonoids from Yam bulbil

1.2.5 黃酮提取量的測定

1.2.5.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 準(zhǔn)確吸取0.1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蘆丁溶液0.5、1、2、2.5、3、4、4.5 mL分別置于比色管中,加入5%的亞硝酸鈉溶液0.3 mL搖勻,靜置6 min后加入10%的硝酸鋁溶液0.3 mL,混勻,再靜置6 min后加入4%的氫氧化鈉溶液4 mL,混勻,用蒸餾水定容至10 mL,靜置15 min,于510 nm處測定吸光度值,得到蘆丁濃度與吸光度的回歸方程。每個樣品重復(fù)三次[8]。

1.2.5.2 樣品中黃酮的測定 量取1.0 mL提取后的零余子黃酮樣品液置于具塞試管中,加入5%的亞硝酸鈉溶液0.3 mL搖勻,后續(xù)步驟同1.2.5.1。

1.2.5.3 黃酮提取量的計(jì)算

式中:C為顯色樣品溶液中黃酮類化合物的濃度;W為稱取樣品質(zhì)量,mg;V1為顯色樣品溶液定容后體積,mL;V2為提取液定容后體積,mL;V為用于檢測提取液的體積,mL。

1.2.6 抗氧化能力測定

1.2.6.1 山藥零余子黃酮提取液的配制 稱取10 g山藥零余子粉末,用微波響應(yīng)面法所得最佳工藝條件提取,濾液減壓濃縮至無醇味后,冷凍干燥至恒重。分別稱取6.25、12.5、25、50、100 mg黃酮粗提物定容于10 mL,配制成0.625、1.25、2.5、5、10 mg/mL的黃酮提取液。

1.2.6.2 山藥零余子黃酮提取液清除DPPH自由基的測定 參照Brand-Williams W和Zimmer AR建立的DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)方法[14-17],在96孔板中將100 μL的DPPH甲醇溶液(0.065 mmol/L)與20 μL的樣液或空白溶液混勻,在室溫下反應(yīng)30 min,用酶標(biāo)儀于517 nm下測定其吸光值(空白吸光值0.7左右)。

清除DPPH自由基能力用如下公式計(jì)算:

其中:Ai為樣品溶液加DPPH試劑混合液的吸光度,Aj為樣品溶液加乙醇的吸光度,Ac為DPPH溶液加樣品溶劑的吸光度。用半抑制濃度(IC50)表示。

其中,維生素C半抑制濃度(VCIC50)=VCIC50=0.046 mg·mL-1。

1.2.6.3 山藥零余子黃酮提取液清除ABTS自由基的測定 將5 mL 7.4 mmol/L ABTS儲備液與88 μL 2.6 mmoL/L K2S2O8混勻,靜置12 h配制成ABTS工作液。ABTS工作液用80%的甲醇稀釋,使稀釋液在734 nm處吸光值為1.4,然后于96孔板中分別加入200 μL ABTS溶液和20 μL樣品溶液,振蕩混合均勻6 min后,在734 nm波長下測定吸光值[18-19]。清除率計(jì)算公式如下:

其中:Ai為樣品溶液加ABTS試劑混合液的吸光度,Aj為樣品溶液加甲醇的吸光度,Ac為ABTS溶液加樣品溶劑的吸光度。用IC50表示。

其中,VCIC50=0.067 mg·mL-1。

1.2.6.4 山藥零余子黃酮提取液還原能力的測定 參照惲祥惠的方法在96孔板中,依次加入10 μL樣液和300 μL的ferric-TPTZ工作液(300 mmol/L醋酸鹽緩沖液(0.31 g三水合醋酸鈉+1.6 mL冰醋酸+超純水至100 mL,pH3.6)、10 mmol/L TPTZ的40 mmol/L鹽酸溶液和20 mmol/L FeCl3·6H2O溶液,以10∶1∶1體積比混合),室溫反應(yīng)30 min后,于595 nm下用酶標(biāo)儀測定其吸光度[20-22]。測定結(jié)果以VC(L-ascorbic acid,AAE)為參考標(biāo)準(zhǔn),結(jié)果表示為μmol AAE/g干重(μmol AAE/g DW)。

