羅幸玲,鄭 涵,洪佳佳,王 梅,周之榮

(廣東藥科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,廣東廣州 510310)

近年來(lái),塑料由于具有良好的性能和低成本被廣泛用作食品包裝材料,但其使用安全性問(wèn)題也成為研究熱點(diǎn)[1-2]。苯酚作為塑料制作的化工原料之一,具有高毒性,因此苯酚的浸出所帶來(lái)的安全性問(wèn)題不容忽視[3-4]。食品包裝材料的原材料種類多,基質(zhì)復(fù)雜,且苯酚的浸出量常在痕量水平,這為苯酚的測(cè)定帶來(lái)了一定的困難。因此,盡管現(xiàn)有儀器分析方法具有較高的靈敏度,在上機(jī)檢測(cè)前仍需對(duì)樣品進(jìn)行凈化、分離、富集處理。

快速協(xié)同濁點(diǎn)萃取(Rapid synergistic cloud point extraction,RS-CPE)是在傳統(tǒng)濁點(diǎn)萃取基礎(chǔ)上,通過(guò)加入濁點(diǎn)的誘導(dǎo)協(xié)同劑,室溫下即可完成萃取的一種快速有效分離富集方法。該方法既保留了傳統(tǒng)濁點(diǎn)萃取成本低、綠色環(huán)保、萃取效果好、易與多種分析儀器聯(lián)用等優(yōu)點(diǎn),又省去了耗時(shí)較長(zhǎng)的水浴過(guò)程,前處理更為簡(jiǎn)單、省時(shí)。誘導(dǎo)協(xié)同劑還可輔助表面活性劑萃取目標(biāo)物,提高萃取率。RS-CPE最早由Wen在2011年提出,與分光光度法聯(lián)用測(cè)定食品和水樣中痕量銅[5]。目前,RS-CPE已與原子吸收光譜、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法等結(jié)合用于各種金屬離子的測(cè)定[6-9],尚未見(jiàn)RS-CPE應(yīng)用于苯酚分離富集的報(bào)道。熒光分光光度法作為測(cè)定苯酚常用的分析手段,具有儀器操作簡(jiǎn)單、運(yùn)行成本低、抗干擾能力強(qiáng)、靈敏度高(通常比紫外分光光度法高2～3個(gè)數(shù)量級(jí))等優(yōu)點(diǎn)。且經(jīng)RS-CPE所得的富集相可直接轉(zhuǎn)移至比色皿中進(jìn)行檢測(cè),省去了稀釋過(guò)濾步驟,進(jìn)一步簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作。因此,熒光分光光度法與RS-CPE聯(lián)用用于苯酚測(cè)定是較優(yōu)的選擇。然而目前已報(bào)道的RS-CPE法中,選用的表面活性劑為Triton X系列,含有苯環(huán)結(jié)構(gòu),會(huì)對(duì)用熒光分光光度法測(cè)定苯酚帶來(lái)較大的熒光干擾信號(hào)。在現(xiàn)有的CPE與熒光分光光度法聯(lián)用的文獻(xiàn)報(bào)道中[10],通過(guò)扣除Triton X-100空白值對(duì)測(cè)量值進(jìn)行校正,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)誤差較大,特別在苯酚含量低時(shí),嚴(yán)重影響方法靈敏度和準(zhǔn)確度。因此,亟需尋找一種對(duì)苯酚測(cè)定無(wú)干擾且萃取效果好的表面活性劑。

聚乙二醇 6000(PEG 6000)作為一種直鏈型的非離子型表面活性劑,具有無(wú)毒、來(lái)源廣、成本低、無(wú)苯環(huán)結(jié)構(gòu)、不產(chǎn)生熒光干擾信號(hào)、易降解、對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn),現(xiàn)已被逐漸應(yīng)用于濁點(diǎn)萃取中[11]。Samaddar選取PEG 6000作萃取劑,用于汞的形態(tài)分析[12];Ulusoy使用PEG 6000萃取食品中的維生素B9,獲得良好效果[13]。但是由于PEG 6000的濁點(diǎn)溫度高(100 ℃),實(shí)驗(yàn)中常需要通過(guò)大量電解質(zhì)的使用和耗時(shí)較長(zhǎng)的高溫水浴條件才能產(chǎn)生濁點(diǎn)現(xiàn)象。然而溫度是影響熒光強(qiáng)度的一個(gè)重要因素,當(dāng)隨著溫度的上升,分子的內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換作用以及分子間的碰撞幾率增加,熒光強(qiáng)度減弱。而且過(guò)高的水浴溫度,也易導(dǎo)致半揮發(fā)性苯酚的損失,影響結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。目前,PEG 6000尚未應(yīng)用于苯酚的預(yù)富集。

