吳 強,陳 韜,*,朱 姍,朱鐵花,李燕清,楊汝男,李華健,舒國濤,許家銀

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650201; 2.武定永銀農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)有限公司,云南武定 651600)

蓮藕(NelumbonucifereGaertn)又稱荷藕,屬于睡蓮科植物[1],廣泛分布于中國各省,是我國種植規(guī)模較大的水生蔬菜[2]。云南省玉溪市澄江縣蓮藕種植面積3630畝,藕粉年產(chǎn)量達到1674噸。藕粉生產(chǎn)中會產(chǎn)生大量蓮藕下腳料—藕渣,目前國內(nèi)藕渣綜合利用程度較低,主要作為飼料或廢棄物丟掉,造成一定的資源浪費與環(huán)境污染[3]。有研究表明,藕渣含有豐富的膳食纖維[4],且膳食纖維對人體的健康益處已被國內(nèi)外研究證實[5-7],因此提取藕渣中的膳食纖維是開發(fā)利用藕渣和提高其附加值的有效方法之一。

膳食纖維提取方法有化學(xué)提取法、酶提取法、酶-化學(xué)法、物理法及發(fā)酵法[8-12]。國內(nèi)外主要采用化學(xué)提取法提取膳食纖維,但該法所提取的膳食纖維具有色澤差、漂白難,且生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生大量廢水等缺點[13-14]。酶-化學(xué)法具有提取條件較溫和,提取的膳食纖維物理性質(zhì)(持水性、溶脹性)較強以及產(chǎn)品純度較高等優(yōu)點[15]。酶-化學(xué)法較為常見的提取流程可分為先堿解后酶解[16]和先酶解后堿解[17]兩種工藝,實驗初期采用酶化學(xué)法(先堿解后酶解)提取藕渣IDF,但發(fā)現(xiàn)先堿解后藕渣樣品呈現(xiàn)出膠凝結(jié)塊的現(xiàn)象,不利于隨后的酶解反應(yīng)和藕渣IDF的提取。此外,有報道稱IDF的物理性質(zhì)(持水性、溶脹性、色澤等)不僅與其在食品中的加工性能相關(guān),還直接影響其在腸道中的功能特性[18]。

因此本實驗采用先酶解后堿解的酶化學(xué)法對提取工藝參數(shù)進行篩選與優(yōu)化,并研究分析了該方法所制得藕渣IDF的理化性質(zhì)(持油性、持水性、溶脹性、色澤),為促進藕渣資源開發(fā)功能性膳食纖維食品添加劑提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藕渣 云南玉溪澄江藕粉廠;石油醚 分析純,成都市科隆化學(xué)品有限公司;氫氧化鈉、無水乙醇 分析純,天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;鹽酸 分析純,重慶川東化工(集團)有限公司;熱穩(wěn)定α-淀粉酶液(酶活力為38500 IU/g) 上海阿拉丁生化有限公司;堿性蛋白酶(酶活力為200000 U/g)、糖化酶(酶活力為100000 U/g)、硅藻土、MES-TRIS緩沖試劑 北京索萊寶科技有限公司。

SE206型脂肪測定儀 濟南阿爾瓦儀器有限公司;K9840型自動凱氏定氮儀 濟南海能儀器股份有限公司;SX2-4-10型箱式電阻爐 上海躍進醫(yī)療器械廠;HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市城西崢嶸實驗儀器廠;WHY-2型水浴恒溫振蕩器 金壇市大地自動化儀器廠;GZX-GF101-3-BS型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海躍進醫(yī)療器械有限公司;AR224CN型電子天平 奧豪斯儀器(常州)有限公司;SHZ-D(III)型循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;HC-3018R型高速冷凍離心機 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司;DFT-100型手提式高速中藥粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司;HI9024型pH計 意大利哈納HANNA儀器公司;CR-400/410型色差計 日本 Konica Minolta公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藕渣主要成分分析 將濕樣藕渣于干燥箱75 ℃條件進行烘干粉碎過60目篩備用,進行主要成分分析。采用GB 5009.88-2014《食品中膳食纖維的測定》[19]測定藕渣中總膳食纖維(TDF)、不溶性膳食纖維(IDF);藕渣的水分、灰分、蛋白質(zhì)、脂肪含量的測定分別參照GB 5009.3-2016《食品中水分的測定》[20]、GB 5009.4-2016《食品中灰分的測定》[21]、GB 5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》[22]、GB 5009.6-2016《食品中脂肪的測定》[23]規(guī)定的方法進行。藕渣的色澤測定參照周禹含[24]采用色差計測定并記錄藕渣的亮度值(L*),紅度值(a*),黃度值(b*)。

