伍 悅， 張根義， 彭善麗

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

采用益生菌制劑治療多種胃腸道疾病是目前國內(nèi)外研究的一個(gè)熱點(diǎn)[1]。益生菌是活的微生物體，可作為一種食品補(bǔ)充劑提高宿主腸道微生物的平衡，抑制病原菌的生長，防止便秘，治療患者的炎性腸?。↖BD）如克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎[2-3]，并能調(diào)節(jié)免疫機(jī)能，預(yù)防抗生素的副作用，能使受損的胃腸黏膜加快愈合，并能防止梭狀芽胞桿菌所導(dǎo)致腹瀉的復(fù)發(fā)。此外，益生菌能降低血液中膽固醇水平，防治高血壓。益生菌在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮益生作用要求益生菌在被人體攝入時(shí)必須是活的且必須有足夠數(shù)量的益生菌定植于腸道中[2]，這要求細(xì)胞在制備過程中和通過消化道低pH值的胃酸、膽汁酸、消化酶后仍能保持一定的存活率，使之有足夠數(shù)量的活菌到達(dá)腸道發(fā)揮益生作用。利用微膠囊技術(shù)，將益生菌包埋在腸溶性壁材中，可有效增強(qiáng)菌體對消化道逆環(huán)境的抵抗力，并將益生菌在適當(dāng)?shù)奈恢冕尫?，發(fā)揮其益生作用[4-5]。

阿拉伯木聚糖是一種多糖，其基本結(jié)構(gòu)是以（1，4）-β-D-吡喃木糖殘基作為線形骨架，α-L-阿拉伯呋喃糖通過（C）O-2 、（C）O-3 、（C）O-2 或（C）O-3糖苷鍵作為側(cè)鏈取代物聯(lián)接在主鏈木聚糖骨架上，在部分阿拉伯糖基的O-5位上存在著以酯鍵相連接的阿魏酸[5]。在漆酶存在下，相鄰的AX的阿魏酸分子間發(fā)生共價(jià)交聯(lián)，形成二聚物或三聚物，反應(yīng)會(huì)使溶液黏度上升，最終形成凝膠[6]。這種共價(jià)鍵交聯(lián)的凝膠形成迅速，形成條件溫和，無毒、有良好的生物相容性，味道和氣味都非常平和，且對pH和電解質(zhì)濃度變化不敏感，在胃里非常穩(wěn)定。其次，阿拉伯木聚糖可被腸道內(nèi)的微生物分解，而分解產(chǎn)物阿拉伯木寡糖是一種益生元，能調(diào)節(jié)腸道微生物，并幫助活菌定植于腸道，由此可以看出阿拉伯木聚糖凝膠是一種較理想的包埋益生菌的壁材[7-9]，但與其他已廣泛研究的用于包埋益生菌的多糖類壁材相比[10-11]，目前尚沒有探討阿拉伯木聚糖包埋益生菌的一些包埋特性的研究。

海藻酸鈉由于廉價(jià)、適用、安全無毒、生物相容性高，具有形成離子型膠體的能力，膠體表面亦形成韌性強(qiáng)的透明薄膜，是目前最廣泛用于包埋益生菌的壁材[12]。研究者用海藻酸鈉進(jìn)行益生菌微膠囊化研究，發(fā)現(xiàn)用單一的海藻酸鈉作為微膠囊壁材對益生菌的保護(hù)作用不夠理想，容易突釋和早釋[2，4]。

大腸靶是用于預(yù)防和局部治療IBD或其他傳染性疾病及大腸癌治療的主要靶向[13]。本文使用滴制技術(shù)，將阿拉伯木聚糖和海藻酸鈉復(fù)合凝膠包埋益生菌[14]。探討了復(fù)合包埋的植物乳桿菌對人工胃液，高膽鹽溶液中的耐受性，體外模擬胃腸的緩釋性和復(fù)合微膠囊常溫貯存的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

阿拉伯木聚糖的提取參考[5]，A/X為0.56，阿魏酸：1.78 mg/gAX， 分子量：2.5×105Da。 漆酶購于sigma，植物乳桿菌（ccfm 237）來自本實(shí)驗(yàn)室的保藏，其他試劑都為分析純，均購于國藥集團(tuán)。

