羅孝平,張海暉,段玉清,*,黃 婷,陳光英

(1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013；2.海南師范大學(xué)熱帶藥用植物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南海口 571158)

蘿卜葉為十字花科植物蘿卜的根生葉,現(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)研究發(fā)現(xiàn),蘿卜葉的營養(yǎng)成分在許多方面都高于蘿卜[7]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,蘿卜葉具有促進(jìn)胃腸蠕動、治療胃潰瘍、抗氧化、降血壓及降血糖等活性[8-11]。Kim等[12]報(bào)道蘿卜葉中含有豐富的多酚和黃酮類成分,分別為52.48 mg/100 g干重和100.80 mg/100 g干重。多酚是廣泛存在于植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物,多酚具有很好的抗氧化活性,清除自由基并抑制自由基的產(chǎn)生[13-14],多酚還具有多種生物活性,如抗腫瘤、抗心血管疾病、抗輻射等。同時(shí),研究發(fā)現(xiàn)多酚表現(xiàn)出較強(qiáng)的延緩衰老活性[15-16],而蘿卜葉是否具有延緩衰老活性并未見報(bào)道。

本文對蘿卜葉乙醇提取物進(jìn)行不同極性溶劑萃取分部,測定各極性部位中多酚和黃酮含量,并以果蠅為模式生物,考察各極性部位對果蠅壽命、果蠅體內(nèi)抗氧化酶及其性活力等的影響,旨在探討蘿卜葉提取物不同極性部位延緩衰老的生物活性,為蘿卜葉的深度開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料與儀器

蘿卜葉 購于當(dāng)?shù)夭耸袌?鎮(zhèn)江),經(jīng)江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院段玉清教授鑒定為紅皮蘿卜,Red Raphanus sativus,經(jīng)涼曬、烘干(35 ℃,24 h)、粉碎、過60目篩,置于-20 ℃冷藏備用;野生型黑腹果蠅 由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)遺傳學(xué)研究室提供;沒食子酸(>98%)和蘆丁(>98%) 南京春秋生物工程有限公司;福林酚、乙醇、碳酸氫鈉、氫氧化鈉等分析純試劑 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

DFT-100手提式高速中藥粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司;Spectrume 190全波長自動酶標(biāo)儀 美國Molecular device 公司;SW-CJ-ID型凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;TGL-16高速臺式冷凍離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘿卜葉提取制備 蘿卜葉不同極性部位制備參照文獻(xiàn)[17]的方法,并加以改進(jìn)。稱取1 kg蘿卜葉,以液料比為15∶1 (mL/g)的比例加入95%乙醇,于50 ℃水浴中浸提8 h,期間每30 min攪拌1次。浸提結(jié)束后,冷卻過濾,殘?jiān)貜?fù)提取2次,合并濾液,45 ℃下減壓濃縮回收溶劑,得到蘿卜葉乙醇浸膏,將蘿卜葉乙醇浸膏用少量的蒸餾水溶解,盡量達(dá)到真溶液后,依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水飽和正丁醇，按1∶2體積比萃取,每種溶劑萃取3次,分別減壓濃縮回收各溶劑,分別得到石油醚部位(PERs)、氯仿部位(CRs)、乙酸乙酯部位(EARs)、水飽和正丁醇部位(WBRs)和水部位(AQRs)浸膏,經(jīng)冷凍干燥,各部位保存于棕色瓶中,置于-20 ℃?zhèn)溆谩８鞑课惶崛〉寐蕿樘}卜葉經(jīng)提取后,各部位的重量與蘿卜葉重量的比值(mg/g干重)。

1.2.2 總酚含量的測定 總酚含量測定參照文獻(xiàn)[18]方法,并做適當(dāng)修改。取1.0 mL適當(dāng)濃度的樣品溶液,加入1.0 mL福林酚試劑(稀釋10倍),4 min后加入0.8 mL飽和Na2CO3溶液(75 g/L),加蒸餾水定容至5 mL,室溫靜置1 h后,在760 nm處測定吸光度,用沒食子酸(10～50 mg/mL)作校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.00376x+0.02046,R2=0.9996),總酚含量表示為沒食子酸當(dāng)量(mg GAE/g dw)。

