張瑞芹，劉 娜，馮繼紅，徐光華，陳延平

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院感染病科實(shí)驗(yàn)室,陜西延安 716000)

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是最嚴(yán)重的感染性疾病之一，也是肝硬化和肝癌死亡的主要危險(xiǎn)因素之一[1-3]。HBV根據(jù)全基因序列核苷酸差異≥8%以及S區(qū)基因核苷酸差異≥4%將HBV分為A～H 8個(gè)基因型。HBV基因型呈地域分布特征,并且不同的基因型病毒的復(fù)制能力不同[4-5]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)其基因分型與乙型肝炎流行病學(xué)特點(diǎn)、乙型肝炎標(biāo)志物的表達(dá)、乙型肝炎的致病性、肝臟疾病的進(jìn)展、肝硬化與肝癌的風(fēng)險(xiǎn)、治療藥物敏感性、治療療效等有密切的關(guān)系[6-9]。

建立一種簡便、有效的基因型檢測(cè)方法有重要的臨床意義和參考價(jià)值。其中核酸提取是HBV DNA檢測(cè)過程中的重要環(huán)節(jié)，不同的提取方法可直接影響試驗(yàn)結(jié)果[10]。模板的提取效率直接影響下一步基因分型檢測(cè)的敏感度，模板的純度和質(zhì)量與檢測(cè)效果密切相關(guān)?，F(xiàn)在普遍采用的沉淀離心提取法不但提取效率較低(模板的相對(duì)丟失率達(dá)70%)，而且操作繁瑣難以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，成為制約HBV基因分型檢測(cè)的瓶頸。除此之外，沉淀離心提取法需要標(biāo)本的HBV DNA定量水平在2 000 IU/mL以上才能檢測(cè)到基因分型，給臨床帶來很多不便。有研究表明，磁珠法的提取效率明顯提高(模板的相對(duì)丟失量低于50%)，而且為自動(dòng)化操作，在低拷貝病毒載量時(shí)提取效果好。本院2016年自主研發(fā)，利用Abbot m2000全自動(dòng)核酸提取儀(m2000sp，磁珠法)對(duì)提取的HBV DNA進(jìn)行HBV基因型別檢測(cè)，提高了基因型別的檢出率，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取來本院感染病科就診的1 943例慢性乙型肝炎患者，其中2013年10月至2016年7月1 411例(煮沸法)，2017年1月至2018年1月532例(磁珠法)。

1.2儀器與試劑 2013年10月至2016年7月HBV DNA提取(煮沸法)和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)熒光探針法檢測(cè)基因分型均采用泰普生物科技(中國)有限公司的HBV基因分型檢測(cè)試劑盒?；蚍中蜋z測(cè)儀器采用美國ABI公司的7500 PCR儀。2017年1月至2018年1月HBV DNA提取(磁珠法)采用Abbotl m2000SP核酸提取試劑，儀器采用Abbot m2000全自動(dòng)核酸提取儀?；蚍中蜋z測(cè)儀器采用美國ABI公司的7500 PCR儀。

1.3方法 血樣采集：采集5 mL的血液(用紫色的乙二胺四乙酸二鉀采血管)。轉(zhuǎn)速3 600 r/min，離心時(shí)間≥5 min分離血清與血細(xì)胞。放于-4 ℃冰箱中待檢。2013年10月至2016年7月采用煮沸裂解法(煮沸法)提取HBV DNA，進(jìn)一步采用PCR熒光探針法檢測(cè)基因分型。2016年8月至2018年1月,血樣采集成功后，利用m2000SP提取HBV DNA(磁珠法)，進(jìn)一步采用PCR熒光探針法檢測(cè)基因分型。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以率表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1兩種檢測(cè)方法結(jié)果差異 沸煮法的HBV基因型檢出率為81.6%;基因B、C、D型檢出率分別為2.1%、77.7%、1.8%；基因B、C、D型分別占全部HBV感染者的2.5%、95.2%、2.3%。磁珠法HBV基因型檢出率為84.4%;B、C、D型檢出率分別為4.3%、75.8%、4.3%；基因B、C、D型分別占全部HBV感染者的89.9%、5.1%、5.1%。磁珠法檢測(cè)基因型的檢出率更高(P<0.05)，其中C型檢出率降低(P<0.05)，B、D型檢出率更高(P<0.05)。見表1。

