楊萍，周玉平，常秀春，王鳳，李高文

(1.寧波衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院 護(hù)理學(xué)院，浙江 寧波 315100;2.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，浙江 寧波 315000)

心肌缺血再灌注損傷的中醫(yī)病因病機(jī)以心氣虛衰為本，心血瘀阻、痰濁內(nèi)生為標(biāo)，為本虛標(biāo)實(shí)證，中醫(yī)藥治療以益氣養(yǎng)心扶正以固本，活血化瘀祛痰以治標(biāo)[1]。黃芪是歷代醫(yī)家治療心血管疾病最常用的中藥。黃芪甲苷(Astragaloside-Ⅳ, AS-Ⅳ)是黃芪藥理活性的主要物質(zhì)之一，具有包括抗缺血/再灌注損傷作用在內(nèi)的多種心血管藥理作用[2]。黃芪甲苷防治心血管疾病的機(jī)制主要與抗氧化、抗炎作用有關(guān)[3-4]，但其具體的靶向分子及信號(hào)通路尚不十分明確。

血紅素氧化酶1(Heme oxygenase，HO-1)是一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白，在各種病理性刺激時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生。HO-1通過降解氧化型血紅素，產(chǎn)生具有抗氧化作用的膽紅素和具有抗炎作用的一氧化碳，因此近年來被公認(rèn)為是一種重要的抗氧化劑及組織保護(hù)酶[5]。研究發(fā)現(xiàn)，HO-1對(duì)具有心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用[6]。HO-1是否介導(dǎo)了黃芪甲苷對(duì)缺氧/復(fù)氧(Hypoxia/Reoxygenation,H/R)損傷的心肌細(xì)胞保護(hù)作用值得研究與證實(shí)。本研究以原代心肌細(xì)胞H/R心肌損傷模擬心肌缺血再灌注損傷，探討黃芪甲苷抗H/R損傷作用機(jī)制，為闡釋中藥抗心肌缺血再灌注損傷提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SD大鼠乳鼠，SPF 級(jí)，出生1～3 d，雌、雄不限，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)SCXK(京)2016-0011。

1.2 藥物與試劑

黃芪甲苷(成都瑞芬思生物科技有限公司，批號(hào)：170614， 純度≥99%)；原卟啉氯化鈷(Copp)、原卟啉Ⅸ鋅(Ⅱ)絡(luò)合物(Znpp)、四甲基唑藍(lán)(MTT)購自美國Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自美國GIBCO 公司；兔抗小鼠GAPDH 多克隆抗體和兔抗小鼠HO-1 多克隆抗體購自Santa Cruz；過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。RIRP裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-AGE凝膠配置試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自上海碧云天生物工程有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器

生物潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣有限公司)；恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；全自動(dòng)生化分析儀(日本HITACHI公司)。

2 方法

2.1 心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)

參考文獻(xiàn)[7]方法進(jìn)行心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)：取出生1～3 d SD大鼠乳鼠，無菌條件下取出心臟，胰酶消化法將心肌組織逐步分離成單個(gè)心肌細(xì)胞，接種至培養(yǎng)瓶，置于37℃，5% CO2飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)90 min后，差速貼壁去除成纖維細(xì)胞。將純化后的心肌細(xì)胞調(diào)整濃度，接種至6孔板或96孔板中，每24 h更換1次培養(yǎng)液。72 h后心肌細(xì)胞已成片搏動(dòng)，當(dāng)細(xì)胞基本融合時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 H/R損傷模型復(fù)制

參照文獻(xiàn)[8]并加以改進(jìn)建立心肌細(xì)胞H/R模型。將培養(yǎng)的心肌細(xì)胞以模擬缺血溶液置換正常培養(yǎng)液，置于缺氧裝置中培養(yǎng)4 h，即為缺氧模型。再換用模擬再灌注溶液，于常氧環(huán)境中培養(yǎng)4 h，即為復(fù)氧模型。

2.3 AS-Ⅳ給藥濃度確定

將心肌細(xì)胞懸液以5×104個(gè)/mL接種于96 孔板，留出1個(gè)孔不加細(xì)胞懸液，作為空白對(duì)照組。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至融合成片搏動(dòng)時(shí)，加入含不同濃度黃芪甲苷的培養(yǎng)液(終濃度分別為1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L)，同時(shí)設(shè)立正常對(duì)照組(不干預(yù))、模型組(H/R)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 。MTT法測定心肌細(xì)胞活力，以測定吸光度(A)，取平均值計(jì)算

細(xì)胞活力=A藥液-A空白/A正常對(duì)照-A空白×100%

2.4 細(xì)胞分組及干預(yù)