1.2.3 總黃酮含量的測定 總黃酮含量測定參照文獻(xiàn)[19]方法,并做適當(dāng)修改。取0.5 mL適當(dāng)濃度的樣品溶液加入2 mL蒸餾水后,加入150 μL NaNO2(5%)靜置6 min,再加入AlCl3(10%)0.15 mL靜置6 min,加入2 mL NaOH(4%),定容到5 mL,徹底混勻,靜置15 min,在510 nm測定吸光值。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品(y=0.0028x+0.0095,R2=0.9998),總黃酮含量表示為蘆丁當(dāng)量(mg RE/g dw)。

何良諸像個(gè)賭徒，“砰”地摔上車門，朝外墻水泥裸露的槍城走去。省城文化界人士，只有何良諸擁有槍城會員卡，有癮頭來這里。門房穿金絲條制服，戴金絲條硬蓋帽，向他敬禮。在偌大省城，能向何良諸敬禮的，只有這個(gè)地方。

1.2.4 總抗氧化活性(T-AOC)測定 總抗氧化活性測定參照文獻(xiàn)[20]方法,按照南京建成生物科技公司提供的T-AOC測定試劑盒說明書測定。

1.2.5 對果蠅壽命的影響

1.2.5.1 果蠅培養(yǎng)基配制 基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制[21]:A. 玉米粉82.5 g,加蒸餾水350 mL溶勻;B. 蔗糖62 g,瓊脂粉6.2 g,加蒸餾水350 mL煮沸。把溶勻后的A加入到B中,再加入酵母浸出粉7 g,煮沸即可,待稍微冷卻后加入丙酸5.0 mL。

樣品培養(yǎng)基配制:在200 g基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,分別加入不同萃取部位樣品充分調(diào)勻,使其在培養(yǎng)基中的終濃度為15 mg/kg(高劑量組)或5 mg/kg(低劑量組)。

1.2.5.2 果蠅壽命試驗(yàn) 壽命實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[22]方法,并做適當(dāng)修改。挑選10 h內(nèi)孵出的未發(fā)生交配的雄果蠅,經(jīng)乙醚麻醉,隨機(jī)分為空白對照組、樣品高劑量組、樣品低劑量組,每組果蠅60只,在溫度(25±1) ℃、濕度55%～65%、12 h光照交替的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每根試管放約2 mL的培養(yǎng)基,用雙層紗布封口,前兩周均飼喂基礎(chǔ)培養(yǎng)基,果蠅自由進(jìn)食,15 d后各樣品處理組開始飼喂樣品培養(yǎng)基,果蠅自由進(jìn)食。每天上午定時(shí)觀察并記錄死亡的果蠅數(shù)目,4 d更換一次培養(yǎng)基,觀察果蠅至完全死亡為止。實(shí)驗(yàn)過程中剔除非正常原因死亡和操作過程中不慎飛走的果蠅數(shù)量。統(tǒng)計(jì)各組果蠅的平均壽命和最高壽命。

1.2.5.3 超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量測定 挑選10 h內(nèi)孵出的未發(fā)生交配的雄果蠅,經(jīng)乙醚麻醉,隨機(jī)分為空白對照組、樣品高劑量組、樣品低劑量組,每組80只,分別在飼喂標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基或含樣品培養(yǎng)基第25 d和45 d取30只果蠅,經(jīng)乙醚麻醉處理,稱重后,用9倍的生理鹽水制備10%的組織勻漿,混勻后,6000 r/min離心10 min,吸取上清液,參照試劑盒方法進(jìn)行SOD(U/mg prot)、CAT(U/mg prot)活性和MDA含量測定。

