劉玉晨,李敬雙,于 洋

(錦州醫(yī)科大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 121001)

藍莓(Blueberry),又名越橘、藍漿果、紅豆果等,是杜鵑花科越橘屬多年生落葉或常綠果樹。藍莓果實中含有大量類黃酮、花色苷、酚酸等生物活性物質(zhì),具有防止腦神經(jīng)老化[1]、抗炎[2]、抗氧化[2]、保護肝臟[3]、提高機體免疫力[4]、減肥[5]等多種功能。

藍莓中花色苷的含量很高,原果含量達到 3.86%(果皮4.61%,汁1.29%),是其最重要的生物活性成分[6]?，F(xiàn)代研究表明,藍莓花色苷具有抗氧化[7]、清除自由基[7]、降血糖[7]、降血脂[7]、防止動脈粥樣硬化[8]、防治骨質(zhì)疏松[7]、預防眼疾[7]、減肥[7]等作用?；ㄉ漳芗せ蠲庖呦到y(tǒng),使血清免疫球蛋白免受自由基的侵害,激活巨噬細胞,增強人體免疫力[1]。藍莓花色苷可破壞細胞壁和細胞膜的完整性,導致微生物釋放胞內(nèi)成分而死亡;可抑制 DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成,導致細菌死亡;能破壞菌體結(jié)構(gòu)成分(如膜蛋白),改變菌體形態(tài),使孢壁破裂,細菌死亡,從而發(fā)揮抗炎作用[1]。有研究表明,藍莓花色苷是至今為止所發(fā)現(xiàn)的最有效的抗氧化劑,也是最強效的自由基清除劑,其抗氧化強度為維生素E(VE)的50倍,維生素C(VC)的20倍[1]。藍莓果實中的花色苷因其鮮艷的顏色和天然無毒的性質(zhì),特別適宜用作食品添加劑,目前已廣泛應用到果醬、果凍、雪糕、冰淇淋、糖果、腌制品等食品中。近年來,作為藥品來防治疾病的研究已經(jīng)初具規(guī)模,對藍莓花色苷的生物學功能,如作用基因、相關(guān)酶類、大分子活性物質(zhì)、靶器官、受體、分子信號傳導途徑、作用機制等方面應進行深入的研究。

為探討藍莓花色苷的免疫調(diào)節(jié)活性,本實驗以藍莓花色苷作用于體外培養(yǎng)的淋巴細胞和腹腔巨噬細胞,通過檢測淋巴細胞增殖、腹腔巨噬細胞吞噬活性及相關(guān)因子的作用,考察其提高機體免疫力的功能,為藍莓花色苷的進一步開發(fā)和利用提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

Balb/c小鼠 SPF級,體重(20±2) g,6～8周齡,錦州醫(yī)科大學生命科學院,生產(chǎn)許可證號 SCXK(遼)2014-0004;藍莓花色苷 晨光生物技術(shù)有限公司,純度≥85%;新生牛血清 浙江天杭生物科技有限公司產(chǎn)品;甲基噻唑藍(MTT)、臺盼藍、RPMI-1640培養(yǎng)基、二甲基亞砜(DMSO)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)和磷酸鹽緩沖溶液(PBS) 北京索萊寶科技有限公司;小鼠TNF-α、IL-4、IL-6、IL-12細胞因子檢測試劑盒 武漢博士德公司。

Varioskan FlashT多功能酶標儀 Thermo Fisher Scientific;SW-CJ-1F型超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司,;CKX41SF倒置顯微鏡 日本OLYMPUS公司,;TD5A低速離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司,;96孔或24孔板臺式離心機 上海安亭(TDL80-2B);CO2培養(yǎng)箱 日本SHELLAB。