傅里葉紅外光譜儀，IS10型；立式壓力蒸汽滅菌鍋，G154DWS；生物安全柜，CLASS Ⅱ TYPE B2；生化培養(yǎng)箱，YCP系列三氣培養(yǎng)箱；恒溫振蕩器，LKTC-B1-T；均質(zhì)機(jī)，ULTRA-TURRAX T18，德國；冷凍干燥器，SCIENTZ-10N；冷凍離心機(jī)，Centrifuge 5804R；物性分析儀，TA.XTPlus。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)和濃縮菌懸液的制備 所有的玻璃器皿和溶液都置于121℃下滅菌20 min。將冷凍保藏的菌種接入MRS液體培養(yǎng)基中，于35℃厭氧培養(yǎng)24 h，傳代3次使之徹底活化。按10%的接種量轉(zhuǎn)接到500 mL的MRS液體培養(yǎng)基中在厭氧條件下進(jìn)行增殖培養(yǎng)，18 h后，將處于對數(shù)期末期的菌懸液在 4℃，4 000 r/min的條件下離心 10 min，去上清，菌泥用無菌的 NaCl溶液（8.5 g/L）洗滌兩次后，重懸于10 mL的生理鹽水中得到濃縮菌液，此時(shí)濃縮菌液的菌密度大概在1×1011cfu/mL。調(diào)節(jié)合適的菌密度，最后利用平板計(jì)數(shù)法對濃縮菌液進(jìn)行精確計(jì)數(shù)[12]。

1.2.2 流變學(xué)測定 將漆酶添加到含有或不含有植物乳桿菌（1×107cfu/mL）的 2%（W/V）阿拉伯木聚糖溶液中后，將此混合液置于25℃測試臺上，選用磨具（直徑 4 cm，圓錐角 0.04 rad），在 5%應(yīng)力和1 Hz下進(jìn)行時(shí)間掃描，然后在5%的應(yīng)力下進(jìn)行頻率掃描（0.01～10 Hz）[7]。

1.2.3 植物乳桿菌的包埋 將質(zhì)量濃度為18 g/L的海藻酸鈉的量[12]混合到不同質(zhì)量濃度的阿拉伯木聚糖溶液中（配比如表1所示），置于121℃下滅菌20 min，冷卻至室溫后，放于4℃下備用。然后將菌懸液和混合溶液按比例（1∶10）混合均勻，加入漆酶（1.67 nkat/mgAX），于4℃混勻10 min后，混合溶液用注射器擠入0.1 M的氯化鈣溶液中，靜止30 min后，過濾，用無菌水清洗2次，再放置30 min。對于凍干微膠囊，將新鮮制備的微膠囊和15%的甘油凍干保護(hù)劑混勻后，先置于液氮速凍，后于冷凍干燥機(jī)中凍干，備用。

1.2.4 包埋和凍干計(jì)數(shù) 稱取1 g微膠囊，加到10 mL磷酸鹽緩沖溶液中（pH 6.8），用 ULTRA-TURRAX T18均質(zhì)機(jī)分散30～60 s，緩慢搖晃此均質(zhì)液15 min后，取適量勻漿液，稀釋一定倍數(shù)，涂布于MRS瓊脂培養(yǎng)基上，35℃厭氧培養(yǎng)48±2 h后計(jì)數(shù)平板上的所有菌落數(shù)。

1.2.5 微膠囊的質(zhì)構(gòu) 稱取10 g新鮮制備的微膠囊置于測試臺上，選用P35探頭（直徑35 mm），微膠囊形變40%，測試速度0.5 m/s。

1.2.6 電鏡觀形貌 將凍干的微膠囊置于玻璃皿內(nèi)，用1.0%的四氧化鋨氣體固定，用雙面膠將其粘在樣品臺上，離子濺射后用掃描電鏡觀察微膠囊表面結(jié)構(gòu)。

1.2.7 益生菌在模擬胃液和高膽鹽溶液中的存活實(shí)驗(yàn) 稱1 g凍干微膠囊并置于無菌離心管中，分別在0、60和120 min時(shí)加入pH 2的人工胃液。并立即將之置于37℃水浴搖床中，100 r/min，于120 min時(shí)將上述離心管同時(shí)取出，于4℃，4 000 r/min的條件下離心收集微膠囊，并按照1.2.4節(jié)的方法進(jìn)行計(jì)數(shù)。

稱1 g凍干微膠囊并置于無菌離心管中，分別在 0、2和4 h時(shí)加入質(zhì)量濃度為20 g/L的膽鹽溶液 （pH 6.5）。并立即將之置于 37℃水浴搖床中，100 r/min，于4 h時(shí)將上述離心管同時(shí)取出，于4℃，4 000 r/min的條件下離心收集微膠囊，并按照1.2.4節(jié)的方法進(jìn)行計(jì)數(shù)?；罹鷶?shù)下降的對數(shù)值=log（初始活菌數(shù)）—log（胃液、高膽鹽或儲藏后的活菌數(shù)）。