1.2.2 藕渣IDF的制備流程及純度測定 參照Cheickna等[25]對米糠膳食纖維的提取工藝做相應(yīng)修改,稱取1.0000 g的脫脂藕渣,與30倍體積的pH=8.2的Mes-Tris緩沖液混合并用鹽酸調(diào)至pH=7,加入一定量的熱穩(wěn)定α-淀粉酶于95 ℃反應(yīng)一段時間,然后用氫氧化鈉調(diào)pH=8,加入一定量的堿性蛋白酶在50 ℃反應(yīng)60 min,用鹽酸調(diào)至pH=4.5,加入100 μL的淀粉葡糖甘酶于60 ℃水浴30 min,4000 r/min離心15 min除去上清液,浸泡于15倍體積一定濃度的氫氧化鈉溶液中,于60 ℃水浴一定時間,然后4000 r/min離心15 min,分別經(jīng)蒸餾水洗滌至中性,30 mL的70 ℃熱水洗滌以及30 mL的95%乙醇洗滌,抽濾干燥得藕渣IDF。

參照酶重量法[19]并做相應(yīng)修改,取兩份經(jīng)干燥粉碎過60目的等質(zhì)量的(m)藕渣IDF樣品,經(jīng)過蛋白質(zhì)與灰分測定,分別計算出該樣品的蛋白質(zhì)含量(m1)與灰分含量(m2)然后通過以下公式計算藕渣IDF得率及純度。

1.2.3 單因素實驗設(shè)計 稱取1.0000 g過60目脫脂藕渣樣品,以藕渣IDF得率為考察指標(biāo),分別研究淀粉酶添加量、淀粉酶酶解時間、蛋白酶添加量、氫氧化鈉濃度、堿解時間對藕渣IDF得率的影響。

1.2.3.1 熱穩(wěn)定α-淀粉酶添加量對藕渣IDF得率的影響 選取0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%不同熱穩(wěn)定α-淀粉酶添加量,在氫氧化鈉濃度0.3 mol/L、堿解時間45 min、淀粉酶酶解時間60 min、堿性蛋白酶添加量5%時,研究熱穩(wěn)定α-淀粉酶添加量對藕渣IDF得率的影響。

1.2.3.2 熱穩(wěn)定α-淀粉酶酶解時間對藕渣IDF得率的影響 選取30、45、60、75、90 min不同酶解時間,在氫氧化鈉濃度0.3 mol/L、堿解時間45 min、熱穩(wěn)定α-淀粉酶添加量0.5%、堿性蛋白酶添加量5%時,研究熱穩(wěn)定α-淀粉酶酶解時間對藕渣IDF得率的影響。

1.2.3.3 堿性蛋白酶添加量對藕渣IDF得率的影響 選取2%、3%、4%、5%、6%不同堿性蛋白酶添加量,在氫氧化鈉濃度0.3 mol/L、堿解時間45 min、熱穩(wěn)定α-淀粉酶添加量0.5%、熱穩(wěn)定α-淀粉酶酶解時間60 min時,研究堿性蛋白酶添加量對藕渣IDF得率的影響。

