張 耀,王財成,袁素素,張瑋瑋,葉秀娟

(福建省福州市福建農(nóng)林大學(xué),生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點實驗室,福建福州 350002)

抗菌蛋白(Antimicrobial proteins or peptides,AMPs),存在于生物體內(nèi),是生物抵御不良外界環(huán)境過程中產(chǎn)生的，具有抗微生物活性的防御性蛋白或肽類,用于抵擋外來入侵病原體,是生物天然免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分。植物抗真菌活性蛋白,是植物長期進化過程中,自身合成的一種植物抵御外界病原真菌的物質(zhì),可以抑制真菌的生長,甚至消滅真菌[1]。目前,各國研究人員已經(jīng)從多種植物中分離純化多種抗菌蛋白,包括甘藍[2]、褐色蕓豆[3]、小紅豆[4]等植物,抗菌蛋白主要存在于植物的各種組織器官中,如莖[5]、果實[6]、種子[7]等。這些抗菌蛋白在一級序列的基礎(chǔ)上,可被分為轉(zhuǎn)脂蛋白、硫堇、植物防御素、Hevein和Konttin型蛋白家族[8]。抗菌蛋白通過抑制真菌生理代謝、降解真菌細胞壁、破壞真菌細胞膜、破壞細胞中的核糖體及降解細胞中的核酸,來保護植物體免受病原菌的侵染[9-10]。目前,對于抗菌蛋白的純化、生物活性、作用機理均有一定的研究報道[11],但相關(guān)理論和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的研究尚有待進一步深入,隨著抗菌活性蛋白研究的深入,其應(yīng)用范圍將更加廣泛。

芝麻菜(ErucasativaMill.),又名臭菜、火箭生菜等,是十字花科芝麻菜屬一年生草本植物,原產(chǎn)于東亞與地中海。芝麻菜具有類似芝麻種子的香氣、氣味辛辣、生長周期短(40～60 d)等特點,歐洲國家常用其葉片做沙拉或清蒸蔬菜;由于其種子含油量高,印度、巴基斯坦等國家將其作為一種重要的油料作物[12-13]。在我國,河北、山西、陜西、黑龍江、云南、新疆等地均有芝麻菜種植[14],但其食用者較少。芝麻菜種子可采集供藥用,有健胃、止血、利尿、消炎作用[15]，和其它十字花科植物相似,芝麻菜種子中富含多種天然植物化學(xué)成分,其中包括硫代葡萄糖苷(Glucosinolate)、胡蘿卜素、纖維素、維生素C、黃酮類等物質(zhì)[16-18],其中硫代葡萄糖苷的水解產(chǎn)物異硫氰酸酯(Erucin)對多種腫瘤細胞具有較強的抑制作用[19]。

目前,對于芝麻菜的研究主要集中于芝麻菜苷方面,同為十字花科的甘藍[2]、薺菜[20]等中,均有純化出抗菌蛋白,但有關(guān)芝麻菜種子中蛋白類抗菌物質(zhì)的研究未見報道。本文旨在從芝麻菜種子中分離純化一種抗真菌蛋白,并對其生物活性進行初步探究,為芝麻菜開發(fā)新的應(yīng)用價值提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芝麻菜種子 哈爾濱市農(nóng)信種子有限責(zé)任公司;小白菜炭疽病菌(Colletotrichumhigginsianum)、煙草炭疽病菌(Colletotrichummicotianae)、禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)、玉米小斑病菌(Helminthosporiummaydis)、芭樂炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、茄病鐮刀菌(Fusariumsolani),蘋果黑腐皮殼菌(Valsamali)、凸臍蠕孢菌(Setosphaeriaturcica)、落花生球腔菌(Mycosphaerellaarachidicola)、稻瘟菌(Magnaportheoryzae)、長柄鏈格孢菌(Alternarialongipes)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)、擬盤多毛胞(Pestalotiopsis) 福建農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點實驗室;SYTOX Green染料 美國Cambrex公司;剛果紅染料 上海笛柏化學(xué)品技術(shù)公司;SP-Sepharose填料、Mono STM5/50 GL預(yù)裝柱、SuperdexTM75 10/300GL預(yù)裝柱 美國GE公司;其余化學(xué)試劑 均為分析純;透析袋(截留分子量3500 Da) 美國光譜醫(yī)學(xué)公司。

