賈振宇,孫慧慧,郝旭昇,康慎敏,鄭曉營,郭 都,孫 怡,石 超,夏效東

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西楊凌 712100)

阪崎克羅諾腸桿菌是一種革蘭氏陰性、兼性厭氧的無芽孢桿菌[1],能夠引起菌血癥、敗血癥、腦膜炎及壞死性小腸結(jié)腸炎,主要致病人群為新生兒、早產(chǎn)兒、低出生體重兒及免疫力低下的嬰幼兒和成人,致死率高達(dá)50%～80%[2-3]。有研究表明,阪崎克羅諾腸桿菌可以從乳制品、干肉、牛奶、水果、蔬菜、大米等多種食物中分離得到[4]。該菌對酸性、高溫、干燥、滲透壓等環(huán)境壓力都有一定的耐受能力,這一特點(diǎn)使其能夠更好地在食物及環(huán)境中生存,進(jìn)而導(dǎo)致食源性疾病[5-6]。

抗生素耐藥性已成為重要的公共健康問題,發(fā)現(xiàn)新的抗菌藥物對這一難題的解決至關(guān)重要[7]。因此，人們越來越關(guān)注合成化合物與抗生素過度使用的安全性,對利用天然抗菌物質(zhì)研制食品防腐劑的興趣也逐漸增加[3]。已有研究發(fā)現(xiàn)多種植物精油具有抗細(xì)菌、真菌等作用[8-9]。

香芹酚(2-甲基-5-異丙基苯酚)是一種酚類單萜物質(zhì),存在于多種芳香植物和植物精油中,已有報(bào)道表明這類單萜物質(zhì)具有抑菌、殺菌、抗腫瘤、抗癌等活性[10]。百里酚(5-甲基-2-異丙基苯酚)與香芹酚互為同分異構(gòu)體,區(qū)別為酚羥基在苯環(huán)上的位置不同。常溫下,香芹酚為無色至淡黃色的油狀液體,百里酚為無色半透明結(jié)晶。香芹酚和百里酚目前已被歐盟委員會(huì)認(rèn)定為可作為食品中的調(diào)味劑(Regulation EU 872/2012),且被美國食品藥品管理局認(rèn)定為公認(rèn)安全的食品添加劑(21 CFR 182.60)。在許多報(bào)道中，香芹酚和百里酚相比于其他藥劑，具有更加突出的抑菌效果[5,11-12],但兩者對阪崎克羅諾腸桿菌的抑菌作用及機(jī)制尚鮮有報(bào)道。另外,有研究顯示，酚類化合物中的羥基官能團(tuán)在抑菌活性中發(fā)揮重要作用[13-14],尤其是可能通過影響細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及功能來影響細(xì)菌生長[15],但目前尚不明確物質(zhì)結(jié)構(gòu)中羥基位置的不同是否對抑菌效果有顯著影響[14,16]。

本研究旨在確定和比較百里酚和香芹酚對阪崎克羅諾腸桿菌的抑菌效果,并且通過測定細(xì)胞膜電位、胞內(nèi)ATP濃度、胞內(nèi)pH、細(xì)胞膜完整性的改變及觀察顯微結(jié)構(gòu)的變化，探討可能的抑菌機(jī)制,為其作為天然抗菌劑在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

阪崎克羅諾腸桿菌(Cronobactersakazakii)ATCC 29544、ATCC 29004、ATCC 12868、ATCCBAA-894 美國模式菌株收集中心;阪崎克羅諾腸桿菌分離菌株12-2、14-15、18-7、18-8和18-13 由西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品微生物研究團(tuán)隊(duì)分離;嬰幼兒奶粉及米粉;胰蛋白胨大豆瓊脂(Tryptone soya agar,TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(Tryptic Soy Broth,TSB) 北京陸橋技術(shù)股份有限公司;百里酚、香芹酚(HPLC≥98%) 成都曼斯特生物科技有限公司;LIVE/DEAD? BacLightTM細(xì)菌活性檢測試劑盒 賽默飛世爾科技公司;DIBAC4(3)熒光探針、cFDA-SE熒光探針 美國Sigma公司;ATP檢測試劑盒 碧云天生物技術(shù)公司;磷酸鹽緩沖溶液(Phosohate buffered saline,PBS) 氯化鈉 8.0 g/L,氯化鉀 0.2 g/L,十二水合磷酸氫鈉 3.62 g/L,磷酸二氫鉀 0.24 g/L。