心肌細(xì)胞懸液以5×104個(gè)/mL接種于96孔板，每孔100 μL。留出1個(gè)孔不加細(xì)胞懸液，作為空白對(duì)照組。將培養(yǎng)的心肌細(xì)胞隨機(jī)分為6組：①正常對(duì)照組(Normal control);②H/R組；③H/R+AS-Ⅳ組(造模后給予AS-Ⅳ100 μmol/L干預(yù)24 h)；④H/R+Copp(造模后給予終濃度為20 μmol/L Copp干預(yù)24 h)組；⑤H/R+Znpp(造模后給予終濃度為20 μmol/L Znpp干預(yù)24 h)組。⑥H/R+Znpp+AS-Ⅳ(造模后給予終濃度為20 μmol/L Znpp干預(yù)24 h，再給予AS-Ⅳ100 μmol/L干預(yù)24 h)組 。每個(gè)組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。

2.5 MTT測定細(xì)胞活力

按實(shí)驗(yàn)分組給予相應(yīng)的處理因素后棄去上清液，每孔加入MTT溶液(終濃度為0. 5 mg/L)100 μL，繼續(xù)孵育4 h后，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min至藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚充分溶解，在波酶標(biāo)儀490 nm處檢測其吸光度A。取平均值計(jì)算細(xì)胞活力。

2.6 cTnT、SOD、GSH-PX含量的測定

取各組培養(yǎng)液，按試劑盒操作說明檢測心肌肌鈣蛋白(cardiac troponin，cTn)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)含量。

2.7 hs-CRP、TNF-α含量的測定

按實(shí)驗(yàn)分組給予相應(yīng)的處理因素后，取各組培養(yǎng)液，按試劑盒操作說明采用ELISA法檢測細(xì)胞上清液中超敏C反應(yīng)蛋白(Hypersensitive C-reactive protein,hs-CRP)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)。

2.8 Western blot測定HO-1蛋白表達(dá)

心肌細(xì)胞懸液以5×105個(gè)/mL接種于6孔板中，每孔2 mL。按實(shí)驗(yàn)分組給予相應(yīng)的處理因素后收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞并提取總蛋白，根據(jù)BCA 蛋白定量法檢測各蛋白濃度。取樣品蛋白質(zhì)50 μg，與SDS上樣緩沖液混合，95～100℃變性5 min；制膠，上樣，電泳，切膠，半干轉(zhuǎn)膜器恒壓12V轉(zhuǎn)PVDF膜60 min，PBST洗膜10 min×3次,以5% BSA/PBS封閉1 h， 加入一抗中4℃輕搖孵育過夜，PBST洗膜10 min×3次, 加入二抗室溫輕搖孵育1 h，將膜置于Kodak Image Station 2000MM成像系統(tǒng)曝光，獲取目的條帶圖像。Image J軟件分析灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。取3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的均值進(jìn)行比較。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組心肌細(xì)胞活力比較

心肌細(xì)胞經(jīng)H/R處理后，H/R組細(xì)胞活力較正常對(duì)照組顯著降低，說明H/R可造成心肌細(xì)胞損傷。隨著AS-Ⅳ藥液濃度的增加，細(xì)胞活力呈濃度依賴性增高，與H/R模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明黃芪甲苷呈濃度依賴性減輕H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，確定AS-Ⅳ干預(yù)濃度為100 μmol/L，結(jié)果見表1。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與H/R組比較，HO-1誘導(dǎo)劑CoPP可顯著增加心肌細(xì)胞活力，而HO-1抑制劑ZnPP組細(xì)胞活力顯著降低，說明增加HO-1含量可減輕H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷；心肌細(xì)胞經(jīng)H/R預(yù)處理后，給予AS-Ⅳ干預(yù)24 h，細(xì)胞活力較H/R模型組顯著改善。結(jié)果見表2。

表1 不同濃度AS-Ⅳ對(duì)H/R損傷心肌細(xì)胞模型細(xì)胞活力的影響

注：與Normal control組比較，P<0.05；與H/R組比較，P<0.05

表2 各組心肌細(xì)胞活力比較

注：與Normal control組比較，P<0.05；與H/R組比較，P<0.05

3.2 各組心肌細(xì)胞cTnT、SOD、GSH-PX水平比較

與Normal control組比較，H/R組心肌細(xì)胞SOD、GSH-PX活性顯著降低，而cTnT活性顯著增加，ZnPP則顯著加重H/R導(dǎo)致的上述指標(biāo)變化，說明ZnPP可加重H/R導(dǎo)致的氧化平衡體系失衡；黃芪甲苷、CoPP可顯著增加H/R預(yù)處理后的SOD、GSH-PX活性，降低cTnT活性，說明黃芪甲苷、CoPP對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用與抗氧化作用有關(guān)。結(jié)果見表3。

表3 H/R預(yù)處理后各組細(xì)胞cTnT、SOD、GSH-PX水平

注：與Normal control組比較，P<0.05；與H/R組比較，P<0.05

3.3 各組細(xì)胞上清hs-CRP、TNF-α水平比較

心肌細(xì)胞經(jīng)H/R預(yù)處理后，細(xì)胞上清炎癥因子hs-CRP、TNF-α表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增高(P均=0.000)，ZnPP則顯著加重H/R導(dǎo)致的上述指標(biāo)變化，說明ZnPP可進(jìn)一步促進(jìn)H/R誘導(dǎo)的炎癥因子hs-CRP、TNF-α的表達(dá)。經(jīng)黃芪甲苷、CoPP干預(yù)后，細(xì)胞上清中hs-CRP、TNF-α水平顯著降低，說明黃芪甲苷、CoPP可減輕H/R誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)。結(jié)果見表4。