1.2.3.4 氫氧化鈉濃度對藕渣IDF得率的影響 選取0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mol/L不同濃度的氫氧化鈉溶液,在堿解時間45 min、熱穩(wěn)定α-淀粉酶添加量0.5%、熱穩(wěn)定α-淀粉酶酶解時間60 min、堿性蛋白酶添加量5%時,研究氫氧化鈉濃度對藕渣IDF得率的影響。

1.2.3.5 堿解時間對藕渣IDF得率的影響 選取45、60、75、90、105 min不同堿解時間,在氫氧化鈉濃度0.3 mol/L、熱穩(wěn)定α-淀粉酶添加量0.5%、淀粉酶酶解時間60 min、堿性蛋白酶添加量5%時,研究堿解時間對藕渣IDF得率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計 在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,選取對藕渣IDF得率影響程度較大的四個因素;以氫氧化鈉濃度(A)、堿解時間(B)、熱穩(wěn)定α-淀粉酶酶解時間(C)、堿性蛋白酶添加量(D)因素為響應(yīng)面試驗因素,響應(yīng)面水平設(shè)計如表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in the response surface design

1.2.5 理化特性分析

1.2.5.1 持水性測定 參照Wang等[26]方法,準(zhǔn)確稱取藕渣IDF為1.000 g置于50 mL的離心管,加入30 mL的蒸餾水,在室溫條件下,常溫振蕩攪拌1 h后,在5300 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min取出,傾倒上清液,甩干水分稱重。持水性計算公式為:

式中:W-持水性,g/g;M-樣品干重,g;M1-樣品濕重,g。

1.2.5.2 溶脹性測定 參照Tosh等[27]方法,準(zhǔn)確稱取藕渣IDF為1.000 g置于10 mL量筒中,用移液槍準(zhǔn)確移取5 mL蒸餾水于量筒中,振蕩均勻后在室溫下放置24 h讀取液體中膳食纖維的體積。溶脹性計算公式為:

式中:S-溶脹性,mL/g;V1-溶脹后體積,mL;V-干品體積,mL;M-樣品干重,g。

1.2.5.3 持油性測定 參照孔令明等[9]方法,準(zhǔn)確稱取藕渣IDF為1.000 g置于離心管中,加入食用菜籽油8 g,混合均勻后于室溫靜止1 h,離心(5300 r/min,20 min)傾去上層菜籽油,濾渣用濾紙吸干游離的菜籽油,稱重,持油性計算公式為:

式中:O-持油性,g/g;M-樣品干重,g;M1-樣品濕重,g。

1.2.5.4 色澤測定 參照張玉榮等[28]方法,將粉狀樣品置于樣品測試杯中,經(jīng)填實、壓平后進行測定,平行測定4次取平均值,記錄藕渣IDF的L*、a*、b*值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,單因素實驗采用SPSS 19.0進行ANOVA單因素方差分析、Ducan’s多重比較,Origin8.0進行圖片處理,響應(yīng)面優(yōu)化采用Design-Expert 8.0進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 干樣藕渣的理化性質(zhì)及色澤的測定

由表2可知,干樣藕渣是豐富的膳食纖維來源,其中藕渣IDF占總膳食纖維的92.87%;此外,干樣藕渣還有一定量的蛋白質(zhì)及脂肪;在色澤方面上,干樣藕渣呈現(xiàn)出黃色色澤。

表2 干樣藕渣理化性質(zhì)分析Table 2 Physicochemical properties analysis of dried lotus residue

2.2 單因素實驗

2.2.1 熱穩(wěn)定α-淀粉酶添加量對藕渣IDF得率的影響 由圖1可知,在較低的熱穩(wěn)定α-淀粉酶添加量范圍內(nèi),藕渣IDF得率增加但無顯著變化,當(dāng)熱穩(wěn)定α-淀粉酶添加量為0.6%時,藕渣IDF得率最高為29.49%,隨著淀粉酶添加量的繼續(xù)上升,IDF得率降低但變化不明顯,這可能是由于淀粉酶的添加量趨于過飽和狀態(tài),反而導(dǎo)致藕渣IDF得率降低[29]。從提取成本方面及得率考慮,確定熱穩(wěn)定α-淀粉酶添加量為0.6%較為合適。