1.2.6 對果蠅性活力的影響

1.2.6.1 果蠅處理 挑取10 h內(nèi)孵出的未發(fā)生交配的雌、雄果蠅,經(jīng)乙醚麻醉處理,按性別分為空白對照組和樣品高、低劑量組,每組的雌雄果蠅各120只,分別飼喂基礎(chǔ)培養(yǎng)基、高劑量樣品培養(yǎng)基和低劑量樣品培養(yǎng)基,果蠅自由進(jìn)食。在喂飼第15 d進(jìn)行性活力的相關(guān)指標(biāo)測定。

1.2.6.2 交配頻率的測定 每組3管,每管放入雄蠅20只,雌蠅30只,分別記錄30、50、60 min內(nèi)發(fā)生交配的果蠅對數(shù)。

1.2.6.3 交配潛伏期的測定 每組10管,每管放入雄蠅1只,雌蠅3只,記錄90 min內(nèi)有交配行為的果蠅交配的潛伏期,即雌雄成蠅從置于同一管中開始到發(fā)生交配行為的時(shí)間間隔。

1.2.6.4 交配持續(xù)期測定 每組10管,每管放入雄蠅1只,雌蠅3只,記錄90 min內(nèi)出現(xiàn)交配行為果蠅的交配持續(xù)期,即從交配開始到結(jié)束的時(shí)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 蘿卜葉提取物不同極性部位的得率、總酚和總黃酮含量

由表1可以看出,蘿卜葉提取物不同極性部位的得率差異顯著(p<0.05),其中AQRs最高,提取得率達(dá)到130.69 mg/g干基,其后依次為PERs、WBRs、EARs和CRs。蘿卜葉各極性部位的總酚和總黃酮含量的差異也較顯著(p<0.05),其中EARs總酚含量和總黃酮含量都是最高,其含量分別達(dá)到78.58 mg GAE/g和244.40 mg RE/g;其次為WBRs,總酚含量為40.13 mg GAE/g,總黃酮含量為197.73 mg RE/g;AQRs的總酚和總黃酮含量均最低。

表1 蘿卜葉提取物不同極性部位的得率及總酚、總黃酮含量Table 1 Yield,total phenols contents total flavonoids contents in different polarities of radish leaf extracts

2.2 蘿卜葉提取物不同極性部位的總抗氧化活性

從圖1可以看出,PERs、CRs、EARs、WBRs和AQRs的總抗氧化能力隨樣品濃度的增加而逐漸增加,在濃度為1000 μg/mL時(shí),T-AOC分別為1.68、4.86、21.07、8.90和1.19 U/mg。蘿卜葉各萃取部位總抗氧化能力大小順序?yàn)?EARs>WBRs>CRs>PERs>AQRs,與總酚和總黃酮含量結(jié)果一致。

圖1 蘿卜葉提取物不同極性部位的總抗氧化力Fig.1 Total antioxidant activity of different polarities of radish leaf extracts

2.3 蘿卜葉提取物不同極性部位對雄性果蠅壽命的影響

壽命是衡量衰老過程最確切的指標(biāo),因而壽命實(shí)驗(yàn)被認(rèn)為是抗衰老藥物研究中說服力最強(qiáng)的方法。壽命實(shí)驗(yàn)也稱生存實(shí)驗(yàn),即通過觀察統(tǒng)計(jì)果蠅的平均壽命、最高壽命及其生存曲線來探究衰老的規(guī)律和抗衰老效應(yīng)。