1.2.8 益生菌在連續(xù)模擬胃腸液的釋放 稱1 g凍干微膠囊加入9 mL在37℃下預(yù)熱的人工胃液。溫育1 h后，快速轉(zhuǎn)移到37℃下預(yù)熱的人工腸液，然后在 37 ℃，100 r/min 下溫育 4 h。于 0、0.5、1、2、3、4和5 h時(shí)取0.1 mL釋放介質(zhì)，按1.2.4節(jié)的方法進(jìn)行計(jì)數(shù)。待釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，收集微膠囊并按照1.2.4節(jié)的方法測定未釋放的活菌數(shù)。另外，通過血球計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù)釋放的細(xì)胞總數(shù)。

1.2.9 耐儲藏測試 將冷凍干燥后的樣品放入若干個(gè)無菌玻璃瓶中，密封，遮光，于室溫下儲存。一定時(shí)間后稱1 g微膠囊按照1.2.4節(jié)的方法進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 所有試驗(yàn)重復(fù)3次，采用Oringin8.1作圖，SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），以 p＜0.05 為顯著性差異。 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）形式表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 流變性能

圖1（a）為AX凝膠和包埋益生菌的AX凝膠的貯存模量G′和損耗模量G″隨時(shí)間的變化曲線。自計(jì)時(shí)開始，兩者的貯存模量G′隨時(shí)間都逐漸增大，至20 min后逐漸趨于不變，凝膠形成速度較快。兩者的貯存模量G′最大值分別達(dá)到336和302 Pa，tanδ分別為0.004和0.005均非常小而且接近0，兩者在力學(xué)性質(zhì)上都主要表現(xiàn)為彈性。包埋益生菌的AX凝膠貯存模量G′較沒包埋的小34 Pa，可能是因益生菌影響阿拉伯木聚糖大分子鏈的物理交聯(lián)，總體而言，益生菌并不影響AX凝膠的形成。

圖1（b）為AX凝膠和包埋益生菌的AX凝膠交聯(lián)1 h后貯存模量G′和損耗模量G″隨頻率的變化曲線圖。如圖所示，包埋和未包埋益生菌的WUAX凝膠的貯存模量G′和損耗模量G″隨頻率的增大有輕微的上升，損耗模量G″亦皆遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于貯存模量G′，說明凝膠的化學(xué)交聯(lián)鍵不會(huì)因?yàn)轭l率的增大而受到破壞，顯示出彈性體行為，包埋益生菌和未包埋的AX凝膠一樣具有較完整的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

2.2 凍干活菌數(shù)

初始活菌數(shù)皆為109cfu/mL。如表1所示，質(zhì)量濃度為20 g/L的阿拉伯木聚糖與海藻酸鈉（A20S18）比海藻酸鈉（A0S18）的包埋活菌數(shù)從（4.27±1.1）×108cfu/g 提高到 （6.22±1.3）×109cfu/g， 活菌數(shù)提高了14.6倍，顯著提高了包埋效率。增加阿拉伯木聚糖的質(zhì)量濃度到40和60 g/L，并不能增加包埋效率。當(dāng)阿拉伯木聚糖質(zhì)量濃度達(dá)到80 g/L時(shí)，其包埋活菌數(shù)反而最低，可能是因?yàn)轲ざ忍笤斐傻?。?5%的甘油保護(hù)下，未包埋的植物乳桿菌（109cfu/mL）凍干活菌數(shù)下降1.54個(gè)對數(shù)值（表中未顯示）。海藻酸鈉包埋 （A0S18） 的凍干活菌數(shù)為 （2.84±1.5）×107cfu/g，下降1.18個(gè)對數(shù)值。阿拉伯木聚糖質(zhì)量濃度為 40 g/L 時(shí)，其凍干活菌數(shù)為（5.76±1.3）×108cfu/g，下降1個(gè)對數(shù)值。表明微膠囊化顯著提高了植物乳桿菌的凍干存活率。

圖1 AX凝膠（質(zhì)量濃度為20 g/L）形成過程黏彈性動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Gelation of AX solution(mass concentration 20 g/L)

