郭小杰 ， 宿玲恰 ， 吳 敬 ， 陳 晟 *

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122）

角質(zhì)酶（EC 3.1.1.74）是一種絲氨酸酯酶，屬于α/β水解酶家族中的最小成員[1]。研究表明，角質(zhì)酶是一種多功能酶，不僅能夠水解角質(zhì)的酯鍵，也能夠水解各種小分子可溶性酯類物質(zhì)、短鏈和長(zhǎng)鏈甘油三酯、聚己內(nèi)酯和其他聚酯類物質(zhì)[2-3]，此外，角質(zhì)酶還能夠催化酯合成反應(yīng)和酯交換反應(yīng)[4-6]，因此在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、天然產(chǎn)物提取、紡織、食品、洗滌劑、生物柴油及酯合成等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是一種真核表達(dá)系統(tǒng)，已被成功應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和表達(dá)各種來源于人類、動(dòng)物、植物、真菌、細(xì)菌和病毒等的重組異源蛋白[7-8]。該表達(dá)系統(tǒng)對(duì)異源蛋白表達(dá)有許多優(yōu)勢(shì)：異源表達(dá)基因在甲醇誘導(dǎo)下整合到基因組中靠近乙醇氧化酶啟動(dòng)子的下游，因此在甲醇作為唯一碳源的情況下可以實(shí)現(xiàn)目的基因的高效表達(dá)；異源蛋白也能在廉價(jià)原料的情況下實(shí)現(xiàn)大量分泌；畢赤酵母還能對(duì)異源蛋白進(jìn)行翻譯后修飾，使其正確折疊和糖基化[9-11]。P.pastoris高密度發(fā)酵表達(dá)外源蛋白差異較大，一方面與外源基因本身的特性有關(guān)，另一方面發(fā)酵條件對(duì)其表達(dá)量也有重要影響，因此可以從培養(yǎng)基組成、溫度、pH、初始誘導(dǎo)菌濃、溶氧、誘導(dǎo)甲醇濃度等方面對(duì)發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化研究。

乙酸乙酯（EA）又稱醋酸乙酯，為無色透明液體，是一種用途廣泛的精細(xì)化工產(chǎn)品，可用作涂料、人造革、人造纖維等的溶劑；也可用作黏合劑的溶劑，用于印刷油墨的生產(chǎn)；用做醫(yī)藥和有機(jī)酸等產(chǎn)品的萃取劑；還可用作紡織工業(yè)的清洗劑，也是制藥工業(yè)和有機(jī)合成中的重要原料；同時(shí)也是香料工業(yè)中的重要香料添加劑 ，為我國(guó)GB2760—86規(guī)定為允許使用的食用香料[12-13]。乙酸乙酯通常是通過從菠蘿、香蕉等果品中提取或者化學(xué)合成方法得到。前者得到的是混合酯類物質(zhì)、濃度低、提取量少，從而使其生產(chǎn)成本比較高。而化學(xué)合成方法則是用強(qiáng)酸或者強(qiáng)堿作為催化劑在高溫高壓下反應(yīng)生成，有副產(chǎn)物形成，且需要后處理[14-15]。與化學(xué)合成相比，酶催化合成反應(yīng)具有區(qū)域選擇性和位置專一性、條件溫和、不會(huì)造成環(huán)境污染，且產(chǎn)品更易被大眾接受[16-17]。到目前為止，脂肪酶，酯酶和角質(zhì)酶已經(jīng)被廣泛用于在非水媒介中生產(chǎn)酯類物質(zhì)[18-19]。

本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的含有酸性角質(zhì)酶基因的重組畢赤酵母進(jìn)行了3 L罐發(fā)酵工藝優(yōu)化，并對(duì)其在有機(jī)溶劑中合成乙酸乙酯的工藝進(jìn)行優(yōu)化，以獲得高效合成乙酸乙酯的最優(yōu)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 含Sirococcus conigenus角質(zhì)酶基因的重組菌P.pastoris KM71/pPIC9K-ScCutA為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基（g/L）：酵母粉10，蛋白胨 20，YNB 13.4，甘油 30。

3 L 罐發(fā)酵培養(yǎng)基 （BSM）（g/L）：CaSO40.939，MgSO4·7H2O 14.9，KOH 4.13，K2SO418.2， 甘 油30，85%H3PO426.7 mL/L， 微量鹽溶液（PTM1）4.3 mL/L。