其中，VC標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程:y=7.0874X+0.4718(R2=0.9978)(其中,X表示VC濃度mmol/L,y表示還原能力μmol AAE/g干重)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

單因素實(shí)驗(yàn)每次做3個平行樣,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示;響應(yīng)曲面分析結(jié)果用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化及方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y=4.3489X+0.0379,R2=0.9991。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對零余子黃酮提取量的影響 由圖2可知,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大,黃酮的提取量先增大后減小,在40%時達(dá)到最大值。這可能是因?yàn)?黃酮類物質(zhì)在醇類溶劑中的溶解度大于在水中的溶解度,隨乙醇比例增大,黃酮類化合物提取量增大,但在40%之后,體系中其它醇溶性雜質(zhì)的溶出能力也增加,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)再增大時,黃酮類物質(zhì)的提取量被干擾而下降。結(jié)果表明,乙醇體積分?jǐn)?shù)保持在40%左右為宜。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對零余子黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on yield of flavonoids

2.2.2 液料比對零余子黃酮提取量的影響 由圖3可見,隨著液料比的增加,提取量增加,之后又有所減少。這是因?yàn)殡S著液料比的增加,沒有完全浸出的零余子與提取液接觸逐漸充分,因此提取量增加,而液料比達(dá)到一定值時,黃酮類物質(zhì)已經(jīng)充分析出,而過量的溶劑會影響零余子對微波能量的吸收,導(dǎo)致熱負(fù)荷增大,提取完全時間增大,從而損失量也會有增加。所以從本實(shí)驗(yàn)所得提取量結(jié)果以及考慮溶劑用量是否造成有機(jī)溶劑的浪費(fèi)等綜合問題,選擇最佳的液料比為30∶1 mL/g。

圖3 液料比對零余子黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on yield of flavonoids

2.2.3 微波功率對零余子黃酮提取量的影響由 圖4可知,微波功率對黃酮類物質(zhì)的提取的影響明顯。在微波功率為320 W時,提取量只有4.59 mg QE/g DW,隨著功率的增加,分子的熱運(yùn)動加劇,引起溫度升高,迅速破壞細(xì)胞壁,使細(xì)胞內(nèi)的黃酮類物質(zhì)較快地分離提取出來,黃酮提取量隨之增加,在微波功率為400 W時達(dá)到最大值?？僧?dāng)功率大于400 W后,提取量急劇下降,可能是因?yàn)楣β蔬^大使黃酮結(jié)構(gòu)破壞。因此結(jié)果表明微波功率在400 W為宜。

圖4 微波功率對零余子黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of microwave power on yield of flavonoids

2.2.4 微波時間對零余子總黃酮微波提取量的影響 由圖5可見,隨著提取時間的增長,零余子中總黃酮不斷析出,提取量逐漸增高。在30 s時提取量達(dá)到最大,之后隨著提取時間的延長,黃酮類化合物的溶出達(dá)到了一定的平衡。但同時隨著時間的延長,吸收微波過多,熱能過高,對細(xì)胞有一定的破壞,細(xì)胞溶出物增加,并且一些黃酮類化合物發(fā)生了降解反應(yīng)或者轉(zhuǎn)化為其他化學(xué)物質(zhì),導(dǎo)致了提取量的降低,因此選擇30 s為黃酮提取的最佳時間。

圖5 微波處理時間對零余子黃酮提取量的影響Fig.5 Effect of microwave treatment time on extraction capacity of flavonoids

2.3 響應(yīng)曲面分析結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果 通過研究單因素的影響條件,確定最佳的單因素試驗(yàn)條件范圍,以此為基礎(chǔ),根據(jù)Design-Expert 8.0軟件的Box-Benhnken中心組合方法設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案,共有27個試驗(yàn)點(diǎn),其中1～24號為析因點(diǎn),其變量取值在各因素構(gòu)成的三維頂點(diǎn);25～27號為零點(diǎn),是區(qū)域的中心點(diǎn),用來估計(jì)試驗(yàn)誤差。零余子黃酮提取量(mg QE/g DW)為響應(yīng)值,響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

