劉 項,張成強,黃軼群,2,樊玉霞,3,賴克強,3,*

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306;2.長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院,湖南長沙,410004;3.上海海洋大學(xué)食品熱加工工程技術(shù)研究中心,上海 201306)

明膠是一種天然可溶高分子多肽聚合物,因具有入口即化、良好膠凝性、熱可逆性等獨特的物理性質(zhì)和功能特性,被廣泛應(yīng)用于糖果、奶類、肉制品、糕點等各類食品中[1-4]。目前約98.5%明膠從哺乳動物(牛和豬)的皮、骨中提取獲得,但由于宗教信仰和瘋牛病、口蹄疫等安全問題,其應(yīng)用受到極大限制[1-2]。魚膠常作為替代動物明膠的食物成分被廣泛應(yīng)用于食品加工行業(yè),而羅非魚明膠是一種理想的動物明膠替代品。首先,我國羅非魚產(chǎn)量為世界第一位,占世界羅非魚養(yǎng)殖總產(chǎn)量50%以上,2016年產(chǎn)量為186.6萬噸。其次,羅非魚皮富含膠原蛋白,作為魚肉加工過程中的主要副產(chǎn)物,丟棄會造成資源浪費和環(huán)境污染,最后,將魚皮作為原料提取制成明膠,不僅能緩解傳統(tǒng)哺乳動物明膠在宗教和疫病方面的使用局限性,還能延長水產(chǎn)品加工產(chǎn)業(yè)鏈,提高資源的利用率和企業(yè)的經(jīng)濟效益[1,4-6]。

在食品生產(chǎn)加工過程中,魚膠的物化性質(zhì)受到其它食品成分的影響,如氯化鈉的影響不可忽視[7-8]。氯化鈉是食品中最為常用的成分或添加劑,主要用于提供咸味及其它風(fēng)味特征、降低水分活度以延長食品的貨架壽命[9]。鹽的添加可能會影響明膠分子間結(jié)構(gòu)的變化,改變魚膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),進而影響魚膠的品質(zhì)和應(yīng)用[8,10]。目前氯化鈉對魚明膠性能影響的研究主要集中在其對明膠溶液流變性質(zhì)和明膠成膜性質(zhì)的影響[7-8,10]。例如Li等[8]的研究顯示,魚膠中添加1.5%(w/w)的氯化鈉,魚膠膜中無序結(jié)構(gòu)增加,導(dǎo)致其成膜性減弱。Alfaro等[7]發(fā)現(xiàn)在pH5.0時,6.67%羅非魚魚皮明膠溶液(w/v)的透明度、粘度隨著氯化鈉濃度(0、0.3、0.8 mol/L)的增加而顯著增加,而凝凍強度卻顯著下降。目前缺乏有關(guān)氯化鈉對魚膠凝膠凝膠性能(如真實應(yīng)力、楊氏模量等參數(shù))與結(jié)構(gòu)影響的系統(tǒng)研究,而凝膠性能是決定成功應(yīng)用于很多固態(tài)(如糖果)及半固態(tài)食品(如酸奶、果凍等)中的重要參數(shù)之一。

本研究以羅非魚魚皮為原料,采用課題組研發(fā)的工藝[4],制備魚皮明膠凝膠,通過單軸壓縮實驗、借助差示掃描量熱儀和紅外光譜，研究不同氯化鈉添加量對魚膠凝膠性能與結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律,實驗結(jié)果能為魚膠在食品加工中的應(yīng)用提供理論依據(jù)及指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚魚皮 海南翔泰漁業(yè)有限公司提供;羅非魚魚皮明膠(323 Bloom) 參照本實驗組Niu等[14]的方法提取;氯化鈉 分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司(上海)。

DV215CD分析天平 美國Ohaus公司;HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市金分儀器有限責(zé)任公司;IS-RDD3型臺式恒溫振蕩器 美國精騏有限公司;SH-241恒溫恒濕箱 上海恒一科學(xué)儀器有限公司;TA.XT-Plus質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro System公司;Nicolet-6700傅里葉變換紅外光譜儀 美國賽默飛世爾科技有限公司。Q2000差示掃描量熱儀 美國TA儀器沃特世科技(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 凝膠溶液的制備 配制不同濃度的氯化鈉溶液(0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%,w/v);分別稱取不同質(zhì)量的魚皮明膠粉末,加入上述鹽溶液,制成不同濃度(2%、4%、6.67%,w/v)的魚膠-鹽溶液(18種),稱重記為m,室溫下放置30 min,充分溶脹,隨后置于50 ℃水浴中溶解15 min,補水至重量為m，移入恒溫振蕩器,在50 ℃下振蕩20 min,得到不同濃度的魚膠-鹽溶液體系，立即用于隨后實驗。