表1 微膠囊的凍干活菌數(shù)及包埋效率Table 1 Viability of microcapsule and lyophilization

2.3 微膠囊的質(zhì)構(gòu)

如圖2所示，隨著AX含量的增加，復(fù)合凝膠粒子的硬度增加。SA凝膠粒子的硬度為249.248 2 g，當(dāng)AX質(zhì)量濃度為60 g/L時(shí)，復(fù)合凝膠粒子的硬度是SA凝膠粒子硬度的8.76倍，顯著增加了凝膠粒子的硬度。AX質(zhì)量濃度繼續(xù)增大對復(fù)合凝膠粒子的硬度影響不大。原因可能是AX凝膠網(wǎng)絡(luò)貫穿在離子交聯(lián)的海藻酸鈉凝膠中，填補(bǔ)SA的網(wǎng)絡(luò)間隙，與SA凝膠網(wǎng)絡(luò)相互纏結(jié)，二者協(xié)同作用，抵抗外力作用增強(qiáng)，使其硬度增加。

圖2 微膠囊的硬度Fig.2 Hardness of the microcapsules

2.4 微膠囊的形貌

如圖3所示，微膠囊的粒徑在1.5～2.0 mm之間。相比SA，AX與SA復(fù)合包埋的微膠囊粒徑略大，其原因應(yīng)該是AX的加入使溶液黏度增加，導(dǎo)致粒徑的增加。SA和AX與SA復(fù)合包埋的微膠囊表面都有一層致密的膜包裹，呈不規(guī)則球形。SA微膠囊表面較粗糙，AX與SA復(fù)合微膠囊表面有褶皺狀的網(wǎng)絡(luò)，明顯更加緊實(shí)，細(xì)微處也更加緊滑。

圖 3 冷凍干燥后質(zhì)量濃度 40 g/L的 AX-SA（A，B）和 SA包埋益生的微膠囊（C，D）的表面形貌Fig.3 SEM images showing the alginate microcapsule（A，B） and the incorporated microcapsule（C，D）

2.5 植物乳桿菌在模擬胃液中的存活率結(jié)果

不同的壁材對包埋其中的植物乳桿菌在模擬胃液中的存活率產(chǎn)生不同的影響。由表2可知，植物乳桿菌對低pH環(huán)境極敏感，當(dāng)初始活菌數(shù)為（3.52±2.3）×108cfu/mL 在模擬胃液中處理 120 min內(nèi)幾乎難以檢測到存活的細(xì)胞。經(jīng)過SA和AX與SA復(fù)合包埋后，存活率都大幅度提升。單用SA包埋的植物乳桿菌在SGJ處理2 h后，其存活量保持在104cfu/g，活菌數(shù)下降3.4個(gè)對數(shù)值。而AX與SA復(fù)合包埋后 A20S18、A40S18和 A60S18在 SGJ中處理 2 h，活菌數(shù)分別下降2.39，2.03和1.94個(gè)對數(shù)值。AX質(zhì)量濃度的加大，活菌數(shù)增加。相較單用SA包埋，AX與SA復(fù)合包埋（A60S18）活菌數(shù)提高了1.46個(gè)對數(shù)值，顯著提高了植物乳桿菌在SGJ中的存活率。一方面是因?yàn)榘⒗揪厶悄z與海藻酸鈉凝膠互相填補(bǔ)其網(wǎng)絡(luò)間隙，改善膠體表面和內(nèi)部的孔徑和凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，減緩有害物質(zhì)的滲透，另外相較單用SA包埋，復(fù)合包埋的初始活菌數(shù)多。相對于未包埋的植物乳桿菌，A60S18的活菌數(shù)提高了6.61個(gè)對數(shù)值。故AX和SA復(fù)合包埋植物乳桿菌，能顯著提高了植物乳桿菌在低pH人工胃液中的存活率。

表2 未包埋和包埋的植物乳桿菌在模擬胃液中存活菌數(shù)Table 2 Survival of free and microencapsulated L.plantarum in simulated gastric juice cfu/mL