本文選用直鏈型的非離子表面活性劑PEG 6000為萃取劑,正辛醇為濁點(diǎn)的誘導(dǎo)協(xié)同劑,以苯酚的熒光強(qiáng)度為檢驗(yàn)指標(biāo),考察了聚乙二醇 6000、無(wú)水硫酸鈉和正辛醇的用量、溶液pH等因素對(duì)其的影響,建立了RS-CPE-熒光分光光度法聯(lián)用測(cè)定5種食品塑料包裝材料中浸出苯酚的分析方法,為食品塑料包裝材料中苯酚的測(cè)定提供一種簡(jiǎn)單、快速、基質(zhì)干擾少、靈敏度高、廉價(jià)的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苯酚標(biāo)準(zhǔn)品 純度大于99%,德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司;PEG 6000 美國(guó)Sigma公司;5種食品塑料瓶 從本地超市購(gòu)買5種聚對(duì)苯二甲酸類(PET)不同牌子的飲料瓶,用自來(lái)水和超純水進(jìn)行清洗,自然干燥,備用;實(shí)驗(yàn)試劑 均為分析純及以上;實(shí)驗(yàn)用水 為超純水(電阻率18.2 mΩ·cm);實(shí)驗(yàn)所用器皿 均用10%(v/v)硝酸和10%(v/v)乙醇的溶液浸泡過(guò)夜,再用自來(lái)水和純水沖洗干凈,并晾干后使用。

F-2500熒光分光光度計(jì) 日本日立高新技術(shù)公司;TG12Y臺(tái)式加熱離心機(jī) 湖南湘立科學(xué)儀器有限公司;PHS-3C精密級(jí)數(shù)字式酸度計(jì) 上海虹益儀器儀表有限公司;QB-228臺(tái)式搖勻機(jī) 海門Kylin-bell實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司;CPA225D型十萬(wàn)分之一電子天平 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;Synergy超純水系統(tǒng) 默克密理博公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 苯酚檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 移取一定量的苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液,用純甲醇稀釋定容后,用1 cm石英比色皿裝待測(cè)溶液,并放入熒光分光光度計(jì),激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm,光電倍增管負(fù)高壓400 V,掃描速度1500 nm/min,固定激發(fā)波長(zhǎng)為275 nm,在波長(zhǎng)為280～400 nm范圍內(nèi)掃描，獲得發(fā)射光譜;固定發(fā)射波長(zhǎng)為300 nm,在波長(zhǎng)為240～290 nm范圍內(nèi)掃描,獲得激發(fā)光譜。光譜圖中最大熒光強(qiáng)度對(duì)應(yīng)的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)選作苯酚的檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.2.2 樣品預(yù)處理 參照相關(guān)文獻(xiàn)[14-15],在已洗凈干燥的塑料瓶中注入超純水,在60 ℃恒溫水浴箱中水浴2 h,獲得待檢樣品的浸泡液。

1.2.3 RS-CPE和熒光分光光度計(jì)檢測(cè)條件 取25.0 μL 1.00 mg/mL的苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液于50 mL離心管中,依次加入8.0 mL 0.2 g/mL PEG 6000,3.0 g無(wú)水硫酸鈉,5.0 mL正辛醇,2.0 mL pH6.0檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液,用超純水定容。充分振蕩混勻后,3500 r/min離心3 min。分相后,直接轉(zhuǎn)移富集相至1 cm石英比色皿中,在激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā)射波長(zhǎng)(λex/λem)=275/300 nm條件下測(cè)定其熒光強(qiáng)度。