圖2A的生存曲線圖顯示了果蠅的存活率隨著日齡的增加而逐漸降低。與對照組相比,飼喂蘿卜葉提取物組果蠅的生存曲線右移,尤其在生存后期右移明顯,表明蘿卜葉提取物均能延長雄性果蠅的壽命,其中EARs和WBRs的作用效果最顯著,且存在濃度-效應(yīng)關(guān)系。從雄果蠅的存活曲線可以看出,前25 d,對照組和蘿卜葉提取物組果蠅的生存狀態(tài)大致相近,25 d之后,各組都呈現(xiàn)不同程度的死亡速度,在45～60 d,對照組果蠅就呈現(xiàn)出死亡加速的趨勢,而高劑量組在45 d后的存活曲線一直高于對照組,但低劑量組在45 d后與對照組相近,并慢慢高于對照組。在50 d之后,各蘿卜葉提取物不同極性部位處理組的存活曲線均比對照組要高,且高劑量組均高于低劑量組。在75 d左右,對照組的雄果蠅全部死亡,而蘿卜葉提取物不同極性部位處理組還繼續(xù)保持著生命活力。

各組果蠅的平均壽命見圖2B,空白對照組雄果蠅的平均壽命分別是45 d,蘿卜葉提取物不同極性各部位對果蠅的平均壽命均有不同程度的延長。其中EARs和WBRs能極顯著延長雄果蠅的平均壽命,其中低劑量組對雄果蠅的延長率分別是16.12和15.39%(p<0.01),高劑量組分別為22.98和21.03%(p<0.01)。同時(shí),與對照組相比,蘿卜葉提取物不同極性各部位的高、低劑量組均對雄果蠅的最高壽命(圖2C)均有極顯著提高(p<0.01)。對照組雄果蠅的最高壽命僅有66 d,而EARs和WBRs高劑量組的雄果蠅的最高壽命分別達(dá)到84 d和82 d,分別延長了27.27%和24.24%。

圖2 蘿卜葉提取物不同極性部位對果蠅壽命的影響Fig.2 Effect of different polarities of radish leaf extracts on life span of Drosophila melanogaster注:(A)壽命;(B)平均壽命;(C)最高壽命;*表示與對照組相比,差異顯著(p<0.05);**表示與對照組相比,差異極顯著(p<0.01)。

2.4 蘿卜葉提取物不同極性部位對果蠅SOD、CAT活力和MDA含量的影響

由圖3A、D可知,各組雄果蠅在喂飼樣品的第25 d和第45 d時(shí),SOD活力均相比對照組增加,且果蠅體內(nèi)SOD活力隨著培養(yǎng)基中萃取部位濃度的增加而增加。其中EARs和WBRs的高劑量處理組雄果蠅的SOD活力在第25 d達(dá)到71.34和69.62 U/mg prot,相比對照組分別極顯著提高了1.49和1.43倍(p<0.01)。隨著果蠅年齡的增大,果蠅體內(nèi)SOD活力下降,但在第45 d時(shí),EARs和WBRs處理組果蠅的SOD活力相比對照組,顯著增加了1.74和1.22倍(p<0.05)。

如圖3B、E所示,飼喂樣品培養(yǎng)基的果蠅CAT活性在第25 d和45 d相比對照組都有增加。EARs高劑量處理組雄果蠅第25 d的CAT活力分別為1.94 U/mg prot,相比對照組增加了0.18倍;45 d時(shí),其CAT活力分別為2.43 U/mg prot,相比對照組增加了0.62倍,差異顯著(p<0.05)。WBRs高劑量處理組雄果蠅在第25 d時(shí),CAT活力增加不顯著(p>0.05);第45 d時(shí)CAT活力分別為2.11 U/mg prot,相比對照組增加了0.41倍,差異顯著(p<0.05)。

由圖3C、F可知,雄果蠅在喂飼EARs和WBRs的第25 d、第45 d時(shí)MDA含量均比對照組減少。EARs高劑量處理組在第25 d時(shí),雄果蠅體內(nèi)MDA的含量為0.12 nmol/mg prot,相比對照組減少83%;45 d時(shí)MDA的含量為0.23 nmol/mg prot,相比對照組減少39%,差異顯著(p<0.05),WBRs高劑量處理組在第25 d時(shí),雄果蠅體內(nèi)MDA的含量為0.12 nmol/mg prot,相比對照組減少了92%(p<0.05),而在第45 d時(shí)雄果蠅體內(nèi)MDA含量為0.28 nmol/mg prot,相比對照組減少了14%,存在顯著性差異(p<0.05)。

