廖 浩

(廣西-東盟食品藥品安全檢驗(yàn)檢測中心,廣西南寧 530022)

苯并[a]芘是由一個(gè)苯環(huán)和一個(gè)芘分子稠合而成的多環(huán)芳烴類化合物[1],在環(huán)境中廣泛存在,在化石能源不完全燃燒以及食品在熏制、烘烤和煎炸過程中產(chǎn)生,特別是發(fā)生焦糊現(xiàn)象時(shí)[2]。苯并[a]芘是公認(rèn)的高活性強(qiáng)致癌有機(jī)化合物[3-4],因此,各國先后對食品中最大殘留限量作出了規(guī)定。我國GB 2762-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》中規(guī)定:谷物及其制品、肉及肉制品、水產(chǎn)動(dòng)物及其制品為5.0 μg/kg,油脂及其制品為10 μg/kg;歐盟EC Regulation 835/2011規(guī)定為2 μg/kg。目前，食品中苯并[a]芘的檢測方法主要有氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[5-6]、液相色譜熒光檢測器法(LC-FLD)[7-9]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)[10-11],其中GC-MS法由于靈敏度不高，且熱穩(wěn)定性不好[12],使用受到了一定限制;LC-FLD法靈敏度高,重現(xiàn)性較好,在現(xiàn)行有效的國標(biāo)中成為主要的檢測方法[6,9],但是也存在定性能力不強(qiáng)的問題;而LC-MS/MS法則能夠同時(shí)解決靈敏度與定性能力問題。在樣品前處理中,目前多采用固相萃取法[7-8]、凝膠色譜法[13-14]、分子印跡柱法[11,15]進(jìn)行凈化。EMR-Lipid固相萃取柱是一種新型的脂質(zhì)增強(qiáng)型凈化柱,選擇性強(qiáng),主要吸附油脂中C5及以上的碳鏈,同時(shí)不會(huì)吸附其他弱極性的分析物,目前在苯并[a]芘的測定中沒有文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究采用EMR-Lipid固相萃取柱對基質(zhì)復(fù)雜的煎炸過程用油進(jìn)行凈化,有效消除了基質(zhì)干擾,再使用超高效液相色譜-大氣壓化學(xué)電離-三重四極桿質(zhì)譜儀(UPLC-APCI-MS/MS)進(jìn)行測定,以穩(wěn)定同位素稀釋法定量,方法準(zhǔn)確、快速、靈敏度高,有利于煎炸過程用油中苯并[a]芘的定性定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

煎炸過程用油 抽樣自廣西本地餐飲企業(yè),共20批;大豆油 中國檢科院2017年ACAS-PT459苯并[a]芘能力驗(yàn)證樣品;空白花生油 萊陽魯花濃香花生油有限公司;苯并[a]芘對照品 99.0%,Dr. Ehrenstorfer Gmbh;苯并[a]芘-d12對照品 97.5%,Dr. Ehrenstorfer Gmbh;乙腈 HPLC級(jí),德國默克股份兩合公司;EMR-Lipid固相萃取柱 600 mg 6 mL,美國Agilent公司。

ExionLC TRIPLE QUAD 6500+超高效液相色譜聯(lián)用三重四極桿質(zhì)譜儀 由Analyst 1.6.3軟件控制,美國AB SCIEX公司;RRHD SB-C18液相色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm) 美國Agilent公司;XS205DU電子天平 瑞士梅特勒-托利多公司;S300H超聲波清洗機(jī) 德國Elma公司;KS 260搖床 德國IKA公司;Multifuge X3R冷凍離心機(jī) 美國Thermo公司;Gradient A10 Milli-Q超純水機(jī) 法國Millipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 采用APCI離子源分析時(shí),樣品需要在流速大于0.5 mL/min的流動(dòng)相下才能充分離子化,無法單獨(dú)采用微量進(jìn)樣泵注入標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行優(yōu)化。因此,需將液相色譜泵與微量進(jìn)樣泵通過三通連接混合后注入離子源中。將液相色譜流速設(shè)為0.7 mL/min,流動(dòng)相為90%乙腈。同時(shí)微量進(jìn)樣泵以20 μL/min的流速，注入1 μg/mL的苯并[a]芘、苯并[a]芘-d12標(biāo)準(zhǔn)溶液。通過母離子掃描,可在正離子模式下見到[M+H]+峰,由于結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,在加大了碰撞能量后,得到了253.1>250.1、253.1>248.1、253.1>224.1、253.1>226.2及265.2>259.3、265.2>260.3、265.2>235.1等碎片離子信息。通過優(yōu)化去簇電壓、碰撞能量、入口電壓、出口電壓等參數(shù),使得分子離子信號(hào)達(dá)到最佳。

