崔敬愛(ài),莊若巖,戴碧瑋,邵智韜,徐 巖,曹 勇,陳海燕,陳曉平,*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130118; 2.長(zhǎng)春科技學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130600)

黑曲霉(Aspergillusniger)是一種絲狀子囊真菌,在環(huán)境中十分常見(jiàn)[1-2]。在自然生長(zhǎng)狀態(tài)下,黑曲霉分泌大量多種用途的酶降解環(huán)境中的生物聚合物從而獲得營(yíng)養(yǎng)。電子束輻照黑曲霉突變菌生產(chǎn)的工業(yè)酶在淀粉加工、發(fā)酵、釀造、飲料生產(chǎn)動(dòng)物飼料和造紙行業(yè)等領(lǐng)域發(fā)揮了巨大的作用。此外,黑曲霉突變菌還可以作為異源蛋白的生產(chǎn)宿主及生產(chǎn)檸檬酸和葡萄糖酸的細(xì)胞工廠,因其具有高產(chǎn)、高分泌、高安全性等優(yōu)點(diǎn)，而被廣泛地應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)中。

電子束輻照黑曲霉是通過(guò)電子加速器發(fā)射電子束射線通過(guò)高能脈沖直接作用在生物細(xì)胞內(nèi)的DNA或通過(guò)間接作用使水和小分子物質(zhì)輻解,進(jìn)而破壞生物細(xì)胞內(nèi)DNA,使DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[3-4]。電子束輻照做為應(yīng)用于食品中的一種新型物理冷加工技術(shù)[5],其本身有著獨(dú)特的特點(diǎn)。電子束誘變育種具有速度高、輻照效率高、不產(chǎn)生放射性殘留、單位耗能低、操作方法簡(jiǎn)單等特點(diǎn)[6],可以通過(guò)電子束誘變的方法來(lái)獲得優(yōu)良的突變菌株[7]。

近年來(lái),隨著輻照技術(shù)在食品生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸上的廣泛應(yīng)用以及電子束輻照技術(shù)作為一種新型的物理冷加工技術(shù)在食品生產(chǎn)、加工上的飛速發(fā)展[8],電子束輻照已在蔬菜、水果、干果、肉類(lèi)等保鮮方面有廣泛的研究[9-13]。食品輻照技術(shù)是對(duì)食品純物理的加工過(guò)程[14],加工后的產(chǎn)品不會(huì)造成殘留和環(huán)境危害[15]。但是通過(guò)電子束輻照誘變的黑曲霉突變菌的安全性還未有明確的試驗(yàn)證明,電子束誘變后黑曲霉的突變菌株作為食品發(fā)酵業(yè)的關(guān)鍵酶類(lèi)[16-17]，其安全性也需要進(jìn)一步的試驗(yàn)證明。黑曲霉在接受電子束輻照后可能會(huì)產(chǎn)生一些輻解產(chǎn)物[18]，例如一些有毒的醛類(lèi)物質(zhì)[19]。為了更好確定電子束輻照后黑曲霉突變菌的安全性,應(yīng)對(duì)輻照后的黑曲霉進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)《食品安全毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法》的規(guī)定[20]，在前期已經(jīng)完成電子束輻照后黑曲霉突變菌的急性毒性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過(guò)對(duì)小鼠進(jìn)行Ames試驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)、小鼠精子試驗(yàn)對(duì)電子束輻照后黑曲霉突變菌進(jìn)行遺傳毒性評(píng)價(jià),旨在全面評(píng)價(jià)電子束輻照后黑曲霉突變菌的遺傳安全性，為電子束輻照后黑曲霉突變菌的安全使用提供了可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉(編號(hào)40099)、察氏培養(yǎng)基 購(gòu)于CICC工業(yè)微生物菌種保藏中心;黑曲霉突變菌(編號(hào)40099) 經(jīng)電子束誘變,從吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院安全實(shí)驗(yàn)室獲得;ICR小鼠(許可證號(hào):SCXK(吉)2015-0001),50只7～12周齡的ICR小鼠,雌雄各半,50只6～8周齡的ICR雄性小鼠 遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司;鼠傷寒沙門(mén)細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株TA97、TA98、TA100和TA102 經(jīng)基因型和生物學(xué)性狀檢定合格,衛(wèi)生部食品安全衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所提供;磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、甲醇、Giemsa染色素 分析純,上海試劑廠;環(huán)磷酰胺 成都市華西生化制品廠;D-葡萄糖-6磷酸鈉鹽 上海生化所;敵克松 丹東市農(nóng)藥總廠;疊氮鈉 江蘇晶美生物科技有限公司;2-氨基芴、1,8-二羥基蒽醌 南京恒諾醫(yī)藥化工有限公司;桔霉素、二甲基亞砜 卡邁舒生物科技有限公司;牛血清蛋白(批號(hào):SQ-2010A) 北京依托華茂生物科技有限公司;大鼠肝S9混合液 大鼠肝勻漿經(jīng)低溫離心9000 r/min后所得上清液,復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院。

XSP-4C生物顯微鏡 上海長(zhǎng)方光學(xué)儀器有限公司;PH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器廠;低溫冰箱 海信容聲冰箱有限公司;SW-CJ-IFD超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;JY501電子分析天平 上海蒲春計(jì)量?jī)x器有限公司;HH-6電恒溫水浴鍋 北京長(zhǎng)風(fēng)儀器公司;DNP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 制備孢子懸浮液 用生理鹽水洗脫斜面試管孢子,180 r/min,30 ℃分散孢子,血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),調(diào)整黑曲霉孢子濃度到106CFU/mL。