1.2.2 單軸壓縮試驗 魚膠-氯化鈉溶液體系,在常溫下冷卻10 min后,倒入圓柱型POM模具(內(nèi)徑30 mm×高20 mm),封口膜封口;在恒溫恒濕箱(4 ℃,RH 75%)放置24 h;取出魚膠凝膠樣品,轉(zhuǎn)移到質(zhì)構(gòu)儀載物臺托盤上,進行單軸壓縮試驗。壓縮實驗的測定條件:探頭P/100,表面觸發(fā)力5 g,測試速度1 mm/s,壓縮樣品直至樣品斷裂或至75%的應(yīng)變[11-12]。

將由單軸圧縮實驗獲得的力-距離的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為魚膠凝膠樣品的真實應(yīng)變和真實應(yīng)力,并進一步計算出楊氏模量。其中真實應(yīng)力是魚膠凝膠網(wǎng)絡(luò)強度的指示參數(shù),楊氏模量同魚膠的凝膠網(wǎng)絡(luò)硬度息息相關(guān)。真實應(yīng)力和真實應(yīng)變轉(zhuǎn)換公式如下:

式(1)

式(2)

式中,F(t)為壓縮時樣品的瞬時負載力,A0為初樣品的初始表面積,H0為樣品的初始高度,H(t)為壓縮時樣品的高度。

楊氏模量的計算方法依據(jù)Mao等[12]的方法略有變化。在本實驗中,通過凝膠樣品應(yīng)變小于10%時,工程應(yīng)力和工程應(yīng)變曲線線性回歸時得到的斜率,即為楊氏模量。

1.2.3 差示掃描量熱譜采集 稱取15 mg左右的魚膠-氯化鈉溶液樣品(6.67%,w/v)放入密封的鋁鍋中,保持溫度為50 ℃ 10 min,然后以5 ℃/min 的速率掃描降溫至4 ℃,掃描速率為0.5 ℃/min,保持4 ℃ 30 min,而后以相同的掃描速率升溫至50 ℃。利用儀器自帶軟件對DSC曲線進行分析,掃描曲線上轉(zhuǎn)變斜線的中點所對應(yīng)的溫度為明膠凝膠的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度[13-15]

1.2.4 傅里葉變換紅外光譜采集 取1.2.1制備的凝膠溶液,倒入ATR附件裝置的ZnSe樣品池,封口膜封口,在4 ℃恒溫恒濕箱中放置1 h后,進行紅外光譜掃描,掃描范圍為4000～1000 cm-1,分辨率為4 cm-1,掃描次數(shù)為32。每個實驗重復(fù)三次,取平均值用于進一步研究,所有實驗在環(huán)境溫度為25±0.5 ℃的條件下進行,譜圖的峰扣除4 ℃去離子水背景,對波數(shù)1700～1600 cm-1范圍內(nèi)的圖譜采用Origin 8.0數(shù)據(jù)處理軟件進行基線校正、平滑、去卷積和做二階導(dǎo)數(shù)圖譜,通過高斯函數(shù)自動擬合直至殘差最小,得到子峰圖譜(各子峰峰位及峰面積),最后根據(jù)積分面積計算對應(yīng)分離峰占總酰胺帶百分比[16-18]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每次實驗設(shè)置2個平行實驗,重復(fù)3次,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,并用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0軟件進行顯著性分析(p<0.05),用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 氯化鈉濃度對魚膠凝膠強度的影響

圖1為未添加氯化鈉時，不同魚膠濃度的魚膠凝膠真實應(yīng)變-真實應(yīng)力的代表性曲線。由圖1可知,在1.2真實應(yīng)變時,2%濃度的魚膠凝膠發(fā)生斷裂現(xiàn)象,而4%和6.67%濃度的魚膠中并沒有發(fā)生這種現(xiàn)象,此時2%、4%和6.67%的魚膠凝膠真實應(yīng)力分別為25.0、44.1和70.5 kPa。隨著魚膠濃度的增大,破壞凝膠體系所需要施加的應(yīng)力就越大,魚膠凝膠強度也增大,與Czerner 等[19]的報道結(jié)果一致。這是因為在魚膠的凝膠過程中,無序無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)逐漸演變到有序螺旋結(jié)構(gòu)，主要取決于魚膠分子內(nèi)部亞基肽鏈的自身折疊,隨著魚膠濃度的增加,肽鏈分子間的螺旋交聯(lián)幾率增加,形成的膠凝網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更致密,分子間作用力更大,魚膠凝膠強度增大[20]。

