王蘭芳，賈忠，2*，劉鴻雁，劉麗娜，董云霞

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.蘭州市第二人民醫(yī)院,甘肅 蘭州 730046；3.蘭州市肺科醫(yī)院,甘肅 蘭州 730046)

芝芪康艾顆粒組方為蘭州市肺科醫(yī)院感染科的有效經(jīng)驗(yàn)方，由黃芪、黨參、靈芝、魚腥草、柴胡、甘草等八味中藥組成，方中重用黃芪，黃芪補(bǔ)氣升陽、益衛(wèi)固表；黨參可助黃芪補(bǔ)脾益氣之力。配以柴胡共奏補(bǔ)中益氣，升陽舉陷之功,靈芝補(bǔ)氣安神、止咳平喘，與黃芪、黨參配伍，能補(bǔ)益肺腎之氣，宜于肺虛咳喘。黃芪、黨參、靈芝具有增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬的能力，對(duì)機(jī)體各系統(tǒng)均具有正向調(diào)節(jié)和保護(hù)修復(fù)作用[1-3]；黃芪有抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、降血糖等生物功效，具有免疫調(diào)節(jié)作用[4];靈芝中的三萜類活性物質(zhì)具有降糖、抗氧化、抗炎、保肝護(hù)肝、抗腫瘤、抗HIV-1等多種作用[5-6]。而魚腥草、黃芩、柴胡、甘草等具有一定抗病毒和抗菌作用，可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)HIV的免疫能力[7-10]。為保證臨床療效和合理安全用藥，故對(duì)處方中黃芪、黃芩、靈芝進(jìn)行定性研究，采用高效液相色譜法(HPLC)建立處方黃芩苷含量測(cè)定方法，完善芝芪康艾顆粒質(zhì)量控制方法，并進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)研究以期為該制劑質(zhì)量控制以及臨床安全用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器與試藥

Waters 2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)；FA2004B電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)； KH-500DE數(shù)控超聲波清洗器(功率250 W，頻率50 kHz 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)； ZK-30AS真空電熱恒溫干燥箱(北京科偉永興儀器有限公司)；ZF-1三用紫外分析儀(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)。

色譜純乙腈(山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司)，磷酸(含量≥85%，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)，純化水，其它試劑均為分析純。黃芩苷對(duì)照品(110715-201318)、黃芪對(duì)照藥材(120974-201311)、黃芩對(duì)照藥材(120955-201309)、靈芝對(duì)照藥材(120968-201408)均購自中國食品藥品鑒定研究院；硅膠G薄層板(青島海洋化工有限公司)；芝芪康艾顆粒(批號(hào)：20160325、20160411、20160425)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)條件

清潔級(jí)昆明(KM)小鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2)g，購自蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(生產(chǎn)許可證號(hào)： SCXK(甘)2013-0002)。

試驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，飼養(yǎng)溫度：(20±2)℃，相對(duì)濕度：40%±10%，明暗12 h循環(huán)，分籠飼養(yǎng)，自由采食與飲水。食用飼料：普通柱狀飼料。

2 方法與結(jié)果

2.1 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

2.1.1 芝芪康艾顆粒的制備

該制劑由蘭州市肺科醫(yī)院制劑室提供(成人一天的服用劑量為生藥117 g/60 kg)。

2.1.2 外觀與裝量差異

本品為棕色顆粒；氣芳香，味微苦而甜。按藥典方法[11]操作均符合規(guī)定。

2.1.3 薄層鑒別

2.1.3.1 黃芪藥味鑒別

取黃芪粉末1 g，按《中國藥典》方法[12]制備供試品和對(duì)照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各5 μL，照薄層色譜法[11]試驗(yàn)，展開，檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性無干擾，見圖1。

注：1.供試品(批號(hào)：20160325);2.供試品(批號(hào)：20160411);3.陰性供試品(批號(hào)：20160325);4.陰性供試品(批號(hào)：20160411);5.黃芪對(duì)照藥材;6.黃芪對(duì)照藥材圖1 黃芪薄層色譜圖

2.1.3.2 黃芩藥味鑒別

取黃芩粉末3 g，研細(xì)，加乙酸乙酯-甲醇(3∶ 1)的混合溶液30 mL，超聲處理30 min，按《中國藥典》方法[12]制備供試品和對(duì)照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各1 μL，照薄層色譜法[11]試驗(yàn)，展開，視檢。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性無干擾，見圖2。

注：1.陰性供試品;2.供試品(批號(hào)：20160325);3.供試品(批號(hào)：20160411);4.供試品(批號(hào)：20160425);5.黃芩對(duì)照藥材圖2 黃芩薄層色譜圖