圖1 熱穩(wěn)定α-淀粉酶添加量對藕渣IDF得率的影響Fig.1 Effect of α-amylase addition on IDF extraction rate of lotus root residues注:不同字母表示差異顯著(p<0.05)，圖2～圖5同。

2.2.2 熱穩(wěn)定α-淀粉酶酶解時間對藕渣IDF得率的影響 由圖2可知,酶解時間在30～60 min范圍時,藕渣IDF整體得率呈現(xiàn)出略微下降的趨勢,這可能是由于隨著酶解時間的增加,熱穩(wěn)定α-淀粉酶不斷水解淀粉,使得藕渣IDF制備過程中殘留的雜質(zhì)變少,粗制備物得率相對下降;但隨著酶解時間的繼續(xù)增加,由75～90 min時,藕渣IDF得率顯著下降(p<0.05),這可能是由于在酶解溫度為95 ℃高溫條件下,較長時間的酶解對藕渣IDF的結(jié)構(gòu)和組成成分破壞引起的不溶性物質(zhì)溶解度增加,導(dǎo)致IDF得率下降。綜合考慮選擇酶解時間為75 min。

圖2 熱穩(wěn)定α-淀粉酶酶解時間對藕渣IDF得率的影響Fig.2 Effect of α-amylase hydrolysis time on IDF extraction rate of lotus root residues

2.2.3 堿性蛋白酶添加量對藕渣IDF得率的影響 由圖3可知,隨著堿性蛋白酶添加量的增加,藕渣IDF得率呈先降低后升高再降低的趨勢。其中,在堿性蛋白酶添加量為3%時,藕渣IDF得率最低。但當(dāng)堿性蛋白酶添加量為4%時,隨著添加量的繼續(xù)增加,IDF得率變化程度略微減少,從節(jié)約酶用量的角度及IDF得率變化程度考慮,選擇堿性蛋白酶添加量范圍為2%～4%較為合適。

圖3 堿性蛋白酶添加量對藕渣IDF得率的影響Fig.3 Effect of alcalase addition on IDF extraction rate of lotus root residues

2.2.4 氫氧化鈉濃度對藕渣IDF得率的影響 由圖4可知,隨著氫氧化鈉濃度的增加,藕渣IDF得率整體趨勢先升高后降低最后趨于平穩(wěn)(且在這個過程中,藕渣IDF色澤發(fā)生由黃色向棕黃色的轉(zhuǎn)變)。在氫氧化鈉濃度為0.5 mol/L時,藕渣IDF得率最高。這可能是由于纖維素、半纖維素及木質(zhì)素等不溶性膳食纖維在較高的氫氧化鈉濃度下發(fā)生部分的水解[30-31]。因此,出于藕渣IDF得率及色澤方面的考慮,氫氧化鈉的濃度選為0.5 mol/L較合適。

圖4 氫氧化鈉濃度對藕渣IDF得率的影響Fig.4 Effects of concentration of NaOH on IDF extraction ratio of lotus root residues

2.2.5 堿解時間對藕渣IDF得率的影響 由圖5可知,隨著堿解時間的延長,藕渣IDF得率呈先減小后增加的趨勢,但總體變化差異不顯著。當(dāng)堿解時間為90 min時,藕渣IDF得率最高為26.42%,因此堿解時間選為90 min。

圖5 堿解時間對藕渣IDF得率的影響 Fig.5 Effects of alkali extraction time on IDF extraction ratio of lotus root residues

2.3 響應(yīng)面試驗

2.3.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果及方差分析 采用Design-Expert 8.0.6軟件,按照Box-Behnken試驗設(shè)計,依據(jù)單因素實驗結(jié)果選取氫氧化鈉濃度(A)、堿解時間(B)、熱穩(wěn)定α-淀粉酶解時間(C)、堿性蛋白酶添加量(D)4個因素為自變量,藕渣IDF得率為響應(yīng)值,設(shè)計4因素3水平響應(yīng)面分析試驗。試驗設(shè)計結(jié)果見表3。方差分析表詳見表4。

