黃 瓊

（福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)系，福建福州350119）

枇杷葉系薔薇科枇杷屬植物枇杷的干燥葉，又名巴葉，是傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)常用的中草藥［1］。枇杷葉具有清肺止咳、降逆止嘔的作用，臨床用于治療肺熱咳嗽、胃熱嘔吐、氣逆喘氣及煩熱口渴之癥狀［2］。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)枇杷葉的化學(xué)成分進(jìn)行了系列研究，發(fā)現(xiàn)其含有黃酮類、揮發(fā)油、倍半萜類、三萜類等活性成分［3］。

黃酮類化合物廣泛存在于天然產(chǎn)物中，具有多種生理學(xué)活性和藥理作用，其具有抑菌、防癌抗癌、抗心率失常、抗氧化、抗衰老、抗心血管疾病、抗骨質(zhì)疏松、降血脂、護(hù)肝、解肝毒、治療急、慢性肝炎及肝硬化等功能［4-10］。枇杷葉黃酮類化合物的測定常用的方法有分光光度法和高效液相色譜法［11］。在實(shí)際科研工作中，考慮到方法的簡便、快捷及可行性，多采用分光光度法測定黃酮類化合物含量。本文采用分光光度法測定枇杷葉黃酮類化合物含量，并考察枇杷葉黃酮類化合物對(duì)·OH和O2-·的清除作用，為枇杷葉的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)和參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 原料

枇杷葉：于5月中旬采集于福清26度休閑農(nóng)莊，經(jīng)摘取、清洗，晾干，放入干燥箱干燥后，粉碎、密封保存，備用。

1.1.2 試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：購自北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司，（UV≥99%）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器

FS-1200N超聲波處理器：上海生析超聲儀器有限公司；UV-1800PC-DS2紫外可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；ST-80索氏提取裝置：北京賽福萊博科技有限公司；FZ102微型植物粉碎機(jī)：北京格拉威爾科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取0.020 0 g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，以60%乙醇溶解，定容，精確量取25 mL置于50 mL容量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度，即得0.1 g/L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。用紫外可見光度計(jì)對(duì)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液和枇杷葉提取液進(jìn)行190～600 nm范圍內(nèi)的掃描。在蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液中均發(fā)現(xiàn)在310 nm處出現(xiàn)明顯而無干擾的獨(dú)立峰。因此，將310 nm作為最大吸收波長。取0.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液分別于25 mL容量瓶中，加60%乙醇定容至刻度，搖勻，于310 nm處測其吸光度。以吸光度A與濃度C進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。

1.2.2 枇杷葉黃酮類化合物含量測定

準(zhǔn)確稱取干燥枇杷葉10.0 g，置于500 mL燒杯中，加入100 mL的70%乙醇，置于超聲清洗儀中進(jìn)行超聲波處理，然后用轉(zhuǎn)速為4 000 r/min離心機(jī)進(jìn)行離心，離心15 min，離心后棄去殘?jiān)∩锨逡海瑴?zhǔn)確移取上清液5.0 mL，置于250 mL容量瓶中，以60%乙醇溶解，定容至刻度。準(zhǔn)確移取2.0 mL樣品液，通過蘆丁回歸方程計(jì)算枇杷葉黃酮類化合物含量，其計(jì)算公式為：

1.2.3 加標(biāo)回收率的測定

分別準(zhǔn)確移取 0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.348 g·L-1），與 0.1 mL樣品溶液（10.430 g·L-1）混合，分別用無水乙醇定容至25 mL，于310 nm處測吸光度，其計(jì)算公式為［12］：

1.2.4 枇杷葉黃酮類化合物對(duì)·OH的清除作用

準(zhǔn)確移取 1.0 mL0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mg·mL-1樣品液于 25 mL 具塞比色管中，依次加入 2 mmol·L-1的 FeSO4的 3.0 mL、6 mmol·L-1的水楊酸 3.0 mL，搖勻，再分別向各比色管中加入2 mmoL·L-1的H2O23.0 mL，搖勻，于37℃恒溫水浴反應(yīng)15 min，取出在波長510 nm處測得吸光度值A(chǔ)1，以0.0 mg·mL-1樣品液吸光值為A0，計(jì)算樣品液對(duì)·OH的清除率，其計(jì)算公式如下［13］：