1.2.4 RS-CPE條件的單因素實(shí)驗(yàn) 在λex/λem=275/300 nm的最佳檢測(cè)波長(zhǎng)條件下,固定其他條件不變(溶液pH6.0,8.0 mL 0.2 g/mL PEG 6000,5.0 mL正辛醇,3.0 g無(wú)水硫酸鈉),采用單因素實(shí)驗(yàn)法分別考察了pH(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)、0.2 g/mL PEG 6000添加量(5、6、7、8、9 mL)、正辛醇添加量(4、5、6、7、8 mL)、無(wú)水硫酸鈉添加量(0、1、2、3、4 g)對(duì)苯酚熒光強(qiáng)度的影響,每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 方法的分析特征實(shí)驗(yàn) 分別加入1、2.5、5、10、25、50、75、80 μL 1.00 mg/mL的苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液于50 mL離心管中,用1.2.3的條件進(jìn)行萃取和檢測(cè)。以苯酚的質(zhì)量濃度(ρ,μg/mL)為橫坐標(biāo),熒光強(qiáng)度(F)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,獲得方法的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。對(duì)10份苯酚空白溶液按照1.2.3的條件進(jìn)行萃取測(cè)定,計(jì)算測(cè)定值的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差(s)與標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率(k)的比值(3s/k),獲得方法的檢出限(LOD)。對(duì)苯酚濃度為0.5 μg/mL的溶液用1.2.3的條件平行萃取測(cè)定8次,獲得方法的精密度,用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)表示。

1.2.6 共存離子的干擾實(shí)驗(yàn) 按照1.2.3的實(shí)驗(yàn)條件,在此基礎(chǔ)上分別加入一系列濃度的共存離子,將系列濃度所得的苯酚熒光強(qiáng)度值與不添加干擾離子的熒光強(qiáng)度值進(jìn)行對(duì)比,若測(cè)定值間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在±5%范圍內(nèi),則定義為不會(huì)干擾苯酚的測(cè)定。而此濃度與0.5 μg/mL苯酚的比值,則為其濃度倍數(shù)關(guān)系。

1.2.7 樣品分析和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn) 取1.2.2中的樣品浸泡液25.0 mL于50 mL離心管中，用1.2.3的條件進(jìn)行萃取檢測(cè)。同時(shí),向樣品中分別加入兩個(gè)濃度(0.02、0.20 μg/mL)的苯酚標(biāo)液,按照1.2.3實(shí)驗(yàn)條件做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。

1.2.8 分布系數(shù)的計(jì)算 HA表示平衡溶液中某化合物的分子形式,A-表示平衡溶液中該化合物的一元離子形式。對(duì)于一元弱酸而言,在溶液中主要存在HA和A-兩種形式,故其分子形式的分布系數(shù)δ(HA)=[H+]/{[H+]+Ka},其中[H+]=10-pH;Ka=10-pKa;離子形式的分布系數(shù)δ(A-)=Ka/{[H+]+Ka}=1-δ(HA)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2003對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以測(cè)定平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯酚檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

激發(fā)光譜和發(fā)射光譜是熒光物質(zhì)的特征光譜,而最佳激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)是熒光強(qiáng)度最大時(shí)的波長(zhǎng),可作為定性和定量分析的依據(jù),也能夠有效提高檢測(cè)靈敏度和選擇性。通過(guò)掃描苯酚溶液的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜,確定檢測(cè)的最佳激發(fā)波長(zhǎng)為275 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為300 nm,結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 苯酚光譜圖 Fig.1 Fluorescence spectra of phenol

2.2 pH對(duì)苯酚熒光強(qiáng)度的影響

苯酚的熒光強(qiáng)度隨著pH增大，先逐漸升高后呈下降趨勢(shì)(見(jiàn)圖2)。苯酚在溶液中主要以C6H5OH(HA)和C6H5O-(A-)兩種形態(tài)存在。據(jù)報(bào)道,苯酚以離子狀態(tài)存在時(shí)不產(chǎn)生熒光,只有中性形式才能產(chǎn)生熒光[10]。苯酚的pKa為9.89,屬于一元弱酸物質(zhì),故根據(jù)1.3公式可以計(jì)算出在不同pH溶液中苯酚的不同存在形式所占的比例,從而得出分布系數(shù)δ與溶液pH間的關(guān)系曲線(圖3)。當(dāng)pH小于9.89(pHpKa),苯酚以離子A-形式存在為主。以HA中性形式存在的苯酚,不僅有較強(qiáng)的熒光信號(hào),而且疏水性能較好,有利于被萃取到疏水的膠束相中,從而獲得較高的萃取率。反之,離子狀態(tài)的苯酚,熒光強(qiáng)度低,且因其親水性增加,而較難被表面活性劑萃取。但是當(dāng)pH過(guò)低時(shí),會(huì)影響膠束相的形成。因此,本研究選擇pH6.0做后續(xù)的研究條件。