圖1 不同濃度魚膠凝膠的真實應(yīng)力-真實應(yīng)變曲線Fig.1 True stress versus true strain for gelatin gels

圖2為不同氯化鈉添加量、對不同濃度魚膠凝膠真實應(yīng)變-真實應(yīng)力的代表性曲線。由圖2可知,不同氯化鈉添加量，不同濃度魚膠的真實應(yīng)力-真實應(yīng)變曲線變化趨勢相似,但在2%魚膠濃度，真實應(yīng)變1.2時發(fā)生斷裂現(xiàn)象。魚膠濃度較低時,氯化鈉的添加對魚膠凝膠真實應(yīng)力的影響不明顯,但隨添加量的增加，仍呈現(xiàn)緩慢下降趨勢,當(dāng)魚膠濃度較高時,0和0.5%濃度氯化鈉的添加對魚膠應(yīng)力無明顯影響,但隨著氯化鈉添加量的繼續(xù)增加,魚膠的凝膠強度顯著降低(p<0.05),3%時達到最小值,此時2%、4%、6.67%濃度魚膠在真實應(yīng)變?yōu)?.2時,同未添加氯化鈉時相比，魚膠凝膠真實應(yīng)力分別下降了14.4%、15.2%和19.5%。這是因為魚膠濃度越低,分子間間隙越大,越有利于分子間氫鍵的生成,此時氯化鈉的添加,對魚膠凝膠強度影響較小;魚膠濃度增大,分子間間隙減小,氯化鈉同魚膠多肽鏈接觸幾率增加,不利于魚膠分子間氫鍵的締合[21],隨著氯化鈉添加量的增大,氯化鈉中和了魚膠表面所攜帶的電荷,改變了魚膠體系的靜電作用力,抑制了魚膠分子分子間的相互作用,使得魚膠分子間的斥力減小,阻礙了魚膠膠凝網(wǎng)絡(luò)的形成,導(dǎo)致魚膠凝膠強度下降[22-23]。

圖2 氯化鈉添加量對魚膠凝膠的真實應(yīng)變-真實應(yīng)力曲線Fig.2 True stress versus true strain for gelatin gels added with different levels of sodium chloride注:圖2a、圖2b、圖2c分別表示魚膠的濃度為2%、4%、6.67%的真實應(yīng)變-真實應(yīng)力曲線。

2.2 氯化鈉濃度對魚膠楊氏模量的影響

由圖3可知,未添加氯化鈉時,2%、4%、6.67%的魚膠凝膠的楊氏模量三次重復(fù)的平均值分別為5.88、19.53、41.33kPa，隨著魚膠濃度的增加,魚膠的楊氏模量顯著增加,這是因為魚膠凝膠的硬度強弱主要是由其濃度決定的,濃度越大的魚膠更容易聚集形成更多的交聯(lián)結(jié)點,進而形成更復(fù)雜的三維網(wǎng)狀凝膠結(jié)構(gòu),導(dǎo)致魚膠凝膠硬度的增加[8,24]。當(dāng)魚膠濃度為2%時,0%、0.5%、1.0%和1.5%的氯化鈉添加量對魚膠楊氏模量無顯著性影響(p>0.05),氯化鈉濃度繼續(xù)增加至2.0%時,魚膠楊氏模量同1.5%濃度無顯著性差異，但相對于0%、0.5%和1.0%濃度時顯著降低至5.30 kPa(p<0.05),當(dāng)氯化鈉添加量增至3.0%時,魚膠楊氏模量約為5.12 kPa,為最小值。當(dāng)魚膠濃度為4%時,氯化鈉添加量小于1.5%時,魚膠的添加對楊氏模量無顯著性影響(p>0.05),當(dāng)氯化鈉添加量達到1.5%,魚膠的楊氏模量同1.0%濃度無顯著性差異，但相比于0%和0.5%濃度顯著性降低至17.32 kPa(p<0.05)。當(dāng)魚膠濃度為6.67%時,僅僅添加0.5%的氯化鈉,魚膠楊氏模量就顯著性降低至40.34 kPa(p<0.05),氯化鈉添加量達到3%,楊氏模量下降了13.87%。隨著魚膠濃度的增大,氯化鈉的添加対魚膠的楊氏模量影響越大,這是因為低濃度魚膠時,氯化鈉的添加對魚膠結(jié)構(gòu)改變不明顯,高濃度魚膠時,隨著氯化鈉添加量的增加,對魚膠蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的破壞作用更強,導(dǎo)致魚膠凝膠的硬度降低[20]。