圖3 蘿卜葉提取物不同極性部位對果蠅SOD、CAT活力和MDA含量的影響Fig.3 Effects of different polarities of radish leaf extracts on SOD,CAT activity and MDA centents of Drosophila melanogaster注:A、B、C為飼喂第25 d,D、E、F為飼喂第45 d,*表示與對照組相比,差異顯著(p<0.05);**表示與對照組相比,差異極顯著(p<0.01)。

2.5 蘿卜葉提取物不同極性部位對果蠅性活力的影響

衰老伴隨著生理功能的衰退,其中性功能可以說是生命活力的一個(gè)重要指標(biāo)。性功能的衰退和性活動的減少都是衰老的主要表現(xiàn),無論是人類或是動物,雄性或是雌性,在性激素分泌減少和心理、體力下降等因素的誘導(dǎo)下,性功能都會隨著年齡的增長而減弱,表現(xiàn)為頻率的減少或者質(zhì)量的降低。反之,性行為的質(zhì)量和頻率也會影響壽命的長短。因此,性活力可以作為評價(jià)衰老情況的一個(gè)重要指標(biāo)。

不同極性萃取部位對30日齡果蠅的交配能力的影響見表2。各萃取部位的高、低劑量組之間對果蠅的交配對數(shù)影響不太明顯,但相比對照組而言均有提高果蠅性活力的作用。其中EARs低劑量組效果最強(qiáng),在30 min時(shí)有13對果蠅交配,而對照組在30 min時(shí)交配果蠅對數(shù)為9對。在60 min時(shí),EARs低劑量處理組果蠅還有4對在交配,對照組只有2對。由表2還可以看出,各萃取部位顯著增加果蠅的持續(xù)交配時(shí)間(p<0.05),對照組果蠅交配持續(xù)時(shí)間為12.68 min,而EARs和WBRs高劑量組果蠅達(dá)到了17.72 和15.68 min,增加了3～5 min。另一方面潛伏期也明顯縮短,對照組為23.78 min,EARs和WBRs高劑量組僅有6.63、13.47 min,縮短了10～17 min,與對照相比有顯著性差異(p<0.05)。

表2 蘿卜葉提取物不同極性各部位對果蠅生殖力的影響Table 2 Effect of different polarities of radish leaf extracts on the reproductive capacity of Drosophila melanogaster

3 結(jié)論

本文以蘿卜葉為研究對象,以果蠅為模式生物,考察蘿卜葉延緩衰老的生物活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,蘿卜葉乙醇提取物不同極性部位中EARs和WBRs的總多酚和總黃酮含量最高;經(jīng)飼喂蘿卜葉提取物不同極性部位后,果蠅壽命均有不同程度的延長,但EARs和WBRs的延長效果最好(分別為22.98%和21.03%),與多酚和黃酮含量及總抗氧化能力實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相一致。此外,飼喂EARs和WBRs后,細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶(SOD和CAT)活性均顯著提高(p<0.05),而MDA含量明顯降低(p<0.05)。且與衰老相關(guān)果蠅性活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示,飼喂EARs和WBRs可以提高果蠅的性活力。因此,可推測含有較強(qiáng)抗氧化活性的成分EARs和WBRs可通過增強(qiáng)果蠅體內(nèi)的抗氧化酶活力,有效的清除機(jī)體內(nèi)多余的活性氧自由基,減少機(jī)體氧化損傷,從而發(fā)揮延緩果蠅衰老作用。由此可知,蘿卜葉提取物具有較好的延緩衰老和體內(nèi)抗氧化作用,具有良好的開發(fā)抗衰老功能食品的應(yīng)用前景。