YT-CJ-LND型超凈工作臺(tái) 北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司;GHX-9050B-2型細(xì)菌培養(yǎng)箱 上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;5804R型低溫冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司;CD-UPT-1型分體式超純水機(jī) 成都越純科技有限公司;Smart SpecTMplus分光光度計(jì) 美國BIO-RAD公司;Bioscreen C微生物全自動(dòng)生長曲線分析儀 芬蘭Bioscreen公司;InfiniteTMM200 PRO多功能酶標(biāo)儀 瑞士帝肯(TECAN)集團(tuán)公司;Starter 2100/3C PropH計(jì) 上海洪紀(jì)設(shè)備有限公司;SCIENTZ-IID型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;S-4800型場發(fā)射掃描電鏡 日本Hitachi公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 將凍存于-80 ℃的阪崎克羅諾腸桿菌菌種ATCC 29544采用劃線法在TSA平板上活化,37 ℃培養(yǎng)12 h后，挑取單菌落接種于30 mL TSB中,將培養(yǎng)液置于37 ℃培養(yǎng)18 h,培養(yǎng)后的菌懸液經(jīng)離心(5000×g,15 min,4 ℃)去除上清液,PBS(pH7.2)洗滌兩次后,再以一定量的PBS(pH7.2)重新懸浮菌體沉淀,用分光光度計(jì)測定并調(diào)整菌懸液的OD600 nm=0.5,使菌體濃度約為108CFU/mL。

1.2.2 百里酚和香芹酚對阪崎克羅諾腸桿菌最小抑菌濃度的測定 最小抑菌濃度(Minimal Inhibitory Concentrations,MIC)采用瓊脂稀釋法測定[17]。將TSA培養(yǎng)基高溫高壓滅菌并冷卻至45 ℃左右,加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,再向其中加入百里酚或香芹酚,使其各孔的終濃度為800、600、400、300、200、150、100、75、50和37.5 μg/mL,充分吹打混勻。等待培養(yǎng)基在室溫下凝固后,按照1.2.1中的方法活化菌種,并制備菌懸液,調(diào)整菌懸液吸光度至OD600 nm=0.5(108CFU/mL)。隨后吸取2 μL菌懸液接種至各孔中央,將24孔板置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀測結(jié)果,其中MIC為抑制阪崎克羅諾腸桿菌生長的百里酚或香芹酚的最低濃度。實(shí)驗(yàn)以不含有百里酚或香芹酚的TSA培養(yǎng)基作為陰性對照,以含有1 mg/mL氨芐西林的TSA培養(yǎng)基作為陽性對照,其中,氨芐西林溶液使用無菌水配制,并用0.22 μm濾膜過濾。

1.2.3 百里酚和香芹酚對阪崎克羅諾腸桿菌生長曲線的影響 參照Silvaangulo等[18]的方法。首先按照1.2.1將阪崎克羅諾腸桿菌菌種ATCC 29544活化菌種,并制備菌懸液,用TSB肉湯調(diào)整菌懸液OD600 nm=0.5并稀釋100倍,使菌體濃度約為106CFU/mL。向96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入125 μL菌懸液和百里酚或香芹酚溶液(用1% DMSO溶解,TSB配制),使其各孔中百里酚和香芹酚的終濃度分別為MIC、1/2MIC和1/4MIC。樣品對照組添加125 μL菌懸液及125 μL TSB,背景空白對照組添加250 μL TSB。設(shè)置微生物全自動(dòng)生長曲線分析儀,培養(yǎng)溫度為37 ℃,每隔1 h檢測波長600 nm下的吸光度值。以時(shí)間(h)為橫坐標(biāo),菌懸液在波長600 nm下的吸光度值為縱坐標(biāo),繪制生長曲線。