2.3.2 回歸方程擬合和方差分析 將所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到零余子總黃酮提取量Y與微波提取各因素變量的二次回歸方程模型為:

Y=6.81+0.20A+0.35B-0.31C-0.090D+0.36AB+0.34AC+0.10AD+0.75BC+0.35BD-0.98CD-0.72A2-0.63B2-0.65C2-0.47D2

由回歸方程可得出,各因素對零余子黃酮提取量的影響大小順序?yàn)?液料比>微波功率>乙醇體積分?jǐn)?shù)>微波時間。對該模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表3,整體模型的顯著性檢測p<0.0001,且失擬項(xiàng)為0.6430,不顯著,說明該方程對試驗(yàn)擬合較好,可以用該模型進(jìn)行分析。一次項(xiàng)中液料比B和微波功率C對總黃酮提取量有極顯著影響,乙醇體積分?jǐn)?shù)A對總黃酮提取量有顯著影響,而微波時間D對總黃酮提取量不顯著;交互項(xiàng)AD不顯著外,AB、AC和BD顯著,BC和CD極顯著;二次項(xiàng)均達(dá)到極顯著水平。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

2.3.3 響應(yīng)曲面分析 圖6～圖11是根據(jù)回歸方程繪制出的各因素交互作用的響應(yīng)面圖,反映了各因素在提取過程中對響應(yīng)值的影響,其投影為等高線圖。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比對黃酮提取量的交互作用及等高線Fig.6 Interaction effect and contour on yield of flavonoids between etnanol concentration and liquid-solidratio

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)與微波功率對黃酮提取量的交互作用及等高線Fig.7 Interaction effect and contour on yield of flavonoids between ethanol concentration and microwave power

圖8 乙醇體積分?jǐn)?shù)與微波處理時間對黃酮提取量的交互作用及等高線Fig.8 Interaction effect and contour on yield of flavonoids between etnanol concentetnanol and microwavec treatment time

圖9 液料比與微波功率對黃酮提取量的交互作用及等高線Fig.9 Interaction effect and contour on yield of flavonoids between liquid-solidratio and microwave power

圖10 液料比與微波處理時間對黃酮提取量的交互作用及等高線Fig.10 Interaction effect and contour on yield of flavonoids between liquid-solidratio and microwave treatment time

圖11 微波功率與作用時間對黃酮提取量的交互作用及等高線Fig.11 Interaction effect and contour on yield of flavonoids between microwave treatment time and ultrasonic power

由圖6可得乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮提取量有一定影響,隨體積分?jǐn)?shù)的增大,黃酮提取量上升,但過高的體積分?jǐn)?shù)反而導(dǎo)致提取量的下降。液料比同樣對黃酮提取量有影響,且沿液料比軸向等高線較乙醇體積分?jǐn)?shù)密集,說明液料比的影響大于乙醇體積分?jǐn)?shù)。等高線稍呈橢圓,代表乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比兩者交互作用顯著。

由圖7可得微波功率對黃酮提取量的影響顯著,曲面較陡,乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮提取量的影響不大,曲面較緩和,且沿微波功率軸向等高線較乙醇體積分?jǐn)?shù)密集,說明微波功率影響大于乙醇體積分?jǐn)?shù)。等高線稍呈橢圓,說明乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比交互作用顯著。

由圖8可得微波時間對黃酮提取量的影響不顯著,曲面比較平緩,且沿微波時間軸向等高線相對疏松。等高線呈圓形,乙醇體積分?jǐn)?shù)和微波時間交互作用較弱,影響不顯著。

由圖9可得沿液料比和微波功率軸向等高線都比較密集,說明液料比和微波功率對黃酮提取量的影響都較大,作用極顯著,而根據(jù)等高線圖可得,等高線呈橢圓形,說明兩者交互作用較強(qiáng),影響極顯著。