1.2.2 液相色譜分離條件的優(yōu)化 色譜柱比較了SB-AQ、Eclipse Plus C18、SB-C18(規(guī)格均為2.1 mm×100 mm,1.8 μm)。溶劑效應(yīng)方面通過進(jìn)樣5、10、15 μL進(jìn)行比較。流動(dòng)相選擇方面參考了液相色譜熒光檢測器的方法條件[9],分別采用了甲醇-水、乙腈-水作為流動(dòng)相進(jìn)行選擇。結(jié)合全掃描數(shù)據(jù),對梯度洗脫條件進(jìn)行了優(yōu)化,使得樣品峰與雜質(zhì)峰有較好的分離。流速為0.7 mL/min,流動(dòng)相梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制 精密稱取苯并[a]芘對照品、苯并[a]芘-D12對照品各10 mg,苯并[a]芘轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中,苯并[a]芘-D12轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,加入乙腈定容至刻度,搖勻。將上述溶液分別轉(zhuǎn)移至棕色儲(chǔ)液瓶中,-18 ℃避光保存,得到苯并[a]芘儲(chǔ)備液0.4 mg/mL,苯并[a]芘-d12內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液0.1 mg/mL。以乙腈為溶劑,將苯并[a]芘儲(chǔ)備液逐步稀釋至200、20 ng/mL,苯并[a]芘-d12內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液稀釋至1 μg/mL,分別精密吸取一定量的苯并[a]芘標(biāo)準(zhǔn)溶液至10 mL容量瓶中,同時(shí)加入1 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液各50 μL,以80%乙腈定容至刻度,得到質(zhì)量濃度為0.1、0.5、1、5、10、20 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液,內(nèi)標(biāo)濃度為5 ng/mL。

1.2.4 樣品前處理 精密稱取1 g煎炸過程用油,加入乙腈4、8、12 mL進(jìn)行比較,每4 mL乙腈中加入1 μg/mL苯并[a]芘-d12內(nèi)標(biāo)溶液25 μL,超聲處理5 min,振搖提取15 min,4 ℃下4500 r/min離心10 min,分別吸取上清液4 mL加水1 mL混勻,過EMR-Lipid固相萃取柱凈化,同時(shí)取未經(jīng)凈化的提取液進(jìn)行比較,過0.22 μm尼龍濾膜,供LC-MS/MS檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

由Analyst 1.6.3軟件采集到的數(shù)據(jù)，導(dǎo)入MultiQuant 3.0.2軟件中進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,采用穩(wěn)定同位素稀釋法定量。以定量離子對與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值(y)對系列標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(x,ng/mL)進(jìn)行回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

苯并[a]芘屬于弱極性化合物,在電噴霧離子源(ESI)中難以電離,可在大氣壓光化學(xué)離子源(APPI)[16]或大氣壓化學(xué)離子源(APCI)[11]中電離。雖然APPI源靈敏度高,但是應(yīng)用范圍窄,基質(zhì)效應(yīng)明顯[17];或是裝置復(fù)雜需要在柱后輸送甲苯等[16],一般不作為質(zhì)譜儀標(biāo)配的離子源,因此本文采用了標(biāo)配的APCI離子源。為追究較高的靈敏度,本研究除采用了TRIPLE QUAD 6500+三重四極桿質(zhì)譜儀外,在優(yōu)化了1.2.3中較為常用的質(zhì)譜條件的基礎(chǔ)上,對不常調(diào)整或采用經(jīng)驗(yàn)值的放電電流、噴針長度、陶瓷噴頭高度等參數(shù)均進(jìn)行了反復(fù)優(yōu)化,通過調(diào)整,得到了最佳的響應(yīng);這部分參數(shù)不僅與化合物相關(guān)外,還與流動(dòng)相的比例、流速等相關(guān),且相互影響。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)為:大氣壓化學(xué)電離源(APCI),多反應(yīng)監(jiān)測正離子模式(MRM+);氣簾氣(CUR):30 psi;碰撞氣(CAD):11 psi;放電電流(NC):2;離子源溫度(TEM):550 ℃;霧化氣(GS1):40 psi;噴針長度:1 mm;陶瓷噴頭高度:7.0 mm;去簇電壓(DP):90 V;入口電壓(EP):9 V;碰撞室出口電壓(CXP):20 V;其余參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass conditions