PTM1溶 液 （g/L）：CuSO4·5H2O 6，ZnCl220，Na2MoO3·2H2O 0.2，CoCl20.5，KI 0.08，MnSO4·H2O 3，H3BO30.02 ，F(xiàn)eSO4·7H2O 65 ，H2SO45.0 mL/L。

生長(zhǎng)補(bǔ)料培養(yǎng)基 （g/L）：甘油500（含5 mL/L PTM1）。

甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)基：甲醇（含12 mL/L PTM1）。

1.1.3 試劑 硫磺脫氧膽酸鈉和對(duì)硝基苯丁酸酯（4-Nitrophenyl butyrate，pNPB）購(gòu)于 Sigma 公司；酵母無氨基基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基（YNB）購(gòu)自上海生工生物工程公司；分子級(jí)酵母粉和蛋白胨購(gòu)自O(shè)xoid（英國(guó)）公司；其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)于國(guó)藥。

1.1.4 主要儀器 臺(tái)式高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州科盛有限制造公司；梅特勒DEL320pH計(jì)購(gòu)自梅特勒-托利多儀器有限公司；721E型可見分光光度計(jì)購(gòu)自上海光譜儀器有限公司；恒溫水浴搖床購(gòu)自江蘇金壇億通電子有限公司；3 L Infors全自動(dòng)發(fā)酵罐購(gòu)自伊孚森生物技術(shù)有限公司；FC-2002型甲醇濃度檢測(cè)流加儀購(gòu)自上海蘇波信息技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 P.Pastoris KM71/pPIC9K-ScCutA在3 L發(fā)酵罐的高密度發(fā)酵培養(yǎng) 從-80℃保藏的甘油管中以 0.2%的接種量將種子接種于種子培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min培養(yǎng)20～24 h。采用3個(gè)階段的培養(yǎng)過程對(duì)畢赤酵母KM71/pPIC9K-ScCutA進(jìn)行高密度發(fā)酵條件優(yōu)化。首先，將種子液以體積分?jǐn)?shù)10%的接種量接入含1 L基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基 （BSM）的3 L Infors全自動(dòng)發(fā)酵罐中。發(fā)酵開始分批生長(zhǎng)階段溫度控制在30℃，用氫氧化銨對(duì)pH值進(jìn)行調(diào)整，并保持在5.0。通過偶聯(lián)轉(zhuǎn)速與溶氧，將溶氧水平維持在30%左右。當(dāng)初始培養(yǎng)基中甘油耗盡后，開始溶氧反彈，隨著溶解氧的迅速增加，指數(shù)流加甘油來實(shí)現(xiàn)高細(xì)胞密度。在菌體量達(dá)到所需要的值時(shí)，停止流加甘油，饑餓處理1～2 h待培養(yǎng)基中甘油完全消耗掉后開始進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)。對(duì)誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)階段甲醇維持體積分?jǐn)?shù)和初始誘導(dǎo)細(xì)胞濃度的優(yōu)化是通過改變誘導(dǎo)溫度（26、28、30℃）、初始誘導(dǎo)細(xì)胞濃度 OD600（50、100、150） 和誘導(dǎo)階段甲醇體積分?jǐn)?shù)（0.25%、1%、2%）來實(shí)現(xiàn)。

1.2.2 角質(zhì)酶酶活的測(cè)定方法 將 30 μL適當(dāng)稀釋的酶液加入到 1 470 μL含50 mmol/L pNPB的1×Mcilvation緩沖液（pH 4.5）中，在340 nm處記錄對(duì)硝基酚的生成速率。酶活單位定義：在37℃，每分鐘水解對(duì)硝基苯丁酸酯生成1 μmol對(duì)硝基苯酚所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位。

1.2.3 利用凍干角質(zhì)酶制備短鏈芳香酯的反應(yīng)條件優(yōu)化

（1）重組Cutinase的純化和凍干。ScCutA用35%的硫酸銨沉淀、1×Mcilvation的緩沖液（pH 7.0）透析和DEAE-Sepharose陰離子交換柱進(jìn)行純化，酶活最高的洗脫峰所對(duì)應(yīng)的酶液用1×Mcilvation緩沖液（pH 4.5）透析、-80℃凝固，然后用真空冷凍凍干機(jī)過夜凍干。凍干的酶粉4℃保存用于酯合成反應(yīng)。