3.4 各組心肌細(xì)胞HO-1蛋白表達(dá)水平比較

與H/R組比較，心肌細(xì)胞經(jīng)H/R+COPP干預(yù)后HO-1蛋白表達(dá)顯著增高，經(jīng)ZnPP干預(yù)后HO-1蛋白表達(dá)顯著下降；與H/R組比較，經(jīng)AS-Ⅳ干預(yù)后，HO-1蛋白表達(dá)顯著升高，且與H/R+COPP組無顯著差異，說明AS-Ⅳ可促進(jìn)心肌細(xì)胞HO-1蛋白表達(dá)。結(jié)果見圖1。

表4 H/R預(yù)處理后細(xì)胞上清hs-CRP、TNF-α表達(dá)的影響

注：與Normal control組比較，P<0.05；與H/R組比較，P<0.05

圖1 各組細(xì)胞中HO-1蛋白表達(dá)的比較

4 討論

近年來，隨著對(duì)心肌缺血再灌注損傷研究的不斷深入，氧自由基損傷、炎癥介質(zhì)釋放被認(rèn)為是心肌缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展過程中的始動(dòng)因素[9]。因此，維持體內(nèi)氧化平衡體系的穩(wěn)定，干預(yù)炎癥是保護(hù)心肌細(xì)胞的重要手段。越來越多的研究證實(shí)，增加HO-1基因表達(dá)可通過多種途徑發(fā)揮心血管保護(hù)作用，如抗缺血再灌注損傷，抗動(dòng)脈粥樣硬化和增加斑塊的穩(wěn)定性，抑制心肌肥厚，抑制心肌細(xì)胞凋亡等[10-11]。本研究通過給予HO-1特異性激動(dòng)劑鈷原卟啉或抑制劑鋅原卟啉對(duì)H/R造模后心肌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)HO-1誘導(dǎo)劑CoPP可改善心肌細(xì)胞H/R損傷所致的細(xì)胞活力下降，增強(qiáng)抗氧化酶活性，抑制炎癥因子表達(dá)，而HO-1抑制劑ZnPP則進(jìn)一步加重H/R損傷所致的細(xì)胞損傷。說明HO-1抗心肌細(xì)胞H/R損傷與抑制炎癥因子表達(dá)，抗氧化應(yīng)激有關(guān)。因此，HO-1是治療心血管疾病的一個(gè)很好的潛在靶點(diǎn)，通過各種方式誘導(dǎo)HO-1表達(dá)必然在缺血再灌注損傷時(shí)的細(xì)胞保護(hù)方面發(fā)揮重要作用。

根據(jù)心肌缺血再灌注損傷患者臨床特征，中醫(yī)學(xué)者認(rèn)為其病機(jī)心氣虛衰為本，故其治則當(dāng)以益氣養(yǎng)心扶正以固本。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及和臨床實(shí)際觀察的基礎(chǔ)上已證明多種中藥和中藥復(fù)方有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制多以抗氧化、抗炎為主[12]。黃芪味甘，微溫，歸脾、肺經(jīng)，具有健脾補(bǔ)中，補(bǔ)氣固表、升陽舉陷、利尿排毒、排膿、斂瘡生肌等功效，成為中醫(yī)臨床常用補(bǔ)益中藥。黃芪甲苷是黃芪藥理活性的主要物質(zhì)之一，為黃芪制劑質(zhì)量鑒定的指標(biāo)成分，在藥典中被作為黃芪質(zhì)量檢測標(biāo)志物。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)黃芪甲苷對(duì)多種心肌細(xì)胞損傷模型具有顯著的保護(hù)作用，具有增強(qiáng)心肌收縮力，改善心肌能量代謝，抑制心肌纖維化和心肌細(xì)胞凋亡作用[13-14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：黃芪甲苷可顯著增高HO-1蛋白表達(dá)水平；與模型組比較，黃芪甲苷干預(yù)后的心肌細(xì)胞活力呈濃度依賴性增高，顯著增加H/R預(yù)處理后的SOD、GSH-PX活性，降低cTnT活性，降低炎癥因子hs-CRP、TNF-α表達(dá)。當(dāng)H/R心肌細(xì)胞預(yù)先經(jīng)HO-1抑制劑ZnPP預(yù)處理后，再進(jìn)行黃芪甲苷干預(yù)，結(jié)果顯示：與模型組比較，其細(xì)胞活力、氧化平衡體系、炎癥因子表達(dá)無顯著性差異。由此可以明確，黃芪甲苷可減輕H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，其作用機(jī)制之一可通過誘導(dǎo)HO-1蛋白的表達(dá)，通過HO-1介導(dǎo)的抗氧化、抗炎作用發(fā)揮抗心肌細(xì)胞H/R損傷作用。