1.2 實驗方法

1.2.1 淋巴細胞懸液制備 參考桑卡娜等[9]、馬玉芳等[10]實驗方法,小鼠用頸部斷髓法處死,75%酒精浸泡3 min消毒,在無菌超凈工作臺內(nèi)取脾,用PBS沖洗2次,置于RPMI-1640培養(yǎng)基中,用注射器拉桿柄將其磨碎,200目濾網(wǎng)過濾。收集濾液置于離心管中,1500 r/min 4 ℃離心5 min,棄上清,加入Tris-NH4Cl 3 mL裂解紅細胞,靜置5 min,加入D-Hanks液終止反應,D-Hanks液洗滌3次后,用RPMI-1640完全培養(yǎng)基懸沉淀細胞并過濾,經(jīng)臺盼藍染色檢測,細胞活力達95%以上。加入RPMI-1640完全培養(yǎng)基,調(diào)整細胞密度為5×106個/mL,制成淋巴細胞懸液。

1.2.2 巨噬細胞懸液制備 參考張思哲等[11]、戴藝等[12]實驗方法,每只小鼠腹腔注射2 mL 5%淀粉肉湯,36 h頸椎脫臼法處死小鼠,75%酒精浸泡3 min消毒,在無菌超凈工作臺內(nèi)從腹白線處剪開皮膚,將皮膚剝離向兩側(cè),暴露出腹壁肌肉,腹腔注入4 mL RPMI-1640培養(yǎng)基,輕揉腹部3 min,靜置5 min后抽取腹腔洗液,置于離心管中,1500 r/min 4 ℃離心5 min,棄上清,PBS洗兩遍。貼壁3 h,去除非貼壁細胞,臺盼藍染色計數(shù)細胞活力,細胞活力達到95%以上。加入RPMI-1640完全培養(yǎng)基,將細胞密度調(diào)整為5×106個/mL,制成巨噬細胞懸液。

1.2.4 藍莓花色苷對巨噬細胞吞噬活性的影響 用中性紅吞噬實驗法檢測,參考楊平等[13]實驗方法,實驗設(shè)空白組、陽性組、藍莓花色苷處理組。用96孔細胞培養(yǎng)板,每組均設(shè)5復孔,每孔加入100 μL巨噬細胞懸液?？瞻捉M每孔加入100 μL RPMI-1640完全培養(yǎng)基,陽性組每孔加入100 μL含有左旋咪唑(終濃度為5 μg/mL)的RPMI-1640完全培養(yǎng)基;藍莓花色苷處理組每孔分別加入100 μL含不同濃度藍莓花色苷(終濃度為4、8、16、32和64 mg/mL)的RPMI-1640完全培養(yǎng)基。37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)24 h。各細胞培養(yǎng)孔用PBS 洗滌后加入1 g/L的中性紅生理鹽水100 μL,繼續(xù)培養(yǎng) 30 min,吸棄上清并用PBS洗滌3次,各孔加入細胞裂解液100 μL,4 ℃過夜裂解細胞,酶標儀檢測570 nm的OD值,以O(shè)D值判定小鼠腹腔巨噬細胞吞噬活性。

1.2.5 藍莓花色苷對淋巴細胞分泌細胞因子的影響 用ELISA法檢測,參考Xie等[14]實驗方法,實驗設(shè)空白組、陽性組、藍莓花色苷處理組。用24孔細胞培養(yǎng)板,每組均設(shè)5復孔,每孔加入1 mL淋巴細胞懸液?？瞻捉M每孔加入 1 mL RPMI-1640完全培養(yǎng)基,陽性組每孔加入1 mL含有左旋咪唑(終濃度為5 μg/mL)的RPMI-1640完全培養(yǎng)基;藍莓花色苷處理組每孔加入1 mL含不同濃度藍莓花色苷(終濃度為4、8、16、32和64 mg/mL)的RPMI-1640完全培養(yǎng)基。37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)48 h后,1 500 r/min 4 ℃離心5 min,收集上清。用ELISA 法檢測藍莓花色苷對淋巴細胞TNF-α、IL-6分泌的影響,參考小鼠細胞因子試劑盒說明書進行操作。