1.2.4 百里酚和香芹酚對阪崎克羅諾腸桿菌膜電位的影響 阪崎克羅諾腸桿菌細(xì)胞膜電位的測定參照Sanchez等[19]的方法進(jìn)行,具體如下:菌液制備同1.2.1,將125 μL菌懸液加入黑色96孔細(xì)胞酶標(biāo)板中,置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。隨后加入百里酚或香芹酚溶液(用PBS緩沖溶液配制),使其終濃度分別為0(對照組)、2MIC和4MIC,培養(yǎng)30 min。再向每孔中加入1 μmol/L熒光染料DiBAC4(3),37 ℃處理5 min后，使用多功能酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度,設(shè)置激發(fā)和發(fā)射波長分別為492 nm和515 nm,激發(fā)和發(fā)射縫隙寬度分別為3 nm和5 nm。測得的各組熒光值均減去對應(yīng)背景空白熒光值。

1.2.5 百里酚和香芹酚對阪崎克羅諾腸桿菌胞內(nèi)pH的影響 阪崎克羅諾腸桿菌胞內(nèi)pH的測定參照Li等[20]的方法進(jìn)行,菌液制備同1.2.1,將菌液離心(5000×g,10 min,4 ℃),去除上清液,使用磷酸鉀緩沖溶液洗滌一次,并調(diào)整菌懸液吸光度為OD600 nm=0.5。以50 mmol/L HEPES緩沖溶液(含5 mmol/L EDTA,pH=8.0)洗滌菌體兩次，并重新懸浮于20 mL的HEPES緩沖溶液。隨后加入3 μmol/L cFDA-SE熒光探針,在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育20 min,以50 mmol/L磷酸鉀緩沖溶液(含10 mmol/L MgCl2,pH=7.0)洗滌一次，并將菌體重懸于10 mL該溶液。加入10 μmol/L葡萄糖溶液并在37 ℃培養(yǎng)30 min,以消除非共軛的cFSE熒光探針。最后,使用PBS緩沖溶液(pH=7.0)洗滌菌體兩次,在冰上保存。用磷酸鉀緩沖溶液配制百里酚及香芹酚溶液,添加至菌懸液中,濃度設(shè)置為0(對照組)、2MIC和4MIC,37 ℃下培養(yǎng)20 min。將樣品加入黑色96孔細(xì)胞酶標(biāo)板中,使用多功能酶標(biāo)儀測定熒光強(qiáng)度,設(shè)置激發(fā)波長為490 nm和440 nm,發(fā)射波長為520 nm,激發(fā)和發(fā)射縫隙寬度分別為9 nm和20 nm,檢測溫度為25 ℃。檢測不含菌懸液的PBS緩沖溶液(百里酚、香芹酚濃度為:0、2MIC和4MIC)的背景空白熒光值,測得的各組熒光值均減去對應(yīng)背景空白熒光值。配制一系列不同pH(3、4、5、6、7、8、9、10)的緩沖溶液,使用cFDA-SE熒光探針檢測熒光強(qiáng)度,構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。pH緩沖溶液由甘氨酸(50 mmol/L)、檸檬酸(50 mmol/L)、Na2HPO4·2H2O(50 mmol/L)和KCl(50 mmol/L)配制而成,使用NaOH和HCl調(diào)整pH。加入纈氨霉素(10 μmol/L)和尼日利亞菌素(10 μmol/L),使細(xì)菌胞內(nèi)pH和胞外pH相等。檢測溫度同為25 ℃。