Centrifuge 5860R型高速冷凍離心機 Eppendorf中國有限公司;WP-UP-LH-20型超純水機 四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司;AKTA purifiers型蛋白層析系統(tǒng) 美國GE公司;LCJ-18S型冷凍干燥機 上海松源華興科技發(fā)展有限公司;DW-25L262型醫(yī)用低溫保存箱 海爾特種電器有限公司;SPH-200F恒溫培養(yǎng)搖床 上海世平實驗儀器有限公司;DYY-6C型電泳儀器 北京市六一儀器廠;Nikon A1型激光共聚焦電子顯微鏡 日本Nikon公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 抗真菌蛋白的純化

1.2.1.1 總蛋白的提取 取100 g洗凈芝麻菜種子,用蒸餾水清洗,除去雜質(zhì),加入1 L的NH4OAc緩沖液(10 mmol/L,pH4.6),用豆?jié){機打成勻漿后,置于4 ℃冰箱過夜。將浸提液在4 ℃、9000 r/min離心30 min,取上清液經(jīng)四層紗布過濾,除去一些脂肪等雜質(zhì),重復(fù)離心、過濾步驟2～3次,收集上清液,得芝麻菜總蛋白提取液。

1.2.1.2 SP-Sepharose陽離子交換柱層析 預(yù)先用NH4OAc(10 mmol/L,pH4.6)的上樣緩沖液將離子交換柱平衡,取總蛋白提取液上樣,上樣結(jié)束后,繼續(xù)流上樣緩沖液至280 nm吸光值(OD280)為0終止,收集流穿峰ZSP0。然后依次用含0.2、0.5、1.0 mol/L NaCl的NH4OAc(10 mmol/L,pH4.6)上樣緩沖液進行梯度洗脫,并進行峰收集,得ZSP1、ZSP2、ZSP3組分,對各組分進行抗菌活性檢測,以小白菜炭疽病菌為指示菌,收集活性組分,并用蒸餾水在4 ℃透析12 h,截留分子量3500 Da,每3 h換一次蒸餾水,并將透析后的活性成分在-60 ℃冷凍干燥成干粉,即得芝麻菜抗菌蛋白粗品。

1.2.1.3 快速蛋白液相色譜Mono STM5/50GL強陽離子交換層析 按照AKTA pure蛋白純化系統(tǒng)操作要求,將強陽離子交換柱Mono STM5/50GL與系統(tǒng)連接,用NH4OAc(10 mmol/L,pH4.6)上樣緩沖液平衡,將上述活性組分溶解于上樣緩沖液,過0.22 μm濾膜后上樣,上樣結(jié)束后,繼續(xù)流上樣緩沖液至OD280為0,收集流穿峰ZMS0。然后在含0～1 mol/L NaCl的NH4OAc(10 mmol/L,pH4.6)上樣緩沖液進行線性洗脫,得ZMS1、ZMS2和ZMS3三個洗脫峰。對各組分進行抗菌活性檢測,以小白菜炭疽病菌為指示菌,收集活性組分,并透析和冷凍干燥。

1.2.1.4 快速蛋白液相色譜SuperdexTM75 10/300GL凝膠柱層析 將凝膠柱SuperdexTM75 10/300GL與AKTA pure蛋白純化系統(tǒng)連接,用NH4OAc(10 mmol/L,pH4.6)上樣緩沖液平衡,將過完強陽離子交換柱Mono STM5/50GL得到的活性組分溶于上樣緩沖液,過0.22 μm濾膜后上樣,上樣結(jié)束繼續(xù)流上樣緩沖液至OD280為0,對吸收峰進行收集,分別為ZSU1、ZSU2、ZSU3。對各組分進行抗菌活性檢測,小白菜炭疽病菌為指示菌,收集活性組分,透析并冷凍干燥。