式中：A0為空白管的吸光值；A1為樣品液的吸光值。

1.2.5 枇杷葉黃酮類化合物對(duì)O2-·的清除作用

準(zhǔn)確移取 1.0 mL 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mg·mL-1樣品液 1.0 mL，再加入 5.0 mL 50 mmol·L-1的Tris-HCl緩沖液（pH=8.2），25℃水浴20 min后，取出迅速加入0.1 mL25 mmol·L-1的鄰苯三酚，混勻保溫10 min后，立刻加入2滴10 mol·L-1的HCl終止反應(yīng)，溶液在波長325 nm處的吸光值X1，同法測定用蒸餾水代替鄰苯三酚后的吸光值X2，及以1.0 mL蒸餾水替代樣品溶液后的吸光值X0，來計(jì)算樣品液對(duì)O2-·的清除率，其計(jì)算公式如下［14-15］

式中，X1為樣品溶液吸光值；X2為蒸餾水替代鄰苯三酚后的吸光值；X0為蒸餾水替代樣品溶液后的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果取平均值，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 枇杷葉黃酮類化合物含量測定

按1.2.1和1.2.2方法進(jìn)行蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和黃酮類化合物含量的測定，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量與吸光度之間滿足關(guān)系式A=9.751 4 C+5×10-5，R2=0.999 9，式中：C為蘆丁質(zhì)量濃度g·L-1，A為吸光度，見圖1。結(jié)果表明，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品含量在0.00～0.05 g·L-1范圍與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。根據(jù)回歸方程計(jì)算出枇杷葉黃酮類化合物含量為78.86 mg·g-1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 樣品回收率

按1.2.3方法進(jìn)行樣品回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。由表1可知，平均加標(biāo)回收率為100.2%，RSD為0.94%。符合規(guī)定，表明紫外分光光度法可用于測定枇杷葉總黃酮含量，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度較高。

表1 回收率測定結(jié)果

2.3 枇杷葉黃酮類化合物對(duì)對(duì)·OH的清除作用

按1.2.4的方法進(jìn)行清除對(duì)·OH的測定，以對(duì)·OH的清除率為因變量，以樣品濃度為自變量，作圖，結(jié)果見圖2。由圖2可知，枇杷葉黃酮類化合物對(duì)·OH有清除作用，在枇杷葉黃酮類化合物質(zhì)量濃度為0.2～1.4 mg·mL-1范圍內(nèi)，其清除·OH能力隨著黃酮類化合物質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度為1.4 mg·mL-1時(shí)，對(duì)·OH清除率最高為82.9%。

圖2 枇杷葉黃酮類化合的對(duì)·OH-清除作用

2.4 枇杷葉黃酮類化合物對(duì)O2-·的清除作用

按1.2.5的方法進(jìn)行清除O2-·的測定，以對(duì)O2-·的清除率為因變量，以樣品濃度為自變量，作圖，結(jié)果見圖3。由圖3可知，枇杷葉黃酮類化合物對(duì)O2-·有清除作用，在黃酮類化合物質(zhì)量濃度為0.2～1.4 mg·mL-1范圍內(nèi)，黃酮類化合物清除O2-·能力隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。當(dāng)其濃度為1.4 mg·mL-1時(shí)，對(duì)O2-·-清除率最高為77.3%。

圖3 枇杷葉黃酮類化合的對(duì)O2-·清除作用

3 結(jié)論

本文采用分光光度法測定枇杷葉中黃酮類化合物含量，其含量為78.86 mg·g-1，樣品回收率為100.2%，說明紫外分光光度法測定枇杷葉中總黃酮含量的分析方法是一種可行性強(qiáng)，適合一般實(shí)驗(yàn)室操作的方法。

枇杷葉黃酮類化合物能夠有效清除·OH和O2-·，枇杷葉黃酮類化合物質(zhì)量濃度為1.4 mg·mL-1時(shí)，其對(duì)·OH和O2-·的清除率分別為82.9%和77.3%，說明枇杷葉黃酮類化合物具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，且清除作用隨枇杷葉黃酮類化合物質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。