圖3 不同氯化鈉添加量對魚膠凝膠楊氏模量的影響Fig.3 Effect of different NaCl concentrations on Young’s modulus value of fish gelatin gels注:小寫字母不同表示同一魚膠添加量差異顯著(p<0.05)。

2.3 差式掃描量熱分析

差示掃描量熱儀可以測定明膠凝膠和溶膠時的熱焓值,而熱焓值可以表征凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)交聯(lián)程度,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的交聯(lián)程度同凝膠強度正相關(guān)[13]。圖4和圖5分別為不同氯化鈉添加量的6.67%濃度魚膠凝膠和溶膠過程的差式掃描量熱譜圖。由圖可知,不同氯化鈉添加量的魚膠凝膠和溶膠過程的變化趨勢相似。在凝膠過程中,魚膠分子間由無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)向三螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變,形成結(jié)構(gòu)致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),同時伴隨著能量變化,在圖4上表現(xiàn)為放熱峰;在溶膠過程中,魚膠分子間由三螺旋結(jié)構(gòu)向無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變,魚膠膠體解旋,并伴隨著能量變化,在圖5上表現(xiàn)為吸熱峰。取DSC曲線轉(zhuǎn)換斜線中線溫度為混合體系玻璃化轉(zhuǎn)變溫度,相應(yīng)峰面積為轉(zhuǎn)變過程中熱焓變化[18,25]。魚膠-氯化鈉溶液凝膠、溶膠的玻璃化轉(zhuǎn)換溫度(Tg,Tm)和熱焓值(ΔHg,ΔHm),具體數(shù)值見表1。添加氯化鈉后,魚膠在凝膠和溶膠過程中的玻璃化轉(zhuǎn)換溫度和熱焓均降低,說明氯化鈉破壞了混合體系魚膠的有序網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),使凝膠處于不穩(wěn)定狀態(tài)。隨著氯化鈉濃度的增強,玻璃化轉(zhuǎn)化過程中的熱焓值下降,說明氯化鈉和魚膠分子間靜電作用增強,抑制魚膠凝膠網(wǎng)絡(luò)的生成,對凝膠結(jié)構(gòu)的破壞作用增強,導(dǎo)致凝膠中魚膠分子間交聯(lián)程度減弱[8,17]。

圖4 6.67%濃度魚膠凝膠過程的DSC曲線Fig.4 The DSC thermogram for fish gelatin gels of 6.67% upon cooling注:1～6分別表示混合凝膠中氯化鈉的添加量為0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%,w/v；圖5同。

圖5 6.67%濃度魚膠溶膠過程的DSC曲線Fig.5 The DSC thermogram for fish gelatin gels of 6.67% upon heating

表1 不同氯化鈉添加量的魚膠的玻璃化轉(zhuǎn)換溫度和熱焓值Table 1 Glass trasition temperature and enthalpy value of fish gelatin with different NaCl contents

2.4 傅里葉紅外光譜分析

傅里葉紅變換外光譜具有高精度、高分辨率、高靈敏度、掃描速度快、樣品用量少、對樣品無損等一系列優(yōu)勢,是化合物鑒定和結(jié)構(gòu)分析的常用手段之一,已被應(yīng)用于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),尤其是1700～1600 cm-1的酰胺Ⅰ帶可用于歸屬蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和內(nèi)部氫鍵結(jié)合的探討[16,18,26-28]。圖6為不同濃度魚膠紅外光譜的變化曲線。本次實驗魚膠凝膠結(jié)構(gòu)中的酰胺帶主要涉及3個區(qū)域,分別為1700～1600 cm-1(酰胺Ⅰ帶)、1600～1500 cm-1(酰胺Ⅱ帶)和1300～1200 cm-1(酰胺Ⅲ帶),同Muyonga等[16]的結(jié)果相似。由圖6可知,隨著魚膠濃度的增加,酰胺Ⅰ帶吸收峰強度逐漸增大,酰胺Ⅰ帶吸收峰的位置發(fā)生位移。2%、4%、6.67%魚膠的酰胺Ⅰ帶吸收峰位分別位于1647.1、1649.9、1653.0 cm-1,酰胺Ⅰ帶吸收峰向高波數(shù)方向移動,表明隨著魚膠濃度的增加,魚膠凝膠三螺旋結(jié)構(gòu)增加,魚膠膠凝強度進一步增大[29]。

圖6 不同濃度魚膠凝膠的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.6 FT-IR spectra for fish gelatin gels with different content注:1～3分別表示魚膠凝膠中魚膠濃度為2%、4%、6.67%。