1.2.2 Tricine-SDS-PAGE電泳 將純化的活性蛋白運用Tricine-SDS-PAGE電泳方法[2]進行分析鑒定,分別使用16.5%分離膠,10%夾層膠,4%濃縮膠。電泳條件的起始電壓為30 V,進入分離膠后升至80 V。電泳結(jié)束后,用考馬斯亮藍染液染色1 h,后用脫色液進行脫色,觀察蛋白條帶情況。

1.2.3 抑菌活性的檢測 運用濾紙片擴散法,將待測的植物病原真菌接菌于含有馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)培養(yǎng)皿中,生長至圓面直徑為3 cm,將滅菌的濾紙圓片放在距離菌邊緣0.5 cm處,滴加20 μL的待測抗菌蛋白樣品(1 mg/mL)在濾紙圓片上,無菌水為對照,放置在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中,繼續(xù)培養(yǎng)至菌邊緣長至濾紙片處,觀察有無抑菌活性。

1.2.4 抗菌蛋白的穩(wěn)定性實驗

1.2.4.1 抗菌蛋白的熱穩(wěn)定性 取抗菌蛋白1 mg溶解于1 mL的PBS緩沖液(pH7.4)中,等量分裝到到4個1.5 mL的離心管中,分別在40、60、80和100 ℃條件下水浴加熱15 min,待溶液冷卻至室溫,在8000 r/min離心5 min,取上清液,以小白菜炭疽病菌為指示菌,檢測抑菌活性,分別以PBS緩沖液(pH7.4)為陰性對照,未處理的抗菌蛋白溶液為陽性對照,設(shè)三個重復(fù),記錄實驗結(jié)果。

1.2.4.2 抗菌蛋白的pH穩(wěn)定性 取1 mL抗菌蛋白溶液(1 mg/mL),分別取pH為1、2、3、11、12、13的PBS緩沖液(pH7.4)90 μL,加入10 μL上述抗菌蛋白溶液混勻,靜置30 min后,以小白菜炭疽病菌為指示菌,檢測抑菌活性,以PBS緩沖液(pH7.4)為陰性對照,未處理的抗菌蛋白溶液為陽性對照,設(shè)三個重復(fù),記錄實驗結(jié)果。

1.2.4.3 抗菌蛋白金屬離子穩(wěn)定性實驗 分別用無菌水配制40、100、200、300 mmol/L的CaCl2、FeCl3、KCl、MgCl2、MnCl2溶液備用。取20 μL的抗菌蛋白溶液(1 mg/mL)與20 μL上述金屬鹽溶液混合,室溫放置1 h后,以小白菜炭疽病菌為指示菌,進行抑菌活性檢測。分別以不含抗菌蛋白但含150 mmol/L金屬離子的溶液作為陰性對照,未處理的抗菌蛋白溶液為陽性對照,設(shè)三個重復(fù),記錄實驗結(jié)果。

1.2.5 抗真菌蛋白的作用機理

1.2.5.1 蛋白菌絲尖端幾丁質(zhì)積累檢測 小白菜炭疽病菌接菌于馬鈴薯液體培養(yǎng)基(PDB)中,150 r/min,28 ℃搖床培養(yǎng)至OD600為1時,吸取菌懸液,稀釋10倍,加入抗菌蛋白溶液,繼續(xù)搖床培養(yǎng)1 d,離心得菌絲,多余抗菌蛋白用PBS緩沖液(pH7.4)清洗,然后接菌在PDA培養(yǎng)基上,28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d,PBS緩沖液(pH7.4)處理菌絲為對照。在1.5 mL離心管中,分別加抗菌蛋白溶液和PBS緩沖液(pH7.4),在靠近培養(yǎng)皿邊緣處挑取菌塊加入離心管,28 ℃培養(yǎng)1 d,用PBS緩沖液(pH7.4)清洗,加入剛果紅(Congo red)染料,黑暗、室溫條件下著色30 min,PBS緩沖液(pH7.4)反復(fù)沖洗去除多余染液,挑取真菌菌絲制成玻片,運用激光共聚焦電子顯微鏡進行觀察,激發(fā)波長543 nm,發(fā)射波長560～635 nm。