（2）有機(jī)溶劑脫水。所有用于酯合成反應(yīng)的有機(jī)試劑需要脫水預(yù)處理：將3?分子篩加入有機(jī)試劑中，室溫放置一個(gè)星期，濾去分子篩 ，得脫水有機(jī)溶劑。

（3）乙酸乙酯的酯合成方法。稱取一定量的乙酸和乙醇于20 mL帶塞燒瓶中，量取10 mL無水的有機(jī)溶劑（異辛烷、正己烷、正庚烷、丙酮、乙腈），加入50 U/mL的凍干角質(zhì)酶粉，置于恒溫水浴搖床中，在搖床轉(zhuǎn)速150 r/min下反應(yīng)一定時(shí)間，取樣待測(cè)。

（4）酸酯化率的定量分析。樣品在反應(yīng)前后分別取500 μL加入到10 mL水中，以酚酞作指示劑，用0.005 mol/L的NaOH滴定，通過測(cè)定樣品在反應(yīng)前、后酸值的降低值確定酯化反應(yīng)產(chǎn)率，酯化率計(jì)算公式：轉(zhuǎn)化率（%）=1-消耗的NaOH體積/空白樣品消耗NaOH體積。

2 結(jié)果

2.1 3 L罐中高密度發(fā)酵生產(chǎn)角質(zhì)酶

2.1.1 誘導(dǎo)溫度對(duì)重組菌生長(zhǎng)以及產(chǎn)酶的影響溫度是影響菌體生長(zhǎng)和外源蛋白表達(dá)的重要因素之一。升高溫度，有利于細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)，但溫度過高會(huì)使菌體過早衰老，而P.Pastoris的發(fā)酵周期相對(duì)較長(zhǎng)，高溫會(huì)使其發(fā)酵周期縮短，降低外源蛋白的表達(dá)量，同時(shí)也會(huì)增加宿主細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的釋放，增加目的蛋白的降解[20]。因此，利用P.Pastoris表達(dá)外源重組蛋白的整個(gè)發(fā)酵過程中，菌體生長(zhǎng)階段的培養(yǎng)溫度可以直接參照表達(dá)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)（Invitrogen公司）而定，而誘導(dǎo)產(chǎn)酶階段的溫度則需根據(jù)所表達(dá)的特定蛋白來定[21-22]。為考察溫度對(duì)ScCuA表達(dá)的影響，本研究在初始誘導(dǎo)細(xì)胞濃度OD600為50、誘導(dǎo)階段甲醇體積分?jǐn)?shù)為0.25%條件下，考察了不同誘導(dǎo)溫度26、28、30℃對(duì)菌體生長(zhǎng)和發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

由圖1（a）可知，在整個(gè)誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中，28℃條件下更有利于菌體的生長(zhǎng)，菌體生長(zhǎng)要好于其他條件，至誘導(dǎo)138 h放罐時(shí)OD600達(dá)到286。但是從圖1（b）中可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)誘導(dǎo)溫度為26℃和30℃時(shí)能夠達(dá)到的最高酶活相近，菌體在28℃誘導(dǎo)下所得酶活最高，為248.7 U/mL，為26℃和30℃誘導(dǎo)下的1.2倍。因此，發(fā)酵重組畢赤酵母生產(chǎn)角質(zhì)酶時(shí)應(yīng)采用28℃的誘導(dǎo)溫度。

2.1.2 誘導(dǎo)階段維持甲醇濃度對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響 在酵母發(fā)酵過程中，甲醇不僅是整個(gè)誘導(dǎo)發(fā)酵過程中的唯一碳源，還是外源蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)劑，它能誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量的AOX酶，從而促進(jìn)甲醇代謝為細(xì)胞生長(zhǎng)提供能量及誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。然而，并不是甲醇濃度越高越有利于外源蛋白的表達(dá)。在P.pastoris誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白的過程中，培養(yǎng)基中過高體積分?jǐn)?shù)的甲醇會(huì)對(duì)酵母細(xì)胞產(chǎn)生毒害，抑制細(xì)胞代謝甲醇的功能[23]，導(dǎo)致細(xì)胞死亡率升高，進(jìn)而降低目的蛋白的表達(dá)量[24]。因此，維持整個(gè)誘導(dǎo)發(fā)酵過程中的甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶有重要的影響。