表1 兩種檢測(cè)方法檢測(cè)HBV基因型結(jié)果比較[n(%)]

2.2基因型檢出率與HBV DNA 定量的關(guān)系 選取2017年8月至2018年1月280份標(biāo)本采用磁珠法同時(shí)檢測(cè)HBV DNA和乙型肝炎基因分型。由表2可以看出HBV基因型檢出率隨著HBV DNA水平的升高而升高(P<0.05)。HBV DNA水平在>100～500 IU/mL，HBV基因型檢出率為50.0%；HBV DNA水平在>500～1 000 IU/ mL，HBV基因型檢出率為86.7%；HBV DNA水平在1 000 IU/mL以上，HBV基因型檢出率為96.4%。HBV DNA水平在100～1 000 IU/mL,檢出率為60.3%。以往的臨床工作中標(biāo)本的HBV DNA定量水平在2 000 IU/mL才能檢測(cè)到基因分型，磁珠法提高了基因分型的檢出率。

表2 基因型檢出率與HBV DNA定量的關(guān)系[n(%)]

3 討 論

HBV基因型分布存在一定的地域性差異。國外學(xué)者研究表明，隨著緯度的增加，呈現(xiàn)B型分布逐漸減少，而C型分布逐漸增加的趨勢(shì)。在我國以長江為界，長江以南地區(qū)HBV基因型以B型為主，長江以北地區(qū)以C型為主。陜北地區(qū)地處我國北方，按照以上規(guī)律以C型分布為主。

臨床研究表明HBV基因C型感染的患者其肝臟疾病進(jìn)展較快,且患肝硬化和肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)增加。C型復(fù)制較活躍，不易發(fā)生e抗原血清轉(zhuǎn)換。耐藥性方面，B/C型極易產(chǎn)生拉夫米定耐藥突變，D型感染者更易發(fā)生阿德福韋酯耐藥。不同基因型的乙型肝炎感染者對(duì)藥物敏感性也不一致，拉夫米定抗病毒治療時(shí)B型較C型有更好的應(yīng)答，干擾素治療時(shí)C型比B型有更好的應(yīng)答率。國內(nèi)研究報(bào)道顯示B、C、D 3種基因型的慢性乙型肝炎患者臨床表現(xiàn)差異明顯。慢性乙型肝炎患者中B型比例明顯高于其他兩種型別[11]。目前大多數(shù)的臨床醫(yī)師已經(jīng)將HBV基因型的檢測(cè)納入乙型肝炎患者肝細(xì)胞性肝癌發(fā)生和治療預(yù)后的觀測(cè)指標(biāo),以幫助其在工作中選擇最佳的治療方案,指導(dǎo)預(yù)防肝癌。HBV基因型的檢測(cè)顯得尤為重要。

HBV基因型檢測(cè)的方法采用基因型特異性引物PCR法。根據(jù)不同HBV基因型存在的差異序列設(shè)計(jì)一系列特異性引物。PCR擴(kuò)增后可得到不同長度的片段，以此進(jìn)行分型。在此過程中，HBV DNA的提取是關(guān)鍵步驟。如何成功提取HBV DNA成為檢測(cè)基因分型中起決定性作用的一步。磁珠是一種殼/核結(jié)構(gòu)的微球，核由鐵、鈷、鎳的氧化物組成，殼由高分子材料組成，并根據(jù)需要在磁性納米殼外包被不同的高分子材料。用于血中HBV DNA檢測(cè)的磁珠在化學(xué)合成中利用專利技術(shù)進(jìn)行了特殊的表面修飾，使其具有對(duì)DNA的高特異性吸附能力。此外磁珠吸附免去了傳統(tǒng)濃縮提取中核酸沉淀步驟，減少了DNA的丟失。

本文就磁珠法提取的HBV DNA結(jié)合PCR熒光探針法檢測(cè)HBV基因分型與傳統(tǒng)煮沸法提取的HBV DNA 進(jìn)行比較，包括基因型檢出率、各型的比例，以及與HBV DNA水平的關(guān)系等。從以上數(shù)據(jù)可以看出，磁珠法提取的HBV DNA表現(xiàn)出良好的檢測(cè)性能，更符合臨床的要求。