圖2 pH對(duì)熒光強(qiáng)度的影響 Fig.2 The effect of pH on the fluorescene intensity

圖3 苯酚分布系數(shù)圖 Fig.3 The distribution coefficient diagram of phenol

2.3 表面活性劑添加量對(duì)苯酚熒光強(qiáng)度的影響

篩選合適的表面活性劑是實(shí)現(xiàn)RS-CPE與熒光分光光度法聯(lián)用測(cè)定苯酚的關(guān)鍵所在。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中,本研究選取了兩種直鏈型的非離子表面活性劑PEG 6000和Tergitol 15-S-7作RS-CPE萃取劑。結(jié)果表明,兩者在本研究檢測(cè)波長(zhǎng)范圍內(nèi)均無(wú)任何熒光信號(hào),故避免了富集相中表面活性劑熒光干擾信號(hào)的問(wèn)題,提高了方法的靈敏度和準(zhǔn)確度,使結(jié)果更加可靠。兩者在水溶液中均可形成膠束,將苯酚萃取至富集相中,但PEG 6000所得的熒光強(qiáng)度高于Tergitol 15-S-7。故本研究選擇PEG 6000作為萃取劑,并考察了不同用量的0.2 g/mL PEG 6000對(duì)苯酚熒光強(qiáng)度的影響,結(jié)果如圖4所示。苯酚熒光強(qiáng)度隨著0.2 g/mL PEG 6000用量的增大而增大,當(dāng)使用體積為8.0 mL時(shí),熒光強(qiáng)度達(dá)到峰值,隨后有輕微下降趨勢(shì)。這是因?yàn)椋褂蒙倭枯腿r(shí),形成的膠束數(shù)較少,對(duì)目標(biāo)物的萃取效果差,所得的熒光強(qiáng)度小;但若使用過(guò)量的萃取劑,則會(huì)使富集相體積增大明顯,目標(biāo)物被過(guò)度稀釋,從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度有所下降。因此,為確保有足夠的表面活性劑形成膠束萃取目標(biāo)物,本研究選擇8.0 mL 0.2 g/mL PEG 6000用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 0.2 g/mL PEG 6000對(duì)熒光強(qiáng)度的影響 Fig.4 The effect of 0.2 g/mL PEG 6000 on the fluorescence intensity

2.4 正辛醇添加量對(duì)苯酚熒光強(qiáng)度的影響

經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在甲醇、無(wú)水乙醇、正辛醇協(xié)同萃取劑中,正辛醇效果最好,使用少量即可將濁點(diǎn)溫度降至室溫,快速完成萃取過(guò)程,故進(jìn)一步考察了正辛醇用量對(duì)苯酚熒光強(qiáng)度的影響,結(jié)果見(jiàn)圖5。正辛醇用量在4.0～5.0 mL時(shí),苯酚的熒光強(qiáng)度逐漸增大,當(dāng)用量大于5.0 mL時(shí),苯酚的熒光強(qiáng)度相對(duì)穩(wěn)定。這是因?yàn)?一方面使用較少量的正辛醇時(shí),不足以將全部表面活性劑的濁點(diǎn)降至室溫,形成的膠束少,這與Wen等人的研究結(jié)果是一致的[5]。另一方面,正辛醇可輔助表面活性劑萃取目標(biāo)物至富集相中,因此隨著其用量的增加,苯酚的熒光強(qiáng)度也逐漸增大。故本研究選擇正辛醇的最優(yōu)用量為5.0 mL。

圖5 正辛醇對(duì)熒光強(qiáng)度的影響 Fig.5 The effect of octanol on the fluorescence intensity