2.1.3.3 靈芝藥味鑒別

取靈芝粉末3 g，研細(xì)，加入乙醇30 mL，超聲處理30 min，按《中國藥典》方法[12]制備供試品和對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法[11]試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-甲酸乙酯-甲酸(15∶ 5∶ 1)的上層溶液為展開劑，展開，視檢。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性無干擾，見圖3。

注：1.陰性供試品;2.陰性供試品;3.供試品(批號(hào)：20160411);4.供試品(批號(hào)：20160425);5.靈芝對(duì)照藥材;6.靈芝對(duì)照藥材圖3 靈芝薄層色譜圖

2.1.4 黃芩苷含量測(cè)定

2.1.4.1 色譜條件

色譜柱：Waters XSELECT CSH-C18(4.6 mm×150 mm，5.0 μm)；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長：280 nm；柱溫：28℃；流動(dòng)相：乙腈-0.05%磷酸水(30∶ 70)。

2.1.4.2 溶液的制備

(1)對(duì)照品溶液的制備

取黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含100 μg的溶液，即得。

(2)供試品溶液的制備

取裝量差異項(xiàng)下的本品，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置100 mL的容量瓶中，加甲醇40 mL，稱量，超聲處理30 min，放冷，補(bǔ)足失重，濾過，即得。

(3)陰性對(duì)照溶液

取缺少黃芩的芝芪康艾顆粒處方藥材，按照配制工藝配制芝芪康艾顆粒，按“2.1.4.2.2”項(xiàng)下方法制成陰性供試品溶液，備用。

2.1.4.3 方法專屬性的考察

按照上述色譜條件分析對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液，結(jié)果陰性無干擾。見圖4。

2.1.4.4 線性關(guān)系的考察

取黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含1.06 mg的溶液，搖勻，作為儲(chǔ)備液。精密吸取上述儲(chǔ)備溶液0.2，0.6，1.0，1.2，1.4，1.6，2.0至10 mL容量瓶中，用乙腈-0.05%磷酸水(30∶ 70)稀釋

至刻度，微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，各進(jìn)樣10 μL，以對(duì)照品峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，濃度(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=9E+07X-29 273(r=0.999 3)，線性范圍為0.212～2.120 μg。

A.黃芩苷對(duì)照品;B.芝芪康艾顆粒樣品;C.陰性對(duì)照溶液圖4 芝芪康艾顆粒的HPLC指紋圖譜(黃芩苷)

2.1.4.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定色譜峰的峰面積，測(cè)得黃芩苷的RSD為0.31%，結(jié)果表明，精密度良好。

2.1.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一對(duì)照品溶液10 μL，于0，2，4，6，12 h進(jìn)樣，測(cè)定色譜峰的峰面積，測(cè)得黃芩苷的RSD值為0.82%，結(jié)果表明在0～12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品5份，按照樣品制備方法進(jìn)行樣品處理，分別進(jìn)樣測(cè)定，得到黃芩苷的RSD為1.45%，結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性較好。

2.1.4.8 回收率試驗(yàn)

取已知含量的同一批號(hào)樣品粉末約0.25 g，精密稱定，加入一定量的黃芩苷，依法測(cè)定，根據(jù)色譜峰峰面積值，計(jì)算回收率，得到RSD為1.19%，見表1。結(jié)果表明，本法回收率好。

表1 回收率結(jié)果

2.1.4.9 樣品的測(cè)定

取3批芝芪康艾顆粒樣品，按“2.1.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL進(jìn)樣，按上述條件測(cè)定黃芩苷含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

2.2 急性毒性實(shí)驗(yàn)研究

2.2.1 LD50預(yù)實(shí)驗(yàn)

2.2.1.1 藥物劑量與配制

該顆粒劑干浸膏粉成人以60 kg計(jì)，按動(dòng)物與人間換算[13]為小鼠20 g為4.3 g/kg。該方干浸膏粉最大溶解度為1 g/mL(相當(dāng)于5.32 g生藥/mL)，臨用前用無菌純化水配制藥液，受溶液濃度限制，參考文獻(xiàn)[14-15]，實(shí)驗(yàn)設(shè)四個(gè)劑量組，組間劑量比為1∶ 0.7，給藥劑量分別為干浸膏8.6 g/kg、12.3 g/kg、17.6 g/kg、25.1 g/kg，等容積不等濃度灌胃小鼠，給藥容積為0.5 mL/20 g。