本研究考察了當(dāng)初始誘導(dǎo)細(xì)胞濃度OD600達(dá)到50，誘導(dǎo)溫度為28℃條件下，誘導(dǎo)階段維持不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇對(duì)P.pastoris菌體生長(zhǎng)和角質(zhì)酶產(chǎn)量的影響，最終確定誘導(dǎo)劑甲醇應(yīng)該維持的最佳體積分?jǐn)?shù)。如圖2（a）所示，在整個(gè)誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中，1%甲醇體積分?jǐn)?shù)條件下更有利于菌體的生長(zhǎng)，菌體生長(zhǎng)要好于0.25%和2%，且2%體積分?jǐn)?shù)甲醇條件下，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制，說明維持較高體積分?jǐn)?shù)甲醇不利于細(xì)胞生長(zhǎng)。對(duì)比不同甲醇體積分?jǐn)?shù)下的酶活曲線，如圖3（b）所示，在誘導(dǎo)前72 h時(shí)，3個(gè)誘導(dǎo)甲醇體積分?jǐn)?shù)下角質(zhì)酶酶活相差不大。但是隨著誘導(dǎo)的進(jìn)行，維持1%甲醇體積分?jǐn)?shù)下增長(zhǎng)迅速，發(fā)酵液中角質(zhì)酶酶活最高，達(dá)到315.8 U/mL。因此，誘導(dǎo)階段維持1%的甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)角質(zhì)酶在P.pastoris中的表達(dá)最有利。

圖1 誘導(dǎo)溫度對(duì)重組畢赤酵母細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effects of inducing temperature on P.pastoris growth and production of cutinase synthase

2.1.3 初始誘導(dǎo)細(xì)胞濃度對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響 利用重組畢赤酵母在3 L發(fā)酵罐的高密度發(fā)酵是許多重組蛋白工業(yè)化生產(chǎn)的重要途徑[25]。通常情況下，提高初始誘導(dǎo)菌體濃度可以增加誘導(dǎo)階段的生物量，使更多的甲醇合成外源蛋白[26]。然而當(dāng)生物量達(dá)到較高水平時(shí)，培養(yǎng)條件（溶氧量、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等）容易受到限制，外源蛋白的產(chǎn)量和穩(wěn)定性也會(huì)受到影響，因此高表達(dá)量的獲得應(yīng)以實(shí)際取得的生物量為準(zhǔn)，高細(xì)胞濃度誘導(dǎo)下并不一定能得到高表達(dá)量[27]。為考察初始誘導(dǎo)菌體濃度對(duì)ScCuA表達(dá)的影響，本研究在初始誘導(dǎo)OD600為100、誘導(dǎo)階段甲醇體積分?jǐn)?shù)為1%條件下，考察了不同初始誘導(dǎo)菌體濃度OD600分別為 50、100、150時(shí)對(duì)菌體生長(zhǎng)和發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

圖2 維持不同甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)重組畢赤酵母細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effects of methnol concentrations on P.pastoris growth and cutinase production

由圖3可知，在誘導(dǎo)前72 h，初始誘導(dǎo)菌體濃度對(duì)重組菌生長(zhǎng)的影響較明顯，但是達(dá)到穩(wěn)定期后菌體濃度差別不大。當(dāng)初始誘導(dǎo)菌濃（OD600）由50增加到100時(shí)，最高酶活從 315.8 U/mL增加到419.2 U/mL。而當(dāng)初始誘導(dǎo)菌濃為150時(shí)，酶活反而下降到363.5 U/mL?？赡苁怯捎诰w濃度過高時(shí)，罐內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和溶氧條件都較低菌濃條件下差，嚴(yán)重影響了菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶。因此選擇OD600=100作為最適的初始誘導(dǎo)菌體濃度。

2.2 重組角質(zhì)酶酯合成條件優(yōu)化

2.2.1 不同有機(jī)溶劑對(duì)酸酯化率的影響 通常情況下，酶在有機(jī)相中的催化活性和穩(wěn)定性與有機(jī)溶劑的疏水性有關(guān)，其活性隨著溶劑親水性的增大而減弱；同時(shí)不同有機(jī)溶劑對(duì)底物的溶解度也不同，只有溶解在溶劑中的底物才能參與酯化反應(yīng)[28-29]。本實(shí)驗(yàn)考察了反應(yīng)溫度為40℃，加酶量50 U/mL，乙酸底物濃度0.1 mol/L，酸醇摩爾比為1∶1條件下，分別在異辛烷、正庚烷、正己烷、丙酮、乙腈中，對(duì)乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率的影響。由圖4可知，在各種有機(jī)溶劑中角質(zhì)酶催化合成乙酸乙酯的酯化率各不相同，使用乙腈和丙酮作溶劑時(shí)，酯化率均較低，分別只有43.16%和58.32%；用正庚烷、正己烷和異辛烷作溶劑時(shí)，乙酸的酯化率均高于75%，其中用異辛烷作溶劑時(shí)，反應(yīng)16 h時(shí)酯化率最高，達(dá)到82.52%。因此選用異辛烷作為角質(zhì)酶催化合成乙酸乙酯的溶劑。