1.2.6 藍莓花色苷對腹腔巨噬細胞分泌細胞因子的影響 用ELISA法檢測,參考Xie等[14]實驗方法,實驗設(shè)空白組、陽性組、藍莓花色苷處理組。用24孔細胞培養(yǎng)板,每組均設(shè)5復孔,每孔加入1 mL腹腔巨噬細胞懸液?？瞻捉M每孔加入 1 mL RPMI-1640完全培養(yǎng)基,陽性組每孔加入1 mL含有左旋咪唑(終濃度為5 μg/mL)的RPMI-1640完全培養(yǎng)基;藍莓花色苷處理組每孔加入1 mL含不同濃度藍莓花色苷(終濃度為4、8、16、32和64 mg/mL)的RPMI-1640完全培養(yǎng)基。37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)24 h后,1500 r/min 4 ℃離心5 min,收集上清。用ELISA法檢測藍莓花色苷對腹腔巨噬細胞IL-4、IL-12分泌的影響,參考小鼠細胞因子試劑盒說明書進行操作。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果與分析

2.1 藍莓花色苷對淋巴細胞增殖的影響

由圖1可知,MTT 檢測結(jié)果顯示,藍莓花色苷各濃度組和陽性組與空白對照組比較,淋巴細胞增殖率均顯著高于空白對照組(p<0.05);藍莓花色苷在4～32 mg/mL濃度范圍內(nèi),淋巴細胞增殖率隨藍莓花色苷濃度的升高而增大,呈良好的劑量-效應關(guān)系,繼續(xù)升高藍莓花色苷濃度至64 mg/mL,淋巴細胞增殖率反而顯著下降(p<0.05);藍莓花色苷各濃度組與陽性組相比,藍莓花色苷為32 mg/mL 濃度組淋巴細胞增殖率無顯著差異(p>0.05),藍莓花色苷其他濃度組淋巴細胞增殖率顯著下降(p<0.05)。

圖1 藍莓花色苷對淋巴細胞增殖的影響Fig.1 The effects of blueberry anthocyanins on proliferation of lymphocytes注:不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05);圖2～圖6同。

2.2 藍莓花色苷對巨噬細胞吞噬功能的影響

由圖2可知,藍莓花色苷各濃度組與陽性組腹腔巨噬細胞吞噬活性值均顯著高于空白對照組(p<0.05);藍莓花色苷在4～32 mg/mL濃度范圍內(nèi),腹腔巨噬細胞的吞噬活性隨藍莓花色苷濃度的升高而升高,呈良好的劑量-效應關(guān)系,繼續(xù)升高藍莓花色苷濃度至64 mg/mL,腹腔巨噬細胞的吞噬活性反而下降;與陽性組相比,藍莓花色苷為8、16、32、64 mg/mL 濃度組腹腔巨噬細胞的吞噬活性無顯著性差異(p>0.05),藍莓花色苷為4 mg/mL 濃度組腹腔巨噬細胞的吞噬活性顯著降低(p<0.05)。

圖2 藍莓花色苷對腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響Fig.2 The effects of blueberry anthocyanins on phagocytosis of macrophages

2.3 藍莓花色苷對淋巴細胞分泌細胞因子的影響

2.3.1 藍莓花色苷對淋巴細胞IL-6分泌的影響 由圖3可知,ELISA檢測結(jié)果顯示,藍莓花色苷各濃度組與陽性組淋巴細胞IL-6分泌量均高于空白對照組(p<0.05);在4～32 mg/mL濃度范圍內(nèi),淋巴細胞IL-6分泌量隨藍莓花色苷濃度的升高而升高,呈良好的劑量-效應關(guān)系,繼續(xù)升高藍莓花色苷濃度至64 mg/mL,淋巴細胞IL-6分泌量反而下降;與陽性組相比,藍莓花色苷為16、32 mg/mL濃度組淋巴細胞IL-6分泌量無顯著差異(p>0.05),藍莓花色苷為4、8、64 mg/mL濃度組淋巴細胞IL-6分泌量顯著降低(p<0.05)。

圖3 藍莓花色苷對淋巴細胞IL-6分泌的影響Fig.3 The effects of blueberry anthocyanins on secretion of IL-6 in lymphocytes

