鄭行泉 福建省福州市馬尾區(qū)畜牧站 福州 350015

銅是動物體內(nèi)不可缺少的元素，尤其在體內(nèi)酶促鏈中作用更為明顯，是許多酶類 （如賴氨酰氧化酶、超氧化物歧化酶和細(xì)胞色素C氧化酶等）的主要構(gòu)成成分，在機(jī)體造血、新陳代謝、生長繁殖、生產(chǎn)性能和增強(qiáng)機(jī)體抵抗力等方面具有不可替代的作用。但過量的銅會在體內(nèi)富集，對蛋白質(zhì)和酶會產(chǎn)生毒害作用[1]。銅已逐漸成為環(huán)境的主要污染物之一，農(nóng)業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)上銅的大量使用[2]，導(dǎo)致銅離子的污染日趨嚴(yán)重，通過調(diào)查得知魚塘中淤泥所含的重金屬含量嚴(yán)重超標(biāo)[3]，在中國也存在著農(nóng)藥濫用的現(xiàn)象，而農(nóng)藥中也含有重金屬銅[4]。

采用實(shí)驗(yàn)室含水硫酸銅，按水生動物急性毒性試驗(yàn)的要求分組設(shè)計(jì)不同濃度組，對斑馬魚進(jìn)行24 h、48 h急性毒性試驗(yàn)。對所提出的問題加以證明，以了解重金屬銅對動物和環(huán)境的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試劑 實(shí)驗(yàn)室硫酸銅CuSO4·5H2O，分子量為249.68。

1.1.2 試驗(yàn)儀器 1 000 mL大燒杯2個，500 mL中燒杯2個，同型塑料小桶容量為3 500 mL 40個，溫度計(jì)1根，電子天平1臺，注射器3個，大水箱2個。

1.1.3 試驗(yàn)動物 健康試驗(yàn)用斑馬魚，購自福州某花鳥市場。挑選長度一致的斑馬魚，雌雄不限。規(guī)格要求為健康，判斷標(biāo)準(zhǔn)為體形正常、鱗片完整，各魚鰭舒展無缺陷，行動活潑，食欲好，大小基本一致。

1.1.4 自來水的去氯處理 先用大水箱裝上自來水，然后將其置于通風(fēng)、透光的地方放置24 h以上，以除去自來水中的余氯，由于斑馬魚對氯十分敏感，因此，試驗(yàn)所用的水應(yīng)該充分曝氣后方可使用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)液的配制 利用電子天平稱量所需硫酸銅的重量，將其溶于一定體積的曝氯水體中，配得一定高濃度母液。以母液為基礎(chǔ)進(jìn)行適當(dāng)稀釋，以得到不同濃度梯度的試驗(yàn)液。

1.2.2 試驗(yàn)魚的飼養(yǎng) 從花鳥市場將試驗(yàn)魚充滿氧氣運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)總數(shù)為140尾左右，飼養(yǎng)所用的水必須是充分曝氣后的水，飼養(yǎng)期間每天投少量的餌料，飼養(yǎng)1 d后用于試驗(yàn)。死亡率在10%以下時，才可開始試驗(yàn)。

1.2.3 先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn) 查找參考文獻(xiàn)，掌握所做試驗(yàn)水生生物的24 h和48 h全數(shù)致死濃度及全數(shù)不死濃度。設(shè)計(jì)7個質(zhì)量濃度梯度以測定所查數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。每個試驗(yàn)塑料桶中加入1 L曝氯水，然后分別加入所需的硫酸銅溶液，每個試驗(yàn)容器投放斑馬魚10尾，水體溫度保持在22～25℃。之后進(jìn)行24 h急性毒性試驗(yàn)，分別記錄各組的死亡數(shù)，用同樣方法進(jìn)行48 h急性毒性試驗(yàn)。從而得出所做試驗(yàn)水生生物的全數(shù)致死濃度和全數(shù)不死濃度。

1.2.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，在所查文獻(xiàn)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，設(shè)置7個質(zhì)量濃度梯度，每組分別放入10尾斑馬魚。用預(yù)試驗(yàn)的相同方法養(yǎng)殖，記錄24 h的斑馬魚死亡率。試驗(yàn)魚的中毒死亡過程表現(xiàn)為：呼吸頻率無規(guī)則，魚頭上浮，腹部側(cè)斜并朝向水面，經(jīng)短暫掙扎后，沉入水底靜臥于試驗(yàn)容器底部直至完全死亡。按照同樣試驗(yàn)方法記錄48 h的斑馬魚死亡率。

1.2.5 LD50測定 試驗(yàn)完畢，清點(diǎn)各組死亡魚數(shù)，計(jì)算出死亡率（P）。按改進(jìn)寇氏法公式計(jì)算：LD50（mg/L）=lg-1[xm-i（∑P-0.5）]。

式中xm：最大劑量組劑量的對數(shù)值；i：相鄰兩組劑量（d）對數(shù)值之差，即 i=lgd3-lgd2=lgd2-lgd1，或相鄰兩組高劑量與低劑量之比的對數(shù)；P：各組魚的死亡率，用小數(shù)表示（如死亡率為100%應(yīng)寫成1.0）；∑P：為各組魚死亡率的總和。

lg LD50的標(biāo)準(zhǔn)誤 （Sx50）計(jì)算公式如下：Sx50=i*[（∑P- ∑P2）/（n-1）]1/2。 式中 n： 每組的魚數(shù)；Sx50：lgLD50的標(biāo)準(zhǔn)誤，x50=lg LD50。