圖7為不同氯化鈉添加量對6.67%魚皮明膠凝膠傅里葉變換紅外光譜變化的曲線。不同氯化鈉添加量(0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3%,w/v)的魚膠凝膠,酰胺Ⅰ帶的吸收峰位置分別為1653.0、1651.0、1650.3、1650.2、1647.3、1646.9 cm-1,伴隨氯化鈉添加量的增加,酰胺Ⅰ帶吸收峰向低波數(shù)方向移動。這表明隨著氯化鈉的添加,魚膠凝膠三螺旋結(jié)構(gòu)減少,魚膠凝膠強度降低[28]。圖8為酰胺Ⅰ帶紅外光譜二階導(dǎo)數(shù)譜圖,可以明顯看出凝膠在1631、1659、1691 cm-1譜峰帶處隨氯化鈉濃度增加而變化,通過對紅外光譜圖進行去卷積和高斯擬合后可分離出相應(yīng)的子峰,不同氯化鈉添加量酰胺Ⅰ帶子峰和面積如表2所示。1630 cm-1譜峰帶同明膠多肽鏈的解旋相關(guān),隨著氯化鈉添加量的增加,該譜峰帶強度增加,魚膠多肽鏈的解旋程度增加,魚膠分子間氫鍵的生成減少[29];1659 cm-1譜峰帶同三螺旋結(jié)構(gòu)和分子間氫鍵的生成相關(guān),隨著氯化鈉添加量的增加,該譜峰帶強度減小,三螺旋結(jié)構(gòu)和氫鍵生成減少[28-29];1691 cm-1譜峰帶對魚膠分子內(nèi)部交聯(lián)程度敏感,敏感程度可用1690/1659 cm-1的比值大小來衡量,比值越小,表明魚膠分子間交聯(lián)程度越弱[30]。由表2可知,1691/1659 cm-1的比值強度,隨著氯化鈉添加量的增加而逐漸減少,表明魚膠分子間內(nèi)部交聯(lián)程度變差,魚膠的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被削弱,魚膠的凝膠強度下降,這與前文單軸壓縮分析和差示掃描量熱分析的結(jié)果一致。

圖7 6.67%濃度魚膠凝膠的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.7 FT-IR spectra for fish gelatin gels of 6.67%注:1～6分別表示混合凝膠中氯化鈉的添加量為0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%,w/v。圖8同。

圖8 6.67%濃度魚膠凝膠的傅里葉變換紅外光譜二階導(dǎo)數(shù)圖Fig.8 FT-IR spectra of second derivative for fish gelatin gels of 6.67%注:圖a為全波段紅外光譜二階導(dǎo)數(shù)圖;圖b為酰胺I帶紅外光譜二階導(dǎo)數(shù)圖。

表2 不同氯化鈉添加量酰胺Ⅰ帶子峰和峰面積Table 2 Peak location and area percentage of fitted components of amide I band with selected sodium chloride concentration

3 結(jié)論

單軸壓縮實驗結(jié)果表明,隨著魚膠濃度的增加,魚膠的真實應(yīng)力、楊氏模量呈現(xiàn)顯著上升的趨勢;魚膠濃度較低時,隨著氯化鈉添加量的增加,魚膠凝膠的真實應(yīng)力和楊氏模量無顯著性變化(p>0.05),但魚膠濃度較高時,隨著氯化鈉添加量的增加,魚膠凝膠的凝膠強度和楊氏模量顯著降低(p<0.05),當(dāng)氯化鈉添加量達到3%時,魚膠的凝膠強度和硬度取得最小值,此時,6.67%濃度的魚膠在70%應(yīng)變時魚膠真實應(yīng)力下降了19.5%,楊氏模量下降了13.87%。差示掃描量熱結(jié)果表明,隨著氯化鈉濃度的增加,魚膠玻璃化轉(zhuǎn)換溫度和熱焓值均減少,分子內(nèi)部交聯(lián)程度變差。傅里葉紅外變換光譜結(jié)果表明隨著魚膠濃度增加,酰胺Ⅰ帶特征吸收峰向高波數(shù)區(qū)域移動,說明魚膠分子呈現(xiàn)更多明膠分子自身之間的相互作用,形成更致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu);隨著氯化鈉添加量增加,酰胺Ⅰ帶特征吸收峰向低波數(shù)區(qū)域移動,曲線擬合結(jié)果表明凝膠分子肽鏈解旋程度逐漸增加,氫鍵形成受到抑制,分子間交聯(lián)程度變差,說明氯化鈉的添加可抑制魚膠凝膠形成更有序的空間結(jié)構(gòu),進而削弱魚膠的凝膠性能。上述研究結(jié)果可為魚膠在食品加工中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。