2.3.2 藍莓花色苷對淋巴細胞TNF-α分泌的影響 由圖4可知,ELISA 檢測結(jié)果顯示,藍莓花色苷各濃度組與陽性組淋巴細胞TNF-α分泌量均高于空白對照組(p<0.05);在4～32 mg/mL濃度范圍內(nèi),淋巴細胞TNF-α分泌量隨藍莓花色苷濃度的升高而升高,呈良好的劑量-效應關(guān)系,繼續(xù)升高藍莓花色苷濃度至64 mg/mL,淋巴細胞TNF-α分泌量反而下降;與陽性組相比,藍莓花色苷為32 mg/mL濃度組淋巴細胞TNF-α分泌量顯著升高(p<0.05),藍莓花色苷為16、64 mg/mL濃度組淋巴細胞TNF-α分泌量無顯著差異(p>0.05),藍莓花色苷為4、8 mg/mL濃度組淋巴細胞TNF-α分泌量顯著降低(p<0.05)。

2.4 藍莓花色苷對腹腔巨噬細胞分泌細胞因子的影響

2.4.1 藍莓花色苷對腹腔巨噬細胞IL-4分泌的影響 由圖5可知,ELISA 檢測結(jié)果顯示,藍莓花色苷各濃度組與陽性組腹腔巨噬細胞IL-4分泌量均低于空白對照組(p<0.05);在4～32 mg/mL濃度范圍內(nèi),腹腔巨噬細胞IL-4分泌量隨藍莓花色苷濃度的升高而降低,繼續(xù)升高藍莓花色苷濃度至64 mg/mL,腹腔巨噬細胞IL-4分泌量反而顯著(p<0.05)升高;與陽性組相比,藍莓花色苷為32 mg/mL 濃度組腹腔巨噬細胞IL-4分泌量無顯著差異(p>0.05),其余各濃度組腹腔巨噬細胞IL-4分泌量均顯著升高(p<0.05)。

圖5 藍莓花色苷對巨噬細胞IL-4分泌的影響Fig.5 The effects of blueberry anthocyanins on secretion of IL-4 in macrophages

2.4.2 藍莓花色苷對腹腔巨噬細胞IL-12分泌的影響 由圖6可知,ELISA檢測結(jié)果顯示,藍莓花色苷各濃度組與陽性組腹腔巨噬細胞IL-12分泌量均高于空白對照組(p<0.05);在4～32 mg/mL濃度范圍內(nèi),腹腔巨噬細胞IL-12分泌量隨藍莓花色苷濃度的升高而升高,呈良好的劑量-效應關(guān)系,繼續(xù)升高藍莓花色苷濃度至64 mg/mL,腹腔巨噬細胞IL-12分泌量反而下降;與陽性組相比,藍莓花色苷為16、32 mg/mL 濃度組腹腔巨噬細胞IL-12分泌量無顯著差異(p>0.05),其余各濃度組腹腔巨噬細胞IL-12分泌量顯著降低(p<0.05)。

圖6 藍莓花色苷對巨噬細胞IL-12分泌的影響Fig.6 The effects of blueberry anthocyanins on secretion of IL-12 in macrophages

3 討論

3.1 藍莓花色苷對淋巴細胞及其相關(guān)因子的作用

脾臟占全身淋巴組織總量的25%,正常情況下,脾臟作為體內(nèi)最大的外周免疫器官,淋巴細胞受抗原激活即分化增殖,吞噬消除衰老紅細胞、細菌及異物,產(chǎn)生大量抗體,參與機體免疫反應[15]。淋巴細胞由淋巴器官產(chǎn)生,是機體免疫應答功能的重要細胞成分[16]。杜聯(lián)峰等[17]利用西紅花苷研究其對小鼠脾淋巴細胞增殖,發(fā)現(xiàn)西紅花苷具有刺激小鼠脾淋巴細胞增殖的作用。高笑笑等[18]采用MTT 法檢測雪靈芝粗多糖對體外培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細胞增殖的影響。結(jié)果顯示,雪靈芝粗多糖處理組對小鼠脾淋巴細胞的增殖具有體外激活作用。活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍紫結(jié)晶物formazan,并沉積在細胞中,而死細胞無此功能[19],因此,本實驗以左旋咪唑為陽性對照,采用MTT法觀察藍莓花色苷對體外培養(yǎng)淋巴細胞增殖功能的影響,結(jié)果顯示,藍莓花色苷與左旋咪唑?qū)π∈笃⒘馨图毎鲋尘憩F(xiàn)出明顯的促進作用。