1.2.6 百里酚和香芹酚對阪崎克羅諾腸桿菌胞內(nèi)ATP濃度的影響 阪崎克羅諾腸桿菌胞內(nèi)ATP濃度的測定方法參考Sanchez等[19]的方法,具體為:按照1.2.1制備菌懸液,向離心管中加入2 mL菌懸液,之后加入不同濃度的百里酚、香芹酚溶液(用PBS緩沖溶液配制),使其兩種物質(zhì)濃度分別達(dá)到0、2MIC和4MIC,置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。隨后對樣品進(jìn)行超聲處理,裂解菌體細(xì)胞。每個(gè)樣品超聲結(jié)束后立即置于100 ℃溫度下處理2～3 min,使樣品中ATP酶滅活。將樣品離心(5000×g,5 min),取上清液。根據(jù)ATP檢測試劑盒說明書將ATP檢測工作液加入白色96孔酶標(biāo)板,放置3～5 min后加入樣品,使用多功能酶標(biāo)儀測定化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。同時(shí),使用ATP檢測裂解液將ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成0.01、0.1、1和10 μmol/L 4個(gè)濃度梯度,繪制化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與ATP濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的ATP濃度。

1.2.7 百里酚和香芹酚對阪崎克羅諾腸桿菌細(xì)胞膜完整性的影響 阪崎克羅諾腸桿菌細(xì)胞膜完整性的測定參照Shi等[21]的方法,使用LIVE/DEAD? BacLight細(xì)菌活性檢測試劑盒進(jìn)行檢測。具體方法為:菌液制備同1.2.1,將菌液離心(10000×g,15 min,4 ℃),去除上清液后用0.85% NaCl溶液洗滌菌體兩次。隨后加入2 mL的0.85% NaCl溶液重新懸浮,分別取1 mL菌懸液加入到20 mL的0.85%NaCl溶液(活菌組)和70%異丙醇溶液(死菌組)中,置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h(每15 min搖勻一次)。離心(10000×g,10 min,4 ℃),棄上清,使用0.85% NaCl洗滌2～3次,將兩組菌懸液吸光度均調(diào)整至OD600 nm=0.5(兩組誤差不超過0.01)。添加百里酚或香芹酚于處理組菌液中,使其濃度為0、2MIC和4MIC,在37 ℃下放置30 min,離心,去除上清液,加入相同體積的0.85% NaCl溶液重新懸浮菌液。之后以不同體積活菌組菌懸液和死菌組菌懸液配制不同活菌比例(0%,10%,50%,90%,100%)的菌懸液作為標(biāo)準(zhǔn)曲線組,在96孔黑色酶標(biāo)板中設(shè)置樣品空白對照組(0.85%NaCl溶液)、樣品處理組和標(biāo)準(zhǔn)曲線組,并向所有孔內(nèi)加入100 μL SYTO/PI的2X染料,充分吹打混勻。將96孔酶標(biāo)板置于25 ℃下培養(yǎng)10 min。使用多功能酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度,SYTO染料的激發(fā)/發(fā)射波長為485/542 nm,PI染料的激發(fā)/發(fā)射波長為485/610 nm。

1.2.8 百里酚、香芹酚對阪崎克羅諾腸桿菌細(xì)胞形態(tài)的影響 阪崎克羅諾腸桿菌細(xì)胞形態(tài)的觀察參照Li等[22]的方法,使用場發(fā)射掃描電鏡進(jìn)行觀測,具體為:按照1.2.1制備菌懸液,將添加不同濃度百里酚或香芹酚(0、2MIC和4MIC)的菌液(OD600 nm=0.5)置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。離心(5000×g,10 min,4 ℃),棄上清,用PBS緩沖溶液(pH=7.0)洗滌菌體兩次,將菌體重新懸浮于2.5%戊二醛-PBS溶液中固定12 h(4 ℃)后,依次使用PBS、無菌水洗滌菌體,并將菌體置于1%(v/v)鋨酸中固定5 h,隨后使用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液(30%、50%、70%、80%、90%和100%)梯度洗脫,每次10 min。將樣品滴加至專用圓形小玻片并貼附于場發(fā)射掃描電鏡載物臺(tái),樣品抽真空脫水2 h后噴金處理,使用場發(fā)射掃描電鏡觀測細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值,采用SPSS 20.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(analysis of variance,ANOVA),采用Ducan法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),p<0.05表示顯著,p<0.01表示極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 百里酚和香芹酚對阪崎克羅諾腸桿菌的最小抑菌濃度測定結(jié)果