圖3 初始誘導(dǎo)菌濃度對(duì)重組畢赤酵母細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effects of initial induction cell density on P.pastoris growth and cutinase production

2.2.2 溫度對(duì)酸酯化率的影響 溫度對(duì)生物催化反應(yīng)的活性、選擇性、穩(wěn)定性，以及熱力學(xué)平衡有重要的影響[30]。本實(shí)驗(yàn)研究了不同反應(yīng)溫度30～80℃，在異辛烷10 mL，加酶量50 U/mL，酸底物濃度0.1 mol/L，酸醇摩爾比為1∶1條件下反應(yīng)16 h，對(duì)乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率的影響。如圖5所示，最適反應(yīng)溫度為 30～55℃，且在 50℃反應(yīng)達(dá)到最大轉(zhuǎn)化率85.57%。這一結(jié)果與該酶在水相中的水解性質(zhì)不一致，一方面，可能是由于酶的結(jié)構(gòu)在凍干過程中發(fā)生改變，使酶的穩(wěn)定性增加。另一方面，固體酶比液體酶在有機(jī)溶劑中更穩(wěn)定。然而，隨著溫度的繼續(xù)升高，轉(zhuǎn)化率呈降低趨勢(shì)。這可能是由于高溫使部分酶蛋白失活，因?yàn)楦邷厥堑鞍踪|(zhì)變性和失活的重要原因之一[31]。

圖4 不同有機(jī)溶劑對(duì)乙酸酯化率的影響Fig.4 Effects of different organic solvents on the esterification rate of acetic acid

圖5 溫度對(duì)乙酸酯化率的影響Fig.5 Effects of different reaction temperature on the esterification rate of acetic acid

2.2.3 底物濃度對(duì)酸酯化率的影響 眾所周知，從熱力學(xué)角度來講，增加底物濃度有利于加快反應(yīng)速度、促進(jìn)反應(yīng)平衡向產(chǎn)物方向移動(dòng)[14，32]；同時(shí)在酯合成反應(yīng)中，也可以通過加入過量的親核試劑（醇）或者把產(chǎn)物從反應(yīng)混合物中移除來推動(dòng)反應(yīng)平衡向產(chǎn)物生成方向移動(dòng)[33-34]。然而，過量的醇又會(huì)降低反應(yīng)速度。因此，考慮到生產(chǎn)成本和催化反應(yīng)中存在的底物抑制現(xiàn)象，需要確定一個(gè)使乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值的最佳底物濃度。

（1）底物乙醇濃度對(duì)酸酯化率的影響。通過固定乙酸的濃度為0.1 mol/L，改變醇的濃度0.05～0.3 mol/L，研究醇濃度對(duì)酯合成轉(zhuǎn)化率的影響。如圖6所示，乙酸乙酯的最大轉(zhuǎn)化率在乙醇濃度為0.15 mol/L時(shí)達(dá)到最大值94.12%。然而，繼續(xù)增加乙醇濃度從0.15 mol/L到0.3 mol/L，乙酸乙酯的轉(zhuǎn)化率呈明顯的降低趨勢(shì)。一方面可能是由于過量的醇使反應(yīng)體系中的部分酶失活[30]；另一方面可能是由于高濃度的醇改變了介質(zhì)的極性，這與使用高極性試劑達(dá)到的效果是一致的[15，31]。因此乙醇的最佳濃度為0.15 mol/L。

圖6 乙醇濃度對(duì)乙酸酯化率的影響Fig.6 Effects of ethanol concentration on the esteri fication rate of acetic acid

（2）底物乙酸濃度對(duì)酸酯化率的影響。為了研究乙酸濃度對(duì)酯合成轉(zhuǎn)化率的影響，通過固定乙醇的濃度為0.15 mol/L，改變乙酸的濃度0.05～0.3 mol/L。如圖7所示，隨著乙酸濃度的增加，乙酸的酯化率呈增加趨勢(shì)，當(dāng)乙酸濃度為0.1 mol/L時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值94.12%，然而繼續(xù)增加乙酸濃度（0.1～0.3 mol/L），乙酸乙酯的轉(zhuǎn)化率呈明顯的降低趨勢(shì)。這可能是由于當(dāng)乙酸濃度過高時(shí)，會(huì)影響角質(zhì)酶的穩(wěn)定性。因此選定0.1 mol/L為反應(yīng)最佳乙酸濃度。