細胞因子是參與機體免疫調(diào)節(jié)的重要介質(zhì),TNF-α是炎癥反應過程中出現(xiàn)最早、最重要的炎性介質(zhì),能調(diào)節(jié)其它組織代謝活性并促使其它細胞因子的合成和釋放。IL-6由巨噬細胞、Th2細胞、B淋巴細胞及內(nèi)皮細胞等多種細胞產(chǎn)生的一種多效應細胞因子,能夠刺激B細胞增殖,分泌抗體,刺激T細胞增殖及CTL活化,增強自然殺傷細胞(NK細胞)及T細胞的抗腫瘤活性,在細胞免疫應答和造血調(diào)節(jié)中以自分泌或旁分泌方式發(fā)揮重要作用[20]。Xie等[21]利用藍莓花色苷對巨噬細胞抗炎作用的研究中,發(fā)現(xiàn)藍莓花色苷能降低小鼠血清中TNF-α和IL-6含量,降低腹腔巨噬細胞的TNF-α、IL-6 mRNA的表達;抑制RAW264.7巨噬細胞TNF-α、IL-6 mRNA的表達,其機制可能是藍莓花色苷通過抑制RAW 264.7 細胞的NF-κB、MAPK p38和JNK信號通路活化有關(guān)。劉英姿等[22]利用碎米花杜鵑葉中分離得到的化合物原花青素A-1研究其免疫增強的作用機制。結(jié)果顯示,原花青素A-1各濃度在體外能增加Con A刺激的脾細胞分泌的輔助性T細胞亞群(Th1)細胞因子(IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α)的分泌量和Con A刺激的脾細胞分泌的抑制Th2細胞因子(IL-4、IL-10)的分泌量。王志宏等[23]采用MTT法和ELISA技術(shù),通過考察不同純度的杜仲黃酮對淋巴細胞增殖及細胞因子IL-2和IFN-γ誘生作用的影響。結(jié)果顯示,杜仲黃酮粗品及槲皮素均對經(jīng)Con A或LPS刺激下的淋巴細胞的增殖和細胞因子IL-2與IFN-γ的分泌有協(xié)同作用。在本實驗中,藍莓花色苷可使淋巴細胞培養(yǎng)上清中 IL-6、TNF-α水平呈濃度依賴性升高,并提示藍莓花色苷可通過刺激淋巴細胞IL-6、TNF-α分泌來提高淋巴細胞的免疫調(diào)節(jié)功能。同時藍莓花色苷不僅可直接性激活腹腔巨噬細胞,并可通過上調(diào) IL-6、TNF-α水平間接性地增強腹腔巨噬細胞吞噬、殺傷功能。本實驗所利用的藍莓花色苷與原花青素、杜仲黃酮同屬黃酮類物質(zhì),且同劉英姿、王志宏等利用原花青素、杜仲黃酮對小鼠免疫功能影響的研究結(jié)果是一致的。