2.2.1.2 分組與給藥

KM小鼠40只，雌雄各半，按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組，每組8只，給藥前禁食不禁水16 h。對(duì)照組給予純水，給藥組分別按8.6 g/kg、12.3 g/kg、17.6 g/kg、25.1 g/kg進(jìn)行定時(shí)一次性灌胃給藥，組別及編號(hào)如下表2。于第15天脫頸椎處死小鼠，處死前禁食不禁水14 h。觀察小鼠行為活動(dòng)有無異常；定期稱量小鼠體質(zhì)量；解剖臟器并觀察變化，用生理鹽水沖洗,濾紙吸干心臟、肝臟、脾臟、腎臟、胸腺臟器并稱重，計(jì)算臟器指數(shù)[臟器系數(shù)=器官重量(mg)/體質(zhì)量(g)]；心、肝、脾、腎、胸腺用10%多聚甲醛固定并做HE染色病理切片。

表2 分組及編號(hào)

2.2.1.3 結(jié)果

①灌藥期間，各組小鼠均未出現(xiàn)明顯毒性反應(yīng)，無死亡。②與對(duì)照組比較，恢復(fù)進(jìn)食后，各組小鼠飲食飲水量均有所降低，且雌性小鼠更明顯。③與對(duì)照組比較，各組實(shí)驗(yàn)小鼠體質(zhì)量、臟器指數(shù)均無顯著性差異(P<0.05)，見表3、4。④解剖肉眼及光學(xué)顯微鏡下觀察，各組小鼠的心臟、肝臟、脾臟、腎臟、胸腺組織器官均未見明顯異常。

表3 芝芪康艾顆粒對(duì)各組實(shí)驗(yàn)小鼠體質(zhì)量的影響

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05,**P<0.01

表4 芝芪康艾顆粒對(duì)各組實(shí)驗(yàn)小鼠臟器指數(shù)的影響(g·kg-1,n=8)

2.2.2 最大給藥量實(shí)驗(yàn)

由實(shí)驗(yàn)知，無法測(cè)出LD50，故此進(jìn)行1 d內(nèi)最大給藥量實(shí)驗(yàn)，參考文獻(xiàn)[16-20]。

2.2.2.1 分組與給藥

將雌雄各半的KM小鼠40只隨機(jī)分為2組，每組20只，給藥前禁食不禁水16 h。每天定時(shí)以干浸膏粉最大藥物濃度1 g/mL，最大給藥體積0.4 mL/10 g，24 h內(nèi)灌胃給藥2次(相當(dāng)于臨床成人用量的217.2倍)，間隔8 h。等體積純化水同時(shí)給予空白對(duì)照組，給藥2 h后恢復(fù)自由采食與飲水，連續(xù)觀察14 d。

2.2.2.2 觀察指標(biāo)

觀察小鼠外觀、飲食、排泄等活動(dòng)有無異常；定期稱量小鼠飲水、采食量；定期稱量小鼠體質(zhì)量；處死小鼠并解剖出臟器，生理鹽水沖洗擦干心臟、肝臟、脾臟、腎臟、胸腺臟器并稱重，計(jì)算臟器指數(shù)(臟器系數(shù)=器官重量(mg)/體質(zhì)量(g))；心、肝、脾、腎、胸腺用10%多聚甲醛固定并做HE病理切片。

計(jì)算受試動(dòng)物的最大耐受量倍數(shù)：最大耐受量倍數(shù)=(每只試藥動(dòng)物的耐受藥量/試驗(yàn)動(dòng)物平均體質(zhì)量)×(成人平均體重/成人每日用量)。平均體質(zhì)量小鼠按20 g計(jì)算，成人按60 kg計(jì)算。

2.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2.2.4 結(jié)果

2.2.4.1 對(duì)小鼠一般情況的影響

給藥后，動(dòng)物5 min后出現(xiàn)整理毛發(fā)、聚集一處、喜靜臥不動(dòng)等現(xiàn)象。30 min后，恢復(fù)正?；顒?dòng)。給藥2 d后小鼠大便變稀，肛周有污黑現(xiàn)象。11 d后，小鼠基本恢復(fù)正常。灌藥期間，小鼠無異常毒副反應(yīng)，且無死亡。

2.2.4.2 對(duì)各組小鼠飲食飲水量的影響

與對(duì)照組相比，給藥組飲食量除雄性小鼠在第3、5、7、9、11天及雌性小鼠在第3、15天有顯著差異(P<0.05)外，其他時(shí)間段均無顯著性差異(P<0.05)；給藥組小鼠飲水量無顯著性差異(P<0.05)，結(jié)果見表5、表6。

表5 芝芪康艾顆粒對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠飲食量的影響

注：為與對(duì)照組比較，*P<0.05,**P<0.01

表6 芝芪康艾顆粒對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠飲水量的影響

2.2.4.3 對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠體質(zhì)量的影響

與對(duì)照組相比，給藥組雄性小鼠除第13天，雌性小鼠第7、9、11、13、15天有顯著性差異(P<0.05)以及雄性小鼠在第7、9、11天有極顯著性差異(P<0.01)以外 ，其他時(shí)段小鼠均無顯著性差異(P<0.05)，結(jié)果見表7。