1.2.5.2 細胞膜選擇透過性檢測 無菌條件下,在兩個1.5 mL離心管(滅過菌)加入900 μL PDB液體培養(yǎng)基,挑取活化指示菌菌塊放入培養(yǎng)基中,28 ℃培養(yǎng) 2 d,分別向上述兩個離心管中加入抗菌蛋白溶液和PBS緩沖液(作對照),28 ℃培養(yǎng)12 h,用PBS緩沖液(pH7.4)清洗,加入熒光綠(SYTOX Green)染料,黑暗條件下著色30 min,PBS緩沖液(pH7.4)洗去多余染液,制備玻片,運用激光共聚焦掃描熒光顯微鏡進行觀察,激發(fā)波長504 nm,發(fā)射波長523 nm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均取3次重復(fù)實驗的平均值,采用Excel、Word軟件進行數(shù)據(jù)分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 芝麻菜抗菌蛋白的純化

芝麻菜種子經(jīng)破碎、離心和過濾得到總蛋白提取液,經(jīng)SP-Sepharose陽離子交換色譜進行純化,在280 nm檢測洗脫液吸光度,得到的色譜圖如圖1所示。通過抑菌實驗,發(fā)現(xiàn)在含有0.5 mol/L NaCl的NH4OAc緩沖液(10 mmol/L,pH4.6)洗脫出的ZSP3洗脫峰具有抗真菌菌活性,收集ZSP3組分,并透析和冷凍干燥,得到ZSP3蛋白干粉。

圖1 芝麻菜種子抗菌蛋白的SP-Sepharose離子交換色譜圖Fig.1 Ion exchange chromatography of the antifungal protein from arugula seeds on SP-Sepharose

在AKTA pure蛋白純化系統(tǒng)中,將ZSP3蛋白干粉溶解于NH4OAc緩沖液(10 mmol/L,pH4.6)中,經(jīng)0.22 μm濾膜后上樣至Mono STM5/50GL離子交換色譜柱中,通過含0～1 mol/L NaCl的NH4OAc緩沖液(10 mmol/L,pH4.6)線性洗脫,得到ZMS1、ZMS2和ZMS3三個洗脫峰(圖2)。通過抑菌實驗,測得ZMS1具有抗真菌活性,收集ZMS1峰組分,并透析和冷凍干燥,得ZMS1蛋白干粉。

圖2 芝麻菜種子抗菌蛋白的Mono STM5/50GL離子交換色譜圖Fig.2 Ion exchange chromatography of the antifungal protein from arugula seeds on Mono STM5/50GL

將ZMS1蛋白干粉溶解于NH4OAc緩沖液(10 mmol/L,pH4.6)中,經(jīng)0.22 μm濾膜后上樣至AKTA pure蛋白純化系統(tǒng)中的SuperdexTM75 10/300GL凝膠色譜柱,得到ZSU1、ZSU2和ZSU3三種組分(圖3)。經(jīng)抑菌實驗測得ZSU2組分具有抗菌活性,即ZSU2組分為目標(biāo)活性組分,本文章命名為ZSU2蛋白。收集目標(biāo)組分,透析干燥,并重復(fù)制備,以備后續(xù)研究。

圖3 芝麻菜種子抗菌蛋白的SuperdexTM 75 10/300GL凝膠過濾色譜圖Fig.3 Gel filtration chromatography of the antifungal protein from arugula seeds on SuperdexTM 75 10/300GL

2.2 Tricine-SDS-PAGE電泳

采用Tricine-SDS-PAGE電泳方法檢測ZSU2蛋白的純度以及分子量大小,由圖4結(jié)果中可知,ZSU2蛋白為單一條帶,分子量大小約為12 kDa左右,與油菜種子(9412 Da)[21]中純化的抗菌蛋白分子量相近。

圖4 芝麻菜抗菌蛋白Tricine-SDS-PAGE電泳圖Fig.4 Tricine-SDS-PAGE of the antifungal protein from arugula seeds注:ZSU2:芝麻菜抗菌蛋白ZSU2;M:蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 抑菌活性檢測