百里酚和香芹酚對9株阪崎克羅諾腸桿菌的最小抑菌濃度結(jié)果如表1所示,均在0.1～0.2 mg/mL之間,其中兩者對ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 29544、ATCC 29004和ATCC 12868的最小抑菌濃度均為0.1 mg/mL。該結(jié)果表明,香芹酚和百里酚對阪崎克羅諾腸桿菌均有良好的抑制效果,且兩者無明顯差異。本實(shí)驗(yàn)選取ATCC 29544菌株進(jìn)行后續(xù)的研究。

表1 百里酚和香芹酚對阪崎克羅諾腸桿菌的最小抑菌濃度Table 1 Minimum inhibitory concentrations of thymol and carvacrol against Cronobacter sakazakii

2.2 百里酚和香芹酚對阪崎克羅諾腸桿菌生長曲線的影響

圖1表明,百里酚和香芹酚都能夠明顯降低阪崎克羅諾腸桿菌ATCC 29544的生長速率及最大菌體濃度,并且其效果隨天然物質(zhì)濃度增加而增強(qiáng)。在MIC濃度下,百里酚和香芹酚能夠完全抑制阪崎克羅諾腸桿菌ATCC 29544的生長。兩種物質(zhì)的1/2MIC、1/4MIC濃度組與對照組相比,阪崎克羅諾腸桿菌在對數(shù)期的生長速率差別不大,但處理濃度越低,穩(wěn)定期菌體濃度越大。由此可以看出,百里酚和香芹酚對阪崎克羅諾腸桿菌生長曲線的作用呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性。

圖1 阪崎克羅諾腸桿菌在含有不同濃度百里酚和香芹酚的TSB中的生長曲線Fig.1 Growth curves of C. sakazakii ATCC 29544 cultured in TSB with various concentrations of thymol and carvacrol

2.3 百里酚和香芹酚對阪崎克羅諾腸桿菌膜電位的影響

實(shí)驗(yàn)所使用的陰離子熒光染料DiBAC4(3)本身不發(fā)光,當(dāng)進(jìn)入細(xì)胞后與胞漿內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合可發(fā)出熒光。若DiBAC4(3)進(jìn)細(xì)胞后發(fā)出的熒光通過鍵合激活而增強(qiáng),說明細(xì)胞膜膜電位增加,則說明細(xì)胞出現(xiàn)去極化;反之則表示細(xì)胞超極化[23-24]。正常情況下,未經(jīng)處理的阪崎克羅諾腸桿菌細(xì)胞膜呈現(xiàn)外負(fù)內(nèi)正,鈉鉀離子的電壓門控制通道關(guān)閉,該狀態(tài)被稱為膜的極化狀態(tài)。而經(jīng)過百里酚和香芹酚處理的菌體膜電位向膜內(nèi)負(fù)值增大方向變化,鉀離子流出細(xì)胞,熒光強(qiáng)度降低細(xì)胞出現(xiàn)超極化[25-26]。超極化已被報(bào)道是一種重要的細(xì)胞膜損傷類型[24,27]。從圖2可知,百里酚及香芹酚處理后阪崎克羅諾腸桿菌膜電位均出現(xiàn)超極化(相對熒光強(qiáng)度負(fù)值)。經(jīng)0.4 mg/mL香芹酚處理,細(xì)菌細(xì)胞膜電位顯著改變(p<0.05),經(jīng)0.2及0.4 mg/mL百里酚處理,細(xì)菌細(xì)胞膜電位均極顯著改變(p<0.01)。且同濃度下,百里酚處理菌體得到的相對熒光強(qiáng)度的絕對值比香芹酚更大。由此可見,與香芹酚作用相比,百里酚對阪崎克羅諾腸桿菌膜電位的作用效果更加明顯。

圖2 百里酚和香芹酚對阪崎克羅諾腸桿菌ATCC 29544細(xì)胞膜電位的影響Fig.2 Effects of thymol and carvacrol on the membrane potentials of C. sakazakii ATCC 29544注:*表示與對照組相比,差異顯著(p<0.05),**表示與對照組相比,差異極顯著(p<0.01)。