表3 藕渣IDF得率響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Experimental design and corresponding results for response surface analysis of Lotus residue IDF

根據(jù)表4的數(shù)據(jù)得出編碼的二次回歸方程為:

Y=27.34+0.47A+0.38B-0.037C+0.0013D-0.41AB-0.76AC-0.45AD-0.066BC+0.083BD+0.88CD-0.59A2-0.47B2+0.051C2+0.34D2

根據(jù)表4的數(shù)據(jù)得出實際的二次回歸方程為:

表4 藕渣IDF得率響應(yīng)面試驗方差分析表Table 4 Variance analysis for extraction rate of Lotus residue IDF

Y=-29.73+139.61A+0.54B+0.068C-4.67D-0.27AB-0.51AC-4.53AD-0.00029BC+0.0056BD+0.059CD-58.62A2-0.0021B2+0.00023C2+0.33656D2

2.3.2 響應(yīng)面交互作用等高線分析 保持氫氧化鈉濃度、堿解時間、熱穩(wěn)定α-淀粉酶酶解時間、堿性蛋白酶添加量4個變量中的2個變量在0水平,藕渣IDF得率隨另外兩個變量在相應(yīng)范圍內(nèi)變化趨勢如圖6～圖9所示。

圖6 堿解時間與氫氧化鈉濃度的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface for alkali soaking time and NaOH concentration alkali soaking time

圖7 淀粉酶酶解時間與氫氧化鈉濃度的響應(yīng)面Fig.7 Response surface for α-amylase hydrolysis time and NaOH concentration

圖8 堿性蛋白酶添加量與氫氧化鈉濃度的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface for alcalase addition and NaOH concentration

圖9 淀粉酶酶解時間與堿性蛋白酶添加量的響應(yīng)面圖Fig.9 Response surface for α-amylase time and alcalase addition

響應(yīng)面圖可分為曲面圖與等高線圖兩部分,因此響應(yīng)面分析常結(jié)合這兩部分進行分析。一方面,可通過觀察曲面圖的陡峭程度,用來反映因素間的交互效應(yīng)對響應(yīng)值的影響程度大小;另一方面,還可從等高線的形狀、排列的密集程度方面,用來判斷因素間的交互作用及對響應(yīng)值的影響程度[32-33]。

由圖6可知,曲面較陡峭,說明堿解時間和氫氧化鈉濃度之間交互作用對藕渣IDF得率影響顯著,與方差分析表結(jié)果相一致(p<0.05);圖6等高線呈橢圓形,且等高線沿著氫氧化鈉濃度軸向較堿解時間軸向密集,說明氫氧化鈉濃度對藕渣IDF得率的影響程度高于堿解時間;圖6可知,當(dāng)堿解時間一定時,藕渣IDF得率隨著氫氧化鈉濃度的增加呈現(xiàn)出先升高后降低,在氫氧化鈉濃度為0.5～0.55 mol/L時,藕渣IDF得率較高。

由圖7可知,曲面陡峭,說明熱穩(wěn)定α-淀粉酶酶解時間和氫氧化鈉濃度之間交互作用對藕渣IDF得率影響極顯著,與方差分析表結(jié)果相一致(p<0.01);圖7等高線呈橢圓形,且等高線沿著氫氧化鈉濃度軸向較淀粉酶酶解時間軸向密集,說明氫氧化鈉濃度對藕渣IDF得率的影響程度高于淀粉酶解時間;同時由圖7可以看出淀粉酶酶解時間在60 min、氫氧化鈉濃度在0.6 mol/L時,藕渣IDF得率最高。