采用濾紙片擴散法,若樣品對真菌具有抑制作用,則濾紙片周圍菌絲生長受到抑制,出現(xiàn)半圓形的月牙狀抑菌圈。圖5的實驗結(jié)果表明,ZSU2對蘋果黑腐皮殼菌、凸臍蠕孢菌、玉米小斑病菌、落花生球腔菌、芭樂炭疽病菌、稻瘟菌、禾谷鐮刀菌、灰葡萄孢菌、尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌、小白菜炭疽菌和長柄鏈格孢菌12種植物病原真菌具有較強抑制活性,對擬盤多毛胞和煙草炭疽病菌抑制活性較弱。ZSU2蛋白對植物病原真菌具有廣譜抗性。油菜[22]、芥藍[23]和菜薹[7]等多種十字花科植物種子的抗菌蛋白對多種植物病原菌具有抑制活性,十字花科許多種子抗菌蛋白具有廣譜抗性的共性。

圖5 芝麻菜抗真菌蛋白抑菌活性Fig.5 Inhibitory activity of the antifungal protein from arugula seeds注:A-1:蘋果黑腐皮殼菌;A-2:凸臍蠕孢菌;A-3:玉米小斑病菌;A-4:落花生球腔菌;A-5:芭樂炭疽病菌;A-6:稻瘟菌;A-7:禾谷鐮刀菌;A-8:尖孢鐮刀菌;A-9:擬盤多毛孢;A-10:茄病鐮刀菌;A-11:灰葡萄孢菌;A-12:小白菜炭疽病菌;A-13:煙草炭疽病菌;A-14:長柄鏈格孢菌;CK:PBS緩沖液;T:20 μL芝麻菜抗真菌蛋白溶液。

2.4 芝麻菜抗菌蛋白穩(wěn)定性

將處理后的樣品10000 r/min離心5 min后,取上清液分別檢測其抑菌活性。由圖6A可以發(fā)現(xiàn),芝麻菜抗菌蛋白在40、60、80和100 ℃條件下水浴加熱處理15 min后,與未處理的芝麻菜抗菌蛋白樣品在小白菜炭疽病菌平板上,均有月牙狀抑菌圈出現(xiàn),且大小基本相同,而PBS緩沖液對照則無抑菌圈出現(xiàn),說明芝麻菜抗菌蛋白在熱處理后抑菌活性基本保持不變,也表明起抗菌作用的ZSU2蛋白具有良好的熱穩(wěn)定性。

圖6 溫度和pH對抗菌蛋白抑菌活性的影響Fig.6 Effect of temperature and pH on antibacterial activity of antimicrobial protein注:A. 熱穩(wěn)定性實驗,A中40、60、80、100分別對應(yīng)40、60、80、100 ℃水浴處理下蛋白加樣點;B. pH穩(wěn)定性實驗,B中1、2、3、11、12、13代表相應(yīng)pH處理的蛋白加樣點;圖A～B中,CK+:20 μL未處理抗菌蛋白溶液;CK-:20 μL PBS緩沖液。

將芝麻菜抗菌蛋白分別經(jīng)不同pH條件處理,測定其對pH的穩(wěn)定性。從圖6B中可以看出,芝麻菜抗菌蛋白在pH1～3和pH11～13的條件下處理后,與未處理的芝麻菜抗菌蛋白樣品在小白菜炭疽病菌平板上均有月牙狀抑菌圈出現(xiàn),且大小基本相同,而PBS緩沖液對照則無抑菌圈出現(xiàn),說明芝麻菜抗菌蛋白具有良好的耐酸耐堿活性,即能在極端pH的環(huán)境中保持較好的穩(wěn)定性。

將芝麻菜抗菌蛋白分別經(jīng)過20、50、100和150 mmol/L的CaCl2、FeCl3、KCl、MgCl2、MnCl2金屬鹽溶液處理,得到結(jié)果如表1,K+、Mg2+、Mn2+和Ca2+濃度在20～150 mmol/L時,Fe3+濃度在20～100 mmol/L時,芝麻菜抗菌蛋白具有良好的抗菌活性,Fe3+濃度達到150 mmol/L時,芝麻菜抗菌活性明顯減弱。說明芝麻菜抗菌蛋白具有較好的金屬離子穩(wěn)定性。