由圖10可得液料比曲面較陡,液料比對黃酮提取量的影響顯著,而微波時間曲面較平緩,對黃酮提取量的影響不大。且沿液料比軸向等高線較微波時間密集,說明液料比對響應(yīng)值峰值的影響比微波時間大。且根據(jù)等高線圖可得等高線稍呈橢圓,說明液料比和微波時間交互作用稍顯著。

由圖11可得微波功率對黃酮提取量影響顯著,曲面較陡,而微波時間則對黃酮提取量影響不大,曲面平緩,再根據(jù)等高線呈橢圓形,說明兩者交互作用極顯著。

運(yùn)用軟件得出最佳工藝為:乙醇體積分?jǐn)?shù):40.11%;液料比:30.07∶1 mL/g;微波功率:335 W;微波時間:37.63 s。在此條件下,回歸模型預(yù)測的零余子黃酮提取量的理論值可達(dá)6.90 mg QE/g DW。

2.3.4 工藝條件的優(yōu)化和驗(yàn)證 為了檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性,結(jié)合實(shí)際實(shí)驗(yàn)條件需要,將最佳提取工藝參數(shù)優(yōu)化為乙醇體積分?jǐn)?shù)40%,液料比30∶1 mL/g,微波功率320 W,微波時間37 s,在以此條件驗(yàn)證三次進(jìn)行試驗(yàn),試驗(yàn)得黃酮提取量為6.95 mg QE/g DW,與預(yù)測值6.90 mg QE/g DW相差0.7%。說明采用響應(yīng)曲面法得到的優(yōu)化工藝可行性強(qiáng),優(yōu)化結(jié)果可靠。

采用微波法提取零余子中黃酮類化合物,相比于呂鵬[10]通過超聲提取懷山藥零余子黃酮得2.46 mg/g以及屈亞娟[8]通過回流提取零余子黃酮得5.49 mg/g,具有更高的提取量。而且微波提取用時只需38 s,遠(yuǎn)小于超聲和回流的時間,操作更加便捷。因此研究零余子黃酮的微波提取優(yōu)化具有一定的意義。

2.4 山藥零余子黃酮的抗氧化性作用

2.4.1 零余子黃酮提取液對DPPH自由基清除能力 零余子黃酮提取物清除DPPH自由基能力IC50=0.050 mg·mL-1,與VC(0.046 mg·mL-1)相近,但不及零余子皂苷對DPPH的清除能力,零余子皂苷在0.04 mg/mL時抑制率就達(dá)到202.52%[23]。

2.4.2 零余子黃酮提取液對ABTS自由基清除能力 零余子黃酮提取物清除ABTS自由基能力IC50=0.055 mg·mL-1,比VC(0.067 mg·mL-1)表現(xiàn)出更強(qiáng)的ABTS清除能力。

2.4.3 零余子黃酮提取液的Fe3+的還原能力 零余子黃酮提取物還原Fe3+的能力為9.63 mmol AAE/g DW(每g VC換算得5.68 mmol VC),換算得1.70倍的VC,有較強(qiáng)的鐵離子還原能力。

圖12 抗氧化測定Fig.12 Antioxidant test

3 結(jié)論

通過乙醇微波提取法與響應(yīng)面法相結(jié)合,對零余子黃酮類化合物的提取工藝進(jìn)行研究,得到以下結(jié)論:影響黃酮提取量自變量因素的大小排列為:液料比>微波功率>乙醇體積分?jǐn)?shù)>微波時間。微波提取黃酮的最佳工藝條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%,液料比30∶1 mL/g,微波功率320 W,微波時間37 s。通過驗(yàn)證試驗(yàn)得到黃酮的提取量為6.95 mg QE/g DW。說明微波提取法適用于零余子中黃酮類化合物的提取。同時,通過DPPH、ABTS、FRAP對該工藝下提取的零余子黃酮提取物進(jìn)行抗氧化活性評價,發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)出與VC相近甚至更強(qiáng)的抗氧化活性,說明微波提取法適用于零余子中黃酮類化合物的提取,同時可保留其較高的抗氧化活性。