2.5 電解質(zhì)對(duì)苯酚熒光強(qiáng)度的影響

在RS-CPE過(guò)程中加入適量的無(wú)機(jī)電解質(zhì)，可以改變?nèi)芤旱臐狳c(diǎn)溫度,促使表面活性劑聚集成更大的膠團(tuán),促進(jìn)分相[16]。實(shí)驗(yàn)中觀察到,在本研究考察的四種常用無(wú)機(jī)電解質(zhì)中,需要使用5.3 g氯化鈉方能達(dá)到與其他三種鹽一樣的鹽析效果;但是由于碳酸鈉和磷酸鈉是強(qiáng)堿弱酸鹽,其水溶液呈強(qiáng)堿性,由2.2可知,苯酚在堿性條件下主要以離子A-形式存在,導(dǎo)致萃取效率低,熒光強(qiáng)度弱。氯化鈉和硫酸鈉為中性鹽,它們的加入不影響溶液pH。而且相同物質(zhì)的量濃度的電解質(zhì),單電荷離子在水中的電荷密度比多電荷離子低,打斷PEG 6000與水的作用力的能力弱,萃取率低[12]。結(jié)果表明,無(wú)水硫酸鈉的使用量少,萃取效果最好,更適用于本實(shí)驗(yàn)。從圖6可知,熒光強(qiáng)度隨無(wú)水硫酸鈉量的增加而增加,當(dāng)加入的無(wú)水硫酸鈉質(zhì)量為3.0 g時(shí),苯酚的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大。因此選擇加入3.0 g無(wú)水硫酸鈉。

圖6 電解質(zhì)對(duì)熒光強(qiáng)度的影響 Fig.6 The effect of electrolyte on the fluorescence intensity

2.6 方法的分析特征

在上述的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下,即溶液pH6.0,8.0 mL 0.2 g/mL PEG 6000,5.0 mL正辛醇,3.0 g無(wú)水硫酸鈉,進(jìn)行了方法的分析特征實(shí)驗(yàn)。在0.02～1.60 μg/mL范圍內(nèi),RS-CPE法萃取苯酚的線性回歸方程為F=5675.6ρ-2.0598,R2為0.9998,檢出限為0.0064 μg/mL,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.49%(n=8),表明該方法線性關(guān)系良好,靈敏度高,重現(xiàn)性高,精密度好。在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下,按被萃取進(jìn)入富集相的苯酚的量與總量的百分比，計(jì)算得出苯酚的萃取率為89.8%,表明該方法的萃取效果佳。

2.7 共存離子對(duì)苯酚熒光強(qiáng)度的影響

圖7 共存離子的干擾 Fig.7 The interference test of coexisting ions

2.8 實(shí)際樣品分析和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證該方法的實(shí)際應(yīng)用性,對(duì)本地超市購(gòu)買5種不同牌子的飲料瓶按1.2.2和1.2.3進(jìn)行萃取測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表1。其中在樣品2中檢測(cè)到苯酚濃度為0.0310 μg/mL,但其未超過(guò)GB 9685-2016規(guī)定食品接觸材料及制品中苯酚含量均不得大于3 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn),而其他4種牌子的包裝材料則均未檢出。向樣品中分別加入兩個(gè)濃度(0.02、0.2 μg/mL)的標(biāo)液,計(jì)算其加標(biāo)回收率。苯酚的回收率為90.5%～109.5%,表明該方法適用于實(shí)際樣品中苯酚的分析檢測(cè)。

表1 樣品加標(biāo)回收率(n=3)Table 1 The recovery of sample(n=3)

3 結(jié)論

本研究建立了RS-CPE-熒光分光光度法快速測(cè)定食品塑料包裝材料中浸出苯酚的方法。在正辛醇與無(wú)水硫酸鈉的協(xié)同作用下,直接將濁點(diǎn)溫度高達(dá)100 ℃的直鏈型非離子表面活性劑PEG 6000降至室溫,實(shí)現(xiàn)快速濁點(diǎn)萃取與相分離,并用熒光分光光度計(jì)直接進(jìn)行測(cè)定。該方法具有操作簡(jiǎn)單、環(huán)保安全、靈敏度高、檢出限低的特點(diǎn)(LOD=0.0064 μg/mL),在0.02～1.60 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性(R2=0.9998),精密度好(RSD=4.49%,n=8)。在溶液pH6.0,8.0 mL 0.2 g/mL PEG 6000,5.0 mL正辛醇,3.0 g無(wú)水硫酸鈉的最優(yōu)條件下,苯酚的萃取率可達(dá)89.8%。通過(guò)添加兩種濃度(0.02、0.2 μg/mL)作加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),獲得較好的加標(biāo)回收率(90.5%～109.5%),該方法適用于食品塑料包裝材料中浸出苯酚的分析測(cè)定。