2.4 百里酚和香芹酚對阪崎克羅諾腸桿菌胞內(nèi)pH的影響

實(shí)驗(yàn)中用到的細(xì)菌胞內(nèi)pH檢測方法是基于cFDA-SE能被細(xì)胞胞漿中的酯酶催化為發(fā)出綠色熒光的cFSE,而過量未偶聯(lián)到細(xì)胞蛋白質(zhì)上的cFSE可在葡萄糖存在的條件下短時(shí)間孵育得以清除的原理[28]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，490 nm與440 nm的熒光比值與阪崎克羅諾腸桿菌的胞內(nèi)pH有良好的線性關(guān)系,線性擬合方程為:y=-0.9085x+6.2556(R2=0.988),因此可通過熒光比值計(jì)算細(xì)菌胞內(nèi)pH。由圖3可知,經(jīng)百里酚或香芹酚處理后,阪崎克羅諾腸桿菌胞內(nèi)pH均極顯著降低(p<0.01),表現(xiàn)為:未經(jīng)處理的阪崎克羅諾腸桿菌胞內(nèi)pH為5.45±0.06,經(jīng)濃度為0.2和0.4 mg/mL的百里酚處理后,阪崎克羅諾腸桿菌胞內(nèi)pH降低分別為5.16±0.05和4.96±0.06。經(jīng)濃度為0.2和0.4 mg/mL的香芹酚處理后,阪崎克羅諾腸桿菌胞內(nèi)pH降低分別為5.05±0.05和4.97±0.05。同時(shí),結(jié)果也表明，相同濃度的百里酚和香芹酚對阪崎克羅諾腸桿菌胞內(nèi)pH的影響效果無顯著差異(p>0.05)。胞內(nèi)pH對細(xì)菌的多種生理功能緊密相關(guān),如DNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成、酶活性、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性等[29-30]。胞內(nèi)pH的改變表明百里酚和香芹酚使阪崎克羅諾腸桿菌的細(xì)胞膜受損。

圖3 百里酚和香芹酚對阪崎克羅諾腸桿菌ATCC 29544胞內(nèi)pH的影響Fig.3 Effects of thymol and carvacrol on the intracellular pH of C. sakazakii ATCC 29544注:**表示與對照組相比,差異極顯著(p<0.01);圖4同。

2.5 百里酚和香芹酚對阪崎克羅諾腸桿菌胞內(nèi)ATP濃度的影響

實(shí)驗(yàn)根據(jù)螢火蟲熒光素酶需要ATP提供能量催化熒光素從而產(chǎn)生熒光,以及在一定濃度范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度和ATP的濃度成正比的原理,構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)測定,細(xì)菌胞內(nèi)ATP濃度與相對熒光強(qiáng)度有良好的線性關(guān)系(y=42891x+1647.9,R2=1),可通過相對熒光強(qiáng)度的變化確定細(xì)菌胞內(nèi)ATP濃度的增減。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,百里酚及香芹酚對阪崎克羅諾腸桿菌胞內(nèi)ATP濃度均有極顯著的降低作用(p<0.01)(圖4)。未經(jīng)處理的阪崎克羅諾腸桿菌胞內(nèi)ATP濃度為0.584 μmol/L。經(jīng)濃度為0.2和0.4 mg/mL百里酚處理后,阪崎克羅諾腸桿菌胞內(nèi)ATP濃度分別降低至0.051 μmol/L和0.048 μmol/L。經(jīng)濃度為0.2和0.4 mg/mL香芹酚處理后,阪崎克羅諾腸桿菌胞內(nèi)ATP濃度分別降為0.030和0.027 μmol/L。由此可得,0.2 mg/mL的兩種物質(zhì)即可使阪崎克羅諾腸桿菌的胞內(nèi)ATP濃度降至比較低的水平,濃度依賴效應(yīng)不太明顯,此外香芹酚比百里酚降低胞內(nèi)ATP濃度的效果更加明顯。ATP對細(xì)菌的生長、繁殖、代謝、酶反應(yīng)等都至關(guān)重要,胞內(nèi)ATP濃度也是一項(xiàng)評價(jià)微生物可利用能量的重要參數(shù),因此是檢測抑菌效果的重要目標(biāo)參數(shù)之一[31-32]。ATP濃度的下降可能是由于細(xì)胞膜通透性改變,致使細(xì)胞質(zhì)ATP流出[33]。