LD50的 95%可信限=lg-1（x50±1.96 Sx50）；LD50的平均可信限=LD50±（LD50高限-LD50低限）/2。

2 結(jié) 果

2.1重金屬銅對斑馬魚的24 h急性毒性影響 斑馬魚在不同濃度硫酸銅溶液的環(huán)境下試驗(yàn)24 h的死亡率，見表1。經(jīng)計(jì)算可得：LD50=0.2 536 mg/L，Sx50=0.06 081；LD50的 95%可信限=0.1 927～0.3 336 mg/L；LD50的平均可信限=0.2 536±0.07 045 mg/L。由于通過事先查閱濃度資料和預(yù)試驗(yàn)，得到了較為準(zhǔn)確的分組結(jié)果，試驗(yàn)結(jié)果較為清楚，梯度明顯。

表1 重金屬銅對斑馬魚的24 h急性毒性

2.2 重金屬銅對斑馬魚的48 h急性毒性影響 斑馬魚在不同濃度硫酸銅溶液的環(huán)境下試驗(yàn)48 h的死亡率，見表2。經(jīng)計(jì)算可得：LD50=0.1 035 mg/L，Sx50=0.03 532；LD50的 95%可信限=0.08 824～0.1 214 mg/L；LD50的平均可信限=0.1 035±0.01 658 mg/L。最后一組試驗(yàn)數(shù)據(jù)不理想，還有1尾斑馬魚未死亡，可能造成最終結(jié)果有誤差。

3 分析與討論

1）本試驗(yàn)24 h和48 h的LD50結(jié)果比所查資料的數(shù)據(jù)略高，分析可能有以下幾種原因：（1）福州天氣早晚溫差大，斑馬魚可能有部分是因不適應(yīng)氣候而死亡的。（2）實(shí)驗(yàn)室所取的水后來經(jīng)檢測呈酸性，試驗(yàn)時的水可能未充分曝氣，而斑馬魚對氯十分敏感，可能有部分斑馬魚由于受氯刺激而死亡。

表2 重金屬銅對斑馬魚的48 h急性毒性

2）近年來，斑馬魚的胚胎毒性試驗(yàn)逐步成為生態(tài)毒理學(xué)研究的一種重要方法，也是各國標(biāo)準(zhǔn)組織認(rèn)可的測定單一化學(xué)品毒性的標(biāo)準(zhǔn)方法之一。優(yōu)勢主要表現(xiàn)為：其基因與人類基因的相似度很高，這意味著在其身上做藥物試驗(yàn)所得到的結(jié)果在多數(shù)情況下也適用于人體，因此，受到廣泛重視。其次，斑馬魚的胚胎透明，這使得研究者很容易觀察到藥物對其體內(nèi)器官的影響，比如原腸期的細(xì)胞運(yùn)動、腦區(qū)形成、心跳及血液循環(huán)等胚胎發(fā)育事件。此外，斑馬魚具有常年產(chǎn)卵、胎體透明、易于觀察、成本較低、可重復(fù)性好和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[5]。

3）重金屬離子急性中毒對大腦的影響主要在于對神經(jīng)元的損傷，引起神經(jīng)細(xì)胞皺縮，可能是重金屬離子與質(zhì)膜某些陰離子結(jié)合，使質(zhì)膜潰散、原生質(zhì)外溢；也可能是重金屬離子進(jìn)入原生質(zhì)，與蛋白質(zhì)的-SH基結(jié)合引起變性凝集，從而導(dǎo)致神經(jīng)元變癟[6]。同時重金屬銅對魚體內(nèi)的胃蛋白酶和淀粉酶也有影響，王維娜等[7]報道，低濃度銅離子對日本沼蝦體內(nèi)堿性磷酸酶、胃蛋白酶和類胰蛋白酶起誘導(dǎo)激活作用，而高濃度銅離子（8 g/L）則具有抑制作用，且隨著銅離子濃度升高，其抑制作用更加明顯，這可能是外界環(huán)境中重金屬離子濃度過高破壞了動物自身的生理調(diào)節(jié)過程。

4）由此可見，重金屬銅對于斑馬魚的毒性是很強(qiáng)的，同時重金屬在魚體內(nèi)會慢慢沉積[8]，最后進(jìn)入食物鏈，影響人類的健康。泥鰍是一種對水環(huán)境耐受能力較強(qiáng)的生物，但即使是泥鰍在幾種重金屬環(huán)境中也無法生存，可見重金屬污染的危害[9]。當(dāng)前，不僅僅在水產(chǎn)養(yǎng)殖上有使用含銅消毒劑，而且在飼料、獸藥中也廣泛使用，使重金屬銅的污染更加嚴(yán)重[10]。

4 結(jié) 論

重金屬銅對斑馬魚有很強(qiáng)的毒性，斑馬魚在0.91 mg/L濃度的水中24 h內(nèi)的死亡率達(dá)到100%，24 h半數(shù)致死濃度為0.2 536 mg/L，48 h的半數(shù)致死濃度為0.1 035 mg/L。通過試驗(yàn)，可以充分認(rèn)識到重金屬銅對動物的毒性，應(yīng)該謹(jǐn)慎使用含銅藥物或飼料。