2.2 液相色譜條件的優(yōu)化

因儀器耐壓高,從提高分離效率和響應(yīng)方面考慮,選用了較細(xì)長的亞二微米色譜柱。由于苯并[a]芘極性弱,主要考慮采用C18色譜柱;通過實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)在SB-AQ、Eclipse Plus C18、SB-C18上均能較好分離,在SB-AQ上出峰較快,在SB-C18上響應(yīng)較好,最后采用RRHD SB-C182.1 mm×100 mm,1.8 μm液相色譜柱進(jìn)行分離。通過進(jìn)樣5、10、15 μL,發(fā)現(xiàn)無明顯溶劑效應(yīng)。在儀器靈敏度滿足的情況下，考慮減少儀器污染的因素,采用5 μL的進(jìn)樣量。流動(dòng)相選擇方面,考慮到APCI源離子化的特點(diǎn),流動(dòng)相中未加入酸或銨鹽,發(fā)現(xiàn)苯并[a]芘在乙腈中霧化效果較好,響應(yīng)較甲醇略高。優(yōu)化后的MRM色譜圖見圖1。

圖1 煎炸過程用油樣品中苯并[a] 芘MRM色譜圖(1 μg/kg)Fig.1 MRM chroma chromatograms of benzo[a] pyrene in a deep frying oil sample(1 μg/kg)

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,苯并[a]芘在0.1～20 ng/mL內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系,回歸方程為y=0.42179x+0.02229，決定系數(shù)R2=0.9997,線性關(guān)系良好。結(jié)果見圖2。

圖2 苯并[a]芘標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of benzo[a]pyrene

2.4 樣品前處理方法的優(yōu)化

由于苯并[a]芘的極性弱,目前多用正己烷將樣品完全溶解,為后續(xù)帶來了大量的油脂干擾。為去除油脂,一般多采用凝膠色譜法、固相萃取法、分子印跡柱法進(jìn)行凈化。凝膠色譜法消耗大量乙酸乙酯、正己烷等有機(jī)溶劑,前處理時(shí)間長,需通過加標(biāo)實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行優(yōu)化。固相萃取法則主要采用弗羅里硅藻土和氧化鋁柱,其中弗羅里硅藻土小柱對大量的油脂凈化效率較低;氧化鋁則需用到22 g的大體積凈化柱,氧化鋁的活性對凈化效果影響較大,調(diào)整活性繁瑣需要一定經(jīng)驗(yàn)。在采用凝膠色譜或氧化鋁凈化時(shí),需對大體積的有機(jī)溶劑進(jìn)行濃縮,對溶劑與旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的痕量污染較敏感。分子印跡柱法較為穩(wěn)定,絕對回收率高,基質(zhì)效應(yīng)不明顯。以上方法凈化后需進(jìn)行濃縮及溶劑置換,操作較為繁瑣。本文選擇由乙腈作為萃取溶劑,溶劑中的油脂含量較少,同時(shí)采用脂質(zhì)增強(qiáng)型EMR-Lipid固相萃取小柱進(jìn)行凈化。EMR-Lipid在50～80%的乙腈中凈化效率高,可根據(jù)液相條件靈活調(diào)整比例,避免溶劑效應(yīng)。該固相萃取小柱為自浸潤型,無傳統(tǒng)固相萃取小柱活化、淋洗、洗脫的過程,操作簡便。同時(shí)比QuEChERS EMR-Lipid法[18]減少了反萃取步驟。