圖4 百里酚和香芹酚對阪崎克羅諾腸桿菌ATCC 29544胞內(nèi)ATP的影響Fig.4 Effects of thymol and carvacrol on intracellular ATP production by C. sakazakii ATCC 29544

2.6 百里酚和香芹酚對阪崎克羅諾腸桿菌細(xì)胞膜完整性的影響

本實(shí)驗(yàn)用到的LIVE/DEAD? BacLightTM細(xì)菌活性檢測試劑盒中共包含PI和SYTO? 9兩種核酸染料,其中SYTO 9是一種綠色熒光小分子染料,它可以穿透完整的細(xì)胞膜,能被用于識別具有完整細(xì)胞膜的菌體,PI為大分子紅色熒光染料,僅能穿過不完整的細(xì)胞膜,可被用于識別細(xì)胞膜受損的菌體[34]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,綠色熒光強(qiáng)度與細(xì)胞膜完整的細(xì)菌百分比有著良好的線性關(guān)系,從熒光強(qiáng)度能夠反映出含有完整細(xì)胞膜的細(xì)菌比例。由表2可知,與對照組相比,2倍MIC的百里酚對阪崎克羅諾腸桿菌細(xì)胞膜的完整性破壞作用不顯著(p>0.05),4倍MIC的百里酚作用極顯著(p<0.01)。經(jīng)0.2和0.4 mg/mL百里酚處理后,阪崎克羅諾腸桿菌細(xì)胞膜完整性分別變?yōu)?7.9%和15.0%。香芹酚處理對阪崎克羅諾腸桿菌細(xì)胞膜的完整性有極顯著的破壞作用(p<0.01)。經(jīng)0.2和0.4 mg/mL香芹酚處理后,細(xì)胞膜完整性分別為31.1%和11.9%?？梢娤闱鄯訉嫫榭肆_諾腸桿菌細(xì)胞膜完整性的破壞作用比百里酚更加明顯。

表2 百里酚和香芹酚對阪崎克羅諾腸桿菌ATCC 29544細(xì)胞膜完整性的影響Table 2 Effects of thymol and carvacrol on the membrane integrity of C. sakazakii ATCC 29544

2.7 百里酚和香芹酚對阪崎克羅諾腸桿菌細(xì)胞形態(tài)的影響

百里酚和香芹酚對阪崎克羅諾腸桿菌的細(xì)胞形態(tài)有明顯的影響,如圖5所示。未經(jīng)處理的阪崎克羅諾腸桿菌(圖5A)呈桿狀,形態(tài)飽滿,胞體光滑。經(jīng)0.2 mg/mL百里酚處理后,部分細(xì)菌出現(xiàn)表面塌陷,菌體變形(圖5B)。經(jīng)0.4 mg/mL百里酚處理后,細(xì)菌細(xì)胞表面出現(xiàn)嚴(yán)重的皺縮和塌陷,細(xì)胞膜被分解,出現(xiàn)碎片(圖5C)。香芹酚也呈現(xiàn)相似的結(jié)果。由此可得,百里酚、香芹酚都能改變阪崎克羅諾腸桿菌細(xì)胞形態(tài),且其對細(xì)胞形態(tài)的影響隨濃度升高而增大。

圖5 掃描電鏡圖(20000×)Fig.5 Scanning electron micrographs(20000×)注:A.未經(jīng)百里酚和香芹酚處理;B. 0.2 mg/mL百里酚處理4 h;C. 0.4 mg/mL百里酚處理4 h;D. 0.2 mg/mL香芹酚處理4 h;E. 0.4 mg/mL香芹酚處理4 h;標(biāo)尺為2 μm。