圖7 乙酸濃度對(duì)乙酸酯化率的影響Fig.7 Effects of acetic acid concentration on the esterification rate of acetic acid

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)角質(zhì)酶的研究越來越多。關(guān)于角質(zhì)酶在畢赤酵母中的高密度已經(jīng)有不少文獻(xiàn)報(bào)道，Seman等人[9]將來源于Glomerella cingulata的角質(zhì)酶基因在Pichia pastoris中進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵優(yōu)化，誘導(dǎo)24 h時(shí)角質(zhì)酶酶活達(dá)到434 U/mL；北京化工大學(xué)麻瑩等人[35]將Monilinia fructicola角質(zhì)酶在畢赤酵母中進(jìn)行異源表達(dá)時(shí)產(chǎn)量為 128.56 U/mL；Kwon等人[10]將角質(zhì)酶在 P.pastoris中異源表達(dá)，未經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化，不含His標(biāo)簽的角質(zhì)酶產(chǎn)量達(dá)到342 mg/L，表明以P.pastoris作為宿主菌制備角質(zhì)酶具有很大的潛力。在上述研究的基礎(chǔ)上，本研究對(duì)重組畢赤酵母KM71/pPIC9K-ScCutA基因工程菌在3 L發(fā)酵罐進(jìn)行了發(fā)酵工藝優(yōu)化，發(fā)酵138 h時(shí)上清的最大酶活可達(dá)到419 U/mL，是優(yōu)化前的2倍，并且是搖瓶的14.7倍左右。下一步研究重點(diǎn)是將該角質(zhì)酶基因進(jìn)行多種伴侶蛋白協(xié)同表達(dá)，如二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）和核糖體結(jié)合蛋白（BIP）可以幫組蛋白質(zhì)折疊，N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（Mpr1）能降低細(xì)胞氧氣消耗過程中的活性氧（ROS），以期獲得更高表達(dá)量的角質(zhì)酶酶液。

乙酸乙酯作為一種無毒無害的綠色溶劑，其市場(chǎng)需求量隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展呈快速的增長(zhǎng)趨勢(shì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2014年世界乙酸乙酯總消費(fèi)水平達(dá)到2 800 kt/a。酶法合成芳香酯因條件溫和、無污染而有希望替代化學(xué)合成法。徐巖等人[6]利用重組酶以0.5 mol/L的乙醇和0.5 mol/L的乙酸為底物時(shí)，35℃反應(yīng)72 h，轉(zhuǎn)化率可高達(dá)91.5%；de Barros等人[36]研究 F.solani pisi角質(zhì)酶在異辛烷中催化合成短鏈脂肪酸酯，其中乙酸乙酯的轉(zhuǎn)化率為78%。本研究考察了有機(jī)試劑種類、溫度、反應(yīng)時(shí)間、底物酸濃度以及底物醇濃度等對(duì)合成乙酸乙酯的影響，其最大轉(zhuǎn)化率達(dá)到94.12%。雖然異辛烷作為反應(yīng)溶劑可以得到高得率的乙酸乙酯，但是它易燃、易揮發(fā)、沸點(diǎn)高、有毒性等特點(diǎn)，限制了它的工業(yè)應(yīng)用。在后續(xù)的研究工作中，可著重嘗試用離子液體或者微乳液代替異辛烷作為反應(yīng)溶劑。

4 結(jié)語

本研究對(duì)重組畢赤酵母KM71/pPIC9K-ScCutA基因工程菌在3 L發(fā)酵罐進(jìn)行了發(fā)酵工藝優(yōu)化，發(fā)酵138 h時(shí)上清的最大酶活可達(dá)到419 U/mL，是優(yōu)化前的2倍。對(duì)該重組角質(zhì)酶在有機(jī)相合成乙酸乙酯的酯合成條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，最優(yōu)條件為底物乙酸濃度為0.1 mol/L，乙醇濃度為0.15 mol/L，溫度50℃，在異辛烷中反應(yīng)16 h，乙酸乙酯可以達(dá)到最大轉(zhuǎn)化率94.12%。