由于本研究采用同位素內(nèi)標(biāo)稀釋法進(jìn)行定量,通過比較苯并[a]芘-d12同位素內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)對萃取體積進(jìn)行比較選擇,發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用4 mL乙腈提取時(shí),響應(yīng)較低,而采用8、12 mL乙腈提取時(shí),差異較小,為保證檢出限,采用8 mL乙腈進(jìn)行萃取。為驗(yàn)證凈化效果,分別取同一份過柱前與過柱后樣品溶液對比;以及凈化后的基質(zhì)提取液與溶劑分別配制標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行對比分析,結(jié)果見表3。通過對比內(nèi)標(biāo)峰的響應(yīng)值,發(fā)現(xiàn)樣品過柱前的響應(yīng)為過柱后的72.4%,而基質(zhì)加標(biāo)為溶劑標(biāo)準(zhǔn)的97.2%。說明樣品基質(zhì)有較大的抑制效應(yīng),而EMR-Lipid固相萃取小柱凈化充分。為簡化前處理,本研究采用8 mL乙腈1次萃取不進(jìn)行濃縮的方法,并采用苯并[a]芘-d12作為同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量。

表3 EMR-Lipid固相萃取小柱凈化效果Table 3 Purification effect of EMR-Lipid solid phase extraction column

2.5 檢出限與定量限

本次實(shí)驗(yàn)樣品均檢出苯并[a]芘,因此分別采用了空白花生油每1 g添加1 ng的苯并[a]芘,樣品則每1 g添加1 ng的苯并[a]芘-d12內(nèi)標(biāo)按1.2.4進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以兩對分子離子信噪比均大于等于3時(shí)對應(yīng)的樣品含量作為檢出限(LOD),信噪比均大于等于10時(shí)對應(yīng)的樣品含量作為定量限(LOQ),測得兩種不同基質(zhì)中檢出限均為0.2 μg/kg,定量限為0.6 μg/kg。本法靈敏度高,測定范圍廣,滿足了GB 2762-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》中對苯并[a]芘的要求。

2.6 樣品的加標(biāo)回收與精密度

取煎炸過程用油樣品1 g,分別添加20 ng/mL苯并[a]芘標(biāo)準(zhǔn)溶液50、250 μL,200 ng/mL苯并[a]芘標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL,內(nèi)標(biāo)溶液40 μL,混勻,避光靜置24 h,其余步驟按1.2.4節(jié)進(jìn)行,結(jié)果見表4。加標(biāo)回收率在94.0%～98.7%之間,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.1%～5.6%之間。

表4 不同添加水平下苯并[a]芘的回收率與精密度(n=6)Table 4 Recoveries and RSD of benzo[a]pyrene at different spiked levels(n=6)

2.7 實(shí)際樣品的測定

取20批本地不同的餐飲企業(yè)煎炸過程用油,按1.2.4測定。測得20批樣品中均檢出苯并[a]芘,含量在1.76～6.81 μg/kg之間。同時(shí)采用GB 5009.27-2016分子印跡柱凈化液相色譜熒光檢測器法對樣品進(jìn)行測定,本法較國標(biāo)方法偏差在-1.82%～3.46%之間。取ACAS-PT459能力驗(yàn)證(Proficiency testing)樣品測試,能力驗(yàn)證是利用實(shí)驗(yàn)室間比對來判定實(shí)驗(yàn)室和檢查機(jī)構(gòu)能力的活動(dòng),也是認(rèn)可機(jī)構(gòu)加入和維持國際相互承認(rèn)協(xié)議(MRA)的必要條件之一。結(jié)果中的Z值是實(shí)驗(yàn)室測試值與所有參加比對的實(shí)驗(yàn)室得到的中位值之間的偏差。結(jié)果分為:滿意、可疑、不滿意,當(dāng)Z的絕對值小于等于2時(shí),結(jié)果為滿意。測得樣品Ⅰ為11.6 μg/kg,Z值為-0.1;樣品Ⅲ為7.45 μg/kg,Z值為-0.3,結(jié)果滿意。

3 結(jié)論

本文建立了以乙腈提取,EMR-Lipid固相萃取小柱凈化作為前處理方法,并運(yùn)用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定煎炸過程用油苯并[a]芘的方法。該方法的線性范圍為1～200 μg/kg，決定系數(shù)R2=0.9997，檢出限為0.2 μg/kg，定量限為0.6 μg/kg。平均加標(biāo)回收率為94.0%～98.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%～5.6%。20批煎炸用油樣品中，苯并[a]芘含量為1.76～6.81 μg/kg。該方法前處理簡單、基質(zhì)干擾少、定性定量準(zhǔn)確、靈敏度高，適合大樣品量的實(shí)驗(yàn)室對煎炸過程用油中苯并[a]芘的檢測。