郭欣碩，徐小雅，黃萍萍，關(guān) 麗，羅 靳，郭 楠

(遼寧省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)基地建設(shè)工程中心，遼寧 沈陽 110032)

隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大、養(yǎng)殖密度的不斷增加、飼養(yǎng)頻率的提高以及養(yǎng)殖環(huán)境質(zhì)量的不斷下降，大菱鲆在養(yǎng)殖過程中也產(chǎn)生了許多疾病，例如細(xì)菌病、病毒病、寄生蟲病等。其中，細(xì)菌病是我國大菱鲆養(yǎng)殖中受到損害最嚴(yán)重的一類疾病，據(jù)報(bào)道，我國大菱鲆養(yǎng)殖各種致病菌主要有大菱鲆弧菌、遲鈍愛德華氏菌、鰻弧菌、魚腸道弧菌、溶藻弧菌、大菱鲆源副溶血弧菌等，常引起魚類的敗血癥、魚皮下出血、鱗片黏膜脫落、鰭基部充血、潰爛癥、腹水癥、腸道白濁、腸黏膜腐爛脫落等，導(dǎo)致魚的大量死亡，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。因此，本研究選取大菱鲆源弧菌作為研究對象，并基于微量肉湯稀釋法分析不同大菱鲆弧菌分離株的藥物敏感性，以期為大菱鲆養(yǎng)殖過程中的疾病預(yù)警和安全用藥及弧菌的防治提供理論參考和技術(shù)支持。

一、材料與方法

1.試驗(yàn)菌株

弧菌86株，分離自遼寧某地區(qū)大菱鲆，由遼寧省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)基地建設(shè)工程中心(疫病防控實(shí)驗(yàn)室)保存。菌株來源如表1所示。

表1 大菱鲆源弧菌的來源

2.細(xì)菌的培養(yǎng)

嚴(yán)格按無菌操作的技術(shù)要求，觀察并選取典型細(xì)菌病癥的新鮮個(gè)體，經(jīng)過解剖后，將新鮮組織和典型病灶部位體液接種于兩個(gè)選擇性培養(yǎng)基平板上(弧菌分離培養(yǎng)選用TCBS培養(yǎng)基，愛德華氏菌的分離培養(yǎng)選用麥康凱培養(yǎng)基)，(28±1)℃連續(xù)培養(yǎng)18～24小時(shí)，觀測菌落形態(tài)特征，挑選疑似的單個(gè)菌落，接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板上，(28±1)℃連續(xù)培養(yǎng)18～24小時(shí)，可得到純菌株。

3.藥敏試驗(yàn)

本試驗(yàn)所用藥物為我國目前允許使用的水產(chǎn)用抗菌類藥物：恩諾沙星、甲砜霉素、氟苯尼考、硫酸新霉素、氟甲喹、鹽酸多西環(huán)素、磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶。測試所用8種抗菌類藥敏分析試劑板購自南京菲恩醫(yī)療科技公司，試劑板主要組成成分及板條設(shè)置見表2。

表2 試劑板主要組成成分及板條設(shè)置 微克/毫升

本試驗(yàn)方法參照試劑板公司提供的說明書，將傳代培養(yǎng)基和獲得的純菌樣品混合制成0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙?，取后混入無菌生理鹽水，向陰性對照孔中依次加入200微升無菌生理鹽水，再次吸取200微升菌懸液混入無菌生理鹽水即可得到無菌樣品稀釋液。每孔分別加入200微升(陰性對照樣品除外)，將已經(jīng)加樣好的藥敏分析試劑板直接放入28℃的大型恒溫培養(yǎng)箱中，經(jīng)培養(yǎng)24～28小時(shí)即可讀取試驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果按照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所(CLSI)頒布的耐藥性標(biāo)準(zhǔn)以及南京菲恩醫(yī)療科技公司提供的判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

二、結(jié)果與分析

1.弧菌分離培養(yǎng)結(jié)果

2019年4－10月，分批次從兩個(gè)定點(diǎn)養(yǎng)殖場的大菱鲆中選取具有典型弧菌病癥的個(gè)體進(jìn)行活體解剖，并選取了腹水、肝、脾、腎4個(gè)病灶部位，接種于TCBS選擇性培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，用以分離弧菌和愛德華氏菌。6次共采集大菱鲆樣品216份，分離培養(yǎng)菌株共390株，其中弧菌屬202株，采集率約占總菌株數(shù)的52%，愛德華氏菌屬31株，采集率約占總菌株數(shù)的8%。另有157株其他菌株，采集率約占總菌株數(shù)的40%。大菱鲆樣品的數(shù)量、水溫、時(shí)間、分離菌株數(shù)量詳見表3。

表3 遼寧省菌株采集及分離情況

從表3可以看出，條件致病菌的弧菌均有檢出，表明弧菌在該地區(qū)養(yǎng)殖的大菱鲆中廣泛存在，并隨著日期不同有所變化。在水溫較高的環(huán)境下，病害高發(fā)的6－8月，弧菌的數(shù)量明顯高于其他日期。愛德華氏菌分離到的數(shù)目相對較少，全年共分離到31株，其中在5月檢出1株、7月檢出24株、10月檢出6株，其他日期未檢出。結(jié)合當(dāng)年葫蘆島大菱鲆養(yǎng)殖病害暴發(fā)情況及菌株鑒定結(jié)果可以得知，在水溫相對偏高且病害高發(fā)的7月，愛德華氏菌檢出的數(shù)量相對較多，愛德華氏菌可能是引起該地區(qū)當(dāng)月大菱鲆發(fā)病的主要病原菌。

(待 續(xù))