表7 芝芪康艾顆粒對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠體質(zhì)量的影響

注：為與對(duì)照組比較，*P<0.05,**P<0.01

2.2.4.4 對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠臟器指數(shù)的影響

與對(duì)照組相比，除給藥組小鼠心臟指數(shù)顯著性差異(P<0.05)以及給藥組小鼠肝臟指數(shù)有極顯著差異(P<0.01)以外，其余臟器指數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)，結(jié)果見表8。

注：為與對(duì)照組比較，*P<0.05,**P<0.01

2.2.4.5 對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠主要臟器的影響

解剖肉眼觀察顯示：實(shí)驗(yàn)小鼠的主要臟器均未見明顯異常。HE染色切片結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，給藥組鏡檢切片中心臟、脾臟、腎臟、胸腺均無明顯病理差異,見圖5；心臟縱行心肌細(xì)胞，結(jié)構(gòu)完整；脾臟白髓內(nèi)脾小結(jié)內(nèi)的淋巴細(xì)胞，結(jié)構(gòu)完整；腎臟中腎單位細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整；胸腺的皮質(zhì)內(nèi)淋巴細(xì)胞和髓質(zhì)內(nèi)胸腺上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。給藥組肝臟中央靜脈周圍肝細(xì)胞輕微腫脹、擁擠，個(gè)別細(xì)胞呈現(xiàn)輕微空泡化變性。肝細(xì)胞索紊亂、竇周隙變窄。結(jié)果見圖5中對(duì)照組肝臟和給藥組肝臟。

注：給藥組肝臟 指示肝細(xì)胞；指示竇周隙圖5 實(shí)驗(yàn)小鼠HE染色病理切片圖片(HE 400×)

2.2.4.6 最大耐受量計(jì)算

20 g小鼠每天灌胃量為1.6 mL(即1.6 g)，成人每天用量為22 g。計(jì)算得最大耐受量倍數(shù)為217.2倍(即1.6/20×60 000/22)。

3 討論

本研究采用薄層鑒別對(duì)制劑中黃芪、黃芩、靈芝進(jìn)行了鑒別，在黃芪的TLC鑒別中，點(diǎn)樣量過大，因此將點(diǎn)樣量減少；在黃芩的TLC鑒別中，樣品回流太過復(fù)雜，優(yōu)化為超聲提取[21]；在靈芝的TLC鑒別中，展開劑用正己烷代替石油醚[22]，展開效果更好。黃芩中黃芩苷具有多種重要生物活性，例如抑菌、抗炎、抗癌反應(yīng)等生理功效和作用[23]。為確保藥物臨床療效，故選擇黃芩中黃芩苷的含量測(cè)定作為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。依據(jù)2015版中國藥典中黃芩苷含量測(cè)定方法的流動(dòng)相甲醇-水-磷酸(47∶ 53∶ 0.2)，發(fā)現(xiàn)供試品色譜峰拖尾、出峰時(shí)間延長，而本研究采用乙腈-0.05%磷酸水(30∶ 70)測(cè)定[24]，峰形良好，出峰時(shí)間較理想。該方法所建立的定性定量方法簡便，準(zhǔn)確，分離度好，適用于芝芪康艾顆粒的質(zhì)量控制。

為進(jìn)一步確定該制劑客觀科學(xué)性，對(duì)小鼠進(jìn)行初步安全性評(píng)價(jià)。該制劑對(duì)小鼠飲食、飲水和體質(zhì)重影響，認(rèn)為可能與芝芪康艾顆粒大劑量灌胃給藥有關(guān)，必要時(shí)應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行長期毒性實(shí)驗(yàn)研究。HE染色結(jié)果顯示，該制劑對(duì)小鼠急性毒性作用主要為肝損傷。實(shí)驗(yàn)未測(cè)出灌胃給藥的LD50，表明該制劑急性毒性較小。據(jù)急性毒性試驗(yàn)指導(dǎo)原則，小鼠的最大耐受量大于臨床成人用藥量的100倍以上為安全[25]。以最大給藥濃度和最大容積灌胃給藥后，小鼠未出現(xiàn)死亡及明顯毒性反應(yīng)，即為該制劑最大耐受量，用藥量為臨床成人用藥的217.2倍。結(jié)果表明該制劑雖具有一定肝毒性，但臨床用藥安全性較高。本研究初步證明了該制劑用藥的安全性，為進(jìn)一步開發(fā)利用和推廣應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。