3.2 藍莓花色苷對腹腔巨噬細胞吞噬能力及其相關(guān)因子的作用

吞噬作用在巨噬細胞中是一個受到高度調(diào)節(jié)的功能,靜止、循環(huán)的巨噬細胞僅有最低限度的吞噬能力,接觸其他信號,如抗原和細胞因子等可激活巨噬細胞,并使巨噬細胞功能增強[24]。Mantovani等[25]認為巨噬細胞不但能夠通過分泌促炎性細胞因子和趨化因子,介入免疫應答,發(fā)揮免疫監(jiān)視功能,還可通過抑制細胞因子IL-10/TGF-B等下調(diào)免疫應答,在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。李佳等[26]等利用原花青素與熟地對小鼠免疫功能的影響,發(fā)現(xiàn)原花青素與熟地能夠提高免疫器官的增長指數(shù)、增強巨噬細胞吞噬功能以及DNFB所致遲發(fā)型超敏反應的能力,兩種藥物配合使用能顯著調(diào)節(jié)小鼠免疫功能。本實驗以左旋咪唑為陽性對照,采用中性紅吞噬實驗檢測腹腔巨噬細胞吞噬能力,結(jié)果顯示,藍莓花色苷與左旋咪唑?qū)Ω骨痪奘杉毎行约t吞噬活性顯著或極顯著提高,并提示藍莓花色苷對體外培養(yǎng)的小鼠固有性免疫細胞功能均具有明顯的促進作用。花色苷是花青素與糖以糖苷鍵結(jié)合而成的一類化合物,植物中花青素多以花色苷的形式存在。本實驗與李佳等[26]利用原花青素與熟地對小鼠免疫功能影響的研究結(jié)果是一致的。

IL-4對于B細胞、T細胞、肥大細胞、巨噬細胞都有免疫調(diào)節(jié)作用,具有促進巨噬細胞提呈抗原和殺傷腫瘤細胞的功能,可能與調(diào)節(jié)MHC Ⅱ類抗原和FcR表達有關(guān)。IL-4是小鼠巨噬細胞趨化因子,并促進IL-1ra產(chǎn)生,但抑制單核細胞IL-1、TNF和IL-6的產(chǎn)生。IL-12主要由B淋巴細胞產(chǎn)生,IL-12通過誘導產(chǎn)生的IFN-γ激活巨噬細胞,誘導其TNF-α的分泌。IL-12可誘導Th1亞群的形成,此作用可能通過兩種途徑,一是IL-12直接作用于Th1亞群;二是IL-12刺激T細胞、NK細胞產(chǎn)生IFN-γ誘導Th1亞群形成。王曉利等[27]為探討甘草的3種主要成分甘草甜素、甘草多糖和光甘草定對小鼠腹腔巨噬細胞的毒性與免疫功能的調(diào)節(jié)作用,將3種藥物分別與巨噬細胞作用12、24和36 h后,用ELISA試劑盒檢測3種藥物對巨噬細胞分泌細胞因子的影響。結(jié)果顯示,所有實驗濃度的3種藥物均能顯著增強巨噬細胞分泌IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α的能力(p<0.01),高劑量抑制IL-4、IL-10和TGF-β的分泌(p<0.01),而低劑量沒有明顯變化。在本實驗中,藍莓花色苷可使小鼠腹腔巨噬細胞培養(yǎng)上清中IL-12水平呈濃度依賴性升高,并提示藍莓花色苷可通過刺激小鼠腹腔巨噬細胞IL-12分泌來提高巨噬細胞的免疫調(diào)節(jié)功能。4、8、16、32 mg/mL的藍莓花色苷抑制小鼠腹腔巨噬細胞分泌IL-4,濃度為64 mg/mL開始促進IL-4分泌。提示藍莓花色苷呈劑量依賴性地分泌促炎性細胞因子以及降低抑炎性細胞因子的分泌,來發(fā)揮腹腔巨噬細胞的免疫功能。本實驗所利用的藍莓花色苷與光甘草定同屬黃酮類物質(zhì),且同王曉利等[27]利用甘草的3種主要成分甘草甜素、甘草多糖和光甘草定對小鼠腹腔巨噬細胞的免疫功能調(diào)節(jié)作用的研究結(jié)果是一致的。

4 結(jié)論

藍莓花色苷可通過促進脾淋巴細胞增殖和細胞因子IL-6、TNF-α的分泌,來提高淋巴細胞免疫調(diào)節(jié)活性;通過促進巨噬細胞吞噬功能和細胞因子IL-12的分泌以及降低IL-4的分泌,來提高巨噬細胞的免疫調(diào)節(jié)活性,從而提高機體免疫功能。