由圖8可知,曲面較陡峭,說明蛋白酶添加量和氫氧化鈉濃度之間交互作用對藕渣IDF得率影響顯著,與方差分析表結(jié)果相一致(p<0.05);圖8等高線呈橢圓形,且等高線沿著氫氧化鈉濃度軸向較蛋白酶添加量軸向密集,說明氫氧化鈉濃度對藕渣IDF得率的影響程度高于蛋白酶添加量;圖8可以看出,蛋白酶添加量在2%、氫氧化鈉濃度在0.6 mol/L時,藕渣IDF得率最高。

由圖9可知,曲面凹陡峭,說明熱穩(wěn)定α-淀粉酶酶解時間和蛋白酶添加量之間交互作用對藕渣IDF得率影響極顯著,與方差分析表結(jié)果相一致(p<0.01);圖9等高線呈橢圓形,且等高線沿著蛋白酶添加量軸向較淀粉酶酶解時間軸向稀疏,說明蛋白酶添加量對藕渣IDF得率的影響程度低于淀粉酶酶解時間;同時由圖9可以看出淀粉酶酶解時間在90 min、蛋白酶添加量在4%時,藕渣IDF得率較高。

2.3.3 最佳工藝條件的預(yù)測和驗證實驗 經(jīng)Design-Expert 8.0.6軟件分析處理,對擬合的回歸方程在藕渣IDF得率范圍25%～30%取最大值得到藕渣IDF最佳提取工藝參數(shù)為:NaOH濃度A=0.60 mol/L,堿解時間B=89.58 min,穩(wěn)定α-淀粉酶酶解時間C=60 min,堿性蛋白酶D=2%。此時藕渣IDF預(yù)測得率為29.75%。

考慮到實際可操作性,將工藝條件參數(shù)修正為NaOH濃度A=0.60 mol/L,堿解時間B=90 min,熱穩(wěn)定α-淀粉酶酶解時間C=60 min,堿性蛋白酶D=2%。用此提取工藝參數(shù)條件進行驗證實驗,通過實驗得到藕渣IDF得率為29.90%±0.06%,與理論得率較為接近,說明回歸方程較好地預(yù)測酶化學(xué)法提取藕渣IDF的實際效果,具有可行性與實際應(yīng)用價值。此時采用酶重量法[19]測定藕渣IDF的純度達到91.93%±1.16%。

2.4 藕渣IDF性能、色澤測定

與結(jié)果2.1(表2)相比,在色澤方面,藕渣IDF的L*值低于藕渣的L*值,藕渣IDF的a*值高于藕渣的a*值,藕渣IDF的b*值低于藕渣的b*值。這可能是由于酶化學(xué)法在降解非膳食纖維物質(zhì)時轉(zhuǎn)變成一些小分子而引起對色澤的變化。

由表5可知,通過酶化學(xué)法(先酶解后堿解)的最佳提取工藝制得的藕渣IDF性能分別為持水性為6.58±0.25 g/g、持油性為4.73±0.33 g/g、膨脹性為3.03±0.12 mL/g。

表5 藕渣IDF的性能及色澤指標(biāo)測定Table 5 The performance and color ’s determination of lotus root IDF

3 結(jié)論

影響酶化學(xué)法(先酶解后堿解)提取藕渣IDF得率程度大小依次為:氫氧化鈉濃度>堿解時間>熱穩(wěn)定α-淀粉酶酶解時間>堿性蛋白酶添加量。最佳工藝條件為:NaOH濃度0.60 mol/L,堿解時間90 min,熱穩(wěn)定α-淀粉酶酶解時間60 min,堿性蛋白酶2%。在此條件下,藕渣IDF的得率29.90%±0.06%,藕渣IDF的純度為91.93%±1.16%,持水性6.58±0.25 g/g,持油性4.73±0.33 g/g,膨脹性3.03±0.12 ml/g。此外,藕渣IDF的亮度值(L*)為38.266±0.187,紅度值(a*)為3.412±0.027,黃度值(b*)值為5.268±0.042。因此,藕渣IDF的最佳提取工藝條件是可行的,為藕渣開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。