表1 ZSU2蛋白金屬離子穩(wěn)定性Table 1 Metal ion stability of ZSU2 protein

2.5 抗菌蛋白的抗真菌機理

采用剛果紅和熒光綠染色,激光共聚焦顯微鏡觀察的方法,檢測抗菌蛋白處理后，小白菜炭疽病菌菌絲尖端幾丁質(zhì)的積累量和菌絲細胞膜透性的變化,以等量PBS緩沖液處理的小白菜炭疽病菌菌絲作對照,判斷抗菌蛋白是否通過真菌菌絲尖端幾丁質(zhì)積累和改變細胞膜透性,從而抑制真菌的生長。實驗結(jié)果如圖7～圖8。

圖7 小白菜炭疽病菌剛果紅染色共聚焦電鏡圖Fig.7 Fluorescence micrope images of Colletotrichum higginsianum hyphae stained with Congo red

剛果紅(Congo red)染料能夠結(jié)合菌絲細胞壁上的幾丁質(zhì),從而將菌絲染色。本研究采用小白菜炭疽病菌為指示菌,由圖7可知,ZSU2蛋白處理組菌絲尖端染色明顯強于對照組,即經(jīng)過ZSU2蛋白處理的小白菜炭疽病菌菌絲尖端出現(xiàn)了幾丁質(zhì)的積累,說明芝麻菜種子抗菌蛋白可能是通過菌絲尖端幾丁質(zhì)積累,從而使菌絲生長受阻,進而起到抑菌作用。

熒光綠(SYTOX Green)是一種核酸染料,能夠輕松透過質(zhì)膜受損的細胞使核酸染色,不能穿過完整的活的細胞膜。由圖8可知,ZSU2蛋白處理組菌絲內(nèi)有綠色熒光出現(xiàn),而對照組菌絲內(nèi)無任何熒光,說明ZSU2蛋白抑制小白菜炭疽病菌時,小白菜炭疽病菌絲選擇透過性增大,細胞膜完整性被破壞,從而使得熒光染料進入菌絲細胞內(nèi)而顯示綠色熒光,對照組菌絲細胞膜未受到影響而不著色。在對紫甘藍種子抗菌蛋白抑制落花生球腔菌(Mycosphaerellaarachidicola)時,抗菌蛋白同樣引起細胞選擇透過性的改變[16]。因而推測,ZSU2蛋白可導(dǎo)致小白菜炭疽病菌菌絲細胞膜選擇透過性的改變,進而抑制菌絲的生長。

圖8 小白菜炭疽病菌熒光綠染色共聚焦電鏡圖Fig.8 Fluorescence micrope images of Colletotrichum higginsianum hyphae stained with SYTOX Green

3 結(jié)論

本研究通過破碎離心過濾、SP-Sepharose柱層析、Mono STM5/50GL柱層析和SuperdexTM75 10/300GL柱層析等步驟,從芝麻菜種子中分離純化出一種抗菌蛋白ZSU2。對ZSU2蛋白進行Tricine-SDS-PAGE電泳鑒定,對比發(fā)現(xiàn),經(jīng)凝膠過濾柱層析后得到的ZSU2蛋白達到電泳純,且相對分子質(zhì)量約為12 kDa。通過純化的ZSU2蛋白對蘋果黑腐皮殼菌、凸臍蠕孢菌、玉米小斑病菌、落花生球腔菌、芭樂炭疽病菌、稻瘟菌、禾谷鐮刀菌、灰葡萄孢菌、尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌、小白菜炭疽菌和長柄鏈格孢菌共12種植物病原真菌的抑菌實驗證明,ZSU2蛋白具有廣譜的抗真菌活性。根據(jù)溫度、pH和金屬離子的穩(wěn)定性實驗,可知ZSU2蛋白具有良好的耐熱、耐酸堿和金屬陽離子耐受能力,對環(huán)境的適應(yīng)能力較好。通過剛果紅、熒光綠染色,激光共聚焦電子顯微鏡觀察表明,經(jīng)ZSU2蛋白處理的真菌菌絲尖端幾丁質(zhì)積累增加、細胞膜透性增大,細胞膜完整性被破壞,從而可能抑制了真菌菌絲的生長。