3 結(jié)論與討論

以瓊脂稀釋法測定百里酚、香芹酚對阪崎克羅諾腸桿菌的抑菌能力,結(jié)果表明，兩種物質(zhì)對9株阪崎克羅諾腸桿菌的MIC范圍均在0.1～0.2 mg/mL之間。之后在此基礎(chǔ)上,測定了百里酚和香芹酚對阪崎克羅諾腸桿菌ATCC 29544的生長曲線、膜電位、胞內(nèi)pH、胞內(nèi)ATP濃度、細(xì)胞膜完整性的影響。結(jié)果顯示,0.1 mg/mL的百里酚和香芹酚均能在肉湯中完全抑制阪崎克羅諾腸桿菌ATCC 29544的生長繁殖,0.2 mg/mL的百里酚及0.4 mg/mL的香芹酚能夠使細(xì)菌膜電位出現(xiàn)極顯著的超極化(p<0.01),0.4 mg/mL百里酚和香芹酚可使阪崎克羅諾腸桿菌ATCC 29544胞內(nèi)pH由5.45降低為4.96和4.97,并且0.4 mg/mL百里酚和香芹酚處理可使胞內(nèi)ATP濃度由0.584 μmol/L降低為0.048、0.027 μmol/L,使細(xì)胞膜完整性分別降低85.0%和88.1%。最后實(shí)驗(yàn)通過場發(fā)射掃描電鏡觀察菌體細(xì)胞形態(tài)的改變,結(jié)果表明兩者均使菌體干癟皺縮,細(xì)胞膜出現(xiàn)孔洞甚至裂解成碎片。

一般認(rèn)為,阪崎克羅諾腸桿菌的主要致病對象為嬰幼兒,能夠引起腦膜炎、菌血癥等疾病,疾病控制和防治中心的數(shù)據(jù)曾指出,每年全球約有六例克羅諾菌的感染病例[2]。嬰幼兒感染阪崎克羅諾腸桿菌的主要途徑是嬰幼兒配方奶粉,有研究指出被該菌污染的嬰幼兒配方奶粉與克羅諾菌的感染具有流行病學(xué)上的直接聯(lián)系[2,35]。日常生活中,人們通常使用熱處理進(jìn)行殺菌,世界衛(wèi)生組織也建議使用70 ℃的熱水沖調(diào)嬰幼兒配方奶粉[36]。但高溫可能會(huì)使奶粉中部分營養(yǎng)成分受到破壞[37],因此越來越多的研究者提出在食品中添加抗菌物質(zhì),從而達(dá)到預(yù)防和控制阪崎克羅諾腸桿菌等食源性致病菌的目的。

百里酚和香芹酚是百里香和牛至精油中的主要成分[38],也是美國食品藥品監(jiān)督管理局在調(diào)味劑和相關(guān)物質(zhì)類別下認(rèn)可的食品添加劑[39],具有較好的安全性以及在食品中較大的應(yīng)用價(jià)值。目前已有研究表明，百里酚和香芹酚具有較強(qiáng)的抗菌能力,對兩種物質(zhì)的相關(guān)應(yīng)用也十分豐富,例如基于兩種物質(zhì)制作微膠囊[40]、抗菌膜[41],與其他抑菌劑進(jìn)行協(xié)同抑菌等[42]。

綜上所述,百里酚和香芹酚對阪崎克羅諾腸桿菌具有明顯的抗菌活性,且主要是通過損傷細(xì)菌細(xì)胞膜發(fā)揮其抑制作用。在本研究中,百里酚和香芹酚并未顯示出因酚羥基位置及物理狀態(tài)不同而造成的抑菌效果的差異。研究為百里酚和香芹酚作為天然抑菌劑應(yīng)用到食品中,并有效控制阪崎克羅諾腸桿菌提供了一定的理論依據(jù)。然而這兩種物質(zhì)對食品感官品質(zhì)的影響仍需在實(shí)際應(yīng)用前進(jìn)一步深入研究。