2.6 植物乳桿菌在高膽鹽溶液中的存活率結(jié)果

膽鹽是一種陰離子型表面活性劑，能夠破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生氧化損傷，從而使得益生菌細(xì)胞致死。如表3所示，不同的壁材對包埋其中的植物乳桿菌在高質(zhì)量濃度膽鹽中的存活率產(chǎn)生不同的影響。在質(zhì)量濃度為20 g/L的膽鹽中處理4 h，未包埋的植物乳桿菌存活數(shù)下降了2.6個(gè)對數(shù)值，單用SA包埋，活菌數(shù)下降2.2個(gè)對數(shù)值，而AX與SA復(fù)合包埋后 A20S18、A40S18和 A60S18的活菌數(shù)分別下降1.5，1.2和1.12個(gè)對數(shù)值。相較單用SA包埋，膽鹽處理4 h后，AX與SA復(fù)合包埋（A60S18）活菌數(shù)提高了1.08個(gè)對數(shù)值，而相對于未包埋的植物乳桿菌，A60S18的活菌數(shù)提高了1.48個(gè)對數(shù)值。因此，復(fù)合包埋顯著提高了植物乳桿菌經(jīng)過膽鹽處理后的存活率。

表3 未包埋和包埋后的植物乳桿菌在質(zhì)量濃度為20 g/mL的高濃度膽鹽中的活菌數(shù)Table 3 Survival of free and microencapsulated L.plantarum after incubation in 2%bile cfu/mL

2.7 包埋植物乳桿菌的釋放

益生菌比較大，包埋后一般來說不會(huì)通過擴(kuò)散釋放，只有壁材溶解或崩解后導(dǎo)致釋放。包埋的植物乳桿菌在人工胃液中1 h后轉(zhuǎn)運(yùn)到人工腸液中4 h。由于活菌在人工胃液里易失活，故用在血球計(jì)數(shù)板直接對人工胃液中釋放的細(xì)胞計(jì)數(shù)作為參照。如圖4（a）、（b）所示，單用 SA 包埋的微膠囊和復(fù)合微膠囊在人工胃液中的釋放沒有顯著性差異，轉(zhuǎn)運(yùn)到pH 6.8的小腸液中，單用SA包埋的植物乳桿菌，活菌被快速釋放，且釋放量隨著時(shí)間而增加，3 h后幾乎完全釋放。而質(zhì)量濃度40 g/L的AX與SA復(fù)合包埋后，人工小腸液中釋放活菌數(shù)在前1 h內(nèi)達(dá)到較大值，其釋放量隨著時(shí)間增加變化不大，顯著低于SA微膠囊在人工小腸液中的釋放。釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，測得復(fù)合包埋膠囊內(nèi)大量活菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明AX的加入，顯著提高復(fù)合包埋體系對中性pH的穩(wěn)定性，有效延緩植物乳桿菌乳桿菌在小腸液中的釋放。

圖4 SA和AX與SA復(fù)合包埋的植物乳桿菌在人工胃液和人工腸液中的釋放Fig.4 Released cell counts following incubation in gastric and intestinal medium

2.8 微膠囊的存儲穩(wěn)定性

如表4所示，隨著儲藏時(shí)間的延長所有樣品的活菌數(shù)逐漸下降。對于SA包埋的植物乳桿菌，室溫下存儲2個(gè)月后，存活數(shù)下降了1.5個(gè)對數(shù)值。而對于質(zhì)量濃度為20、40和60 g/L AX與18 g/L SA復(fù)合包埋植物乳桿菌室溫下存儲2個(gè)月后活菌數(shù)分別下降了0.9、0.85和0.99個(gè)對數(shù)值。不同濃度的AX對細(xì)胞存儲活菌數(shù)的影響沒有顯著性差異。結(jié)果表明復(fù)合包埋顯著增加了植物乳桿菌的存儲穩(wěn)定性。

表4 包埋的植物乳桿菌在25℃條件下的儲藏活菌數(shù)Table 4 Stability of microencapsulated Probiotics during two months of storage at 25℃ cfu/g

3 結(jié)語

本文采用阿拉伯木聚糖和海藻酸鈉復(fù)合包埋益生菌，其包埋活菌數(shù)顯著高于單用海藻酸鈉的包埋。復(fù)合包埋的植物乳桿菌通過人工胃液，高質(zhì)量濃度膽鹽溶液及儲存活菌數(shù)也顯著提升。阿拉伯木聚糖及其凝膠在結(jié)腸微生物作用下分解[8]，對pH和電解質(zhì)質(zhì)量濃度變化的穩(wěn)定，其和海藻酸鈉復(fù)合包埋益生菌，可延緩益生菌在小腸內(nèi)的釋放，保護(hù)益生菌順利通過胃液的低pH和小腸液中膽鹽的迫害，到達(dá)大腸。綜上證明阿拉伯木聚糖作為包埋益生菌的一種新的多糖材料，對增加活菌率是行之有效的，其更多的影響機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。