1.2.2 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn) 將50只7～12周齡的健康ICR小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)7 d后,隨機(jī)分為五組,每組十只,雌雄各半。由于誘變后的黑曲霉突變菌含毒可能性極低,故本研究采用最大劑量耐受法對(duì)黑曲霉突變菌進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)[21]。由于小鼠并未產(chǎn)生中毒死亡現(xiàn)象,所以將小鼠的最大耐受劑量設(shè)定為20 g/kg。根據(jù)小鼠的最高耐受劑量,將黑曲霉孢子懸浮液制備成不同濃度的高劑量組、中劑量組、低劑量組,以二倍梯度分別設(shè)計(jì)為6.700、3.350、1.675 CFU/mL。灌胃劑量為0.04 g/kg的環(huán)磷酰胺為陽(yáng)性劑量組,蒸餾水為陰性劑量組。每個(gè)劑量組分兩次對(duì)小鼠經(jīng)口灌胃,每次間隔24 h。在第二次灌胃6 h后通過(guò)頸椎脫臼的方法處死小鼠。取出胸骨制作骨髓涂片,干燥后用Giemsa染液染色后在顯微鏡下觀察。每組小鼠涂片在生物顯微鏡下計(jì)數(shù)1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞(PCE),并計(jì)數(shù)出含有微核的嗜多染紅細(xì)胞[22]。以含微核的PCE千分率計(jì)算微核率。每組小鼠涂片計(jì)數(shù)200個(gè)PCE,顯微鏡下觀察并計(jì)算出嗜多染紅細(xì)胞與成熟正染紅細(xì)胞(NCE)的比值。

1.2.3 Ames試驗(yàn) 本次試驗(yàn)采用常規(guī)平板滲入法,采用四株經(jīng)過(guò)鑒定符合要求的鼠傷寒沙門(mén)氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100、TA102進(jìn)行小鼠細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)[23]。整個(gè)實(shí)驗(yàn)實(shí)行無(wú)菌操作。本次試驗(yàn)設(shè)8、40、200、1000、5000 μg/皿五個(gè)試驗(yàn)劑量組,同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組(無(wú)菌蒸餾水)、空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組。陽(yáng)性對(duì)照組分別為疊氮鈉(TA100,不加S9)、敵克松(TA97、TA98、TA102,不加S9)作為非活化系統(tǒng)和2-氨基芴(TA97、TA98、TA100,加S9)、1.8-二羥基蒽醌(TA102,加S9)作為活化系統(tǒng)。每個(gè)劑量做三個(gè)平行皿。在相同的試驗(yàn)條件下,重復(fù)試驗(yàn)2次,以確定實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。在37 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，直接計(jì)數(shù)法計(jì)算每皿回變菌落數(shù)[24]。

1.2.4 小鼠精子畸形試驗(yàn) 選用6～8周齡,體重為25～35 kg的雄性小鼠50只,適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后,隨機(jī)分為五組,每組十只。試驗(yàn)設(shè)計(jì)高劑量組、中劑量組、低劑量組、陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組五個(gè)劑量組[25]。根據(jù)小鼠對(duì)黑曲霉突變菌的最大耐受劑量計(jì)算出,高劑量組為10 g/kg 體重、中劑量組為5 g/kg 體重、低劑量組為2.5 g/kg 體重。陰性對(duì)照組(蒸餾水代替藥品),陽(yáng)性對(duì)照組(用環(huán)磷酰胺代替藥品,以40 mg/kg 體重灌胃)[26]。對(duì)小鼠經(jīng)口灌胃,連續(xù)5 d每天一次。在首次灌胃后的第35 d,利用頸椎脫臼的方法處死全部小鼠,取出小鼠的兩側(cè)副睪,通過(guò)制片、染色、干燥后在高倍顯微鏡下觀察其精子形態(tài),每只小鼠觀察1000個(gè)完整的精子,計(jì)算精子畸形率[27-28]。

精子畸形率(%)=精子畸形數(shù)/觀察精子總數(shù)×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)Ames每個(gè)劑量組的平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行計(jì)算。進(jìn)行t檢驗(yàn)和方差分析,并以LSD(least significant difference)法和Duncan-t檢驗(yàn)法對(duì)各劑量組進(jìn)行比較,檢驗(yàn)是否存在劑量-反應(yīng)關(guān)系。檢驗(yàn)的顯著性水平設(shè)定為p<0.05(顯著水平)和p<0.01(極顯著水平)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果

小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果如表1。

表1 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Micronucleus test results of mouse bone marrow

由表1可見(jiàn),通過(guò)哺乳動(dòng)物骨髓微核細(xì)胞試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雌、雄小鼠的環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組與蒸餾水陰性對(duì)照組的小鼠骨髓細(xì)胞微核率具有極顯著性差異(p<0.01),該結(jié)果表明環(huán)磷酰胺具有強(qiáng)烈的致突變效果,陽(yáng)性對(duì)照組可靠,證明本次試驗(yàn)具有可靠性。黑曲霉突變菌各劑量組雌、雄小鼠的骨髓細(xì)胞微核率與陰性對(duì)照組比較均無(wú)顯著性差異(p>0.05),并且隨著灌胃劑量的增加,微核率并不隨之增加,即無(wú)劑量-效應(yīng)關(guān)系。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黑曲霉突變菌的小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果為陰性。證明黑曲霉突變菌不能引起哺乳動(dòng)物嗜多染紅細(xì)胞的微核細(xì)胞率增加,黑曲霉突變菌無(wú)致突變作用。

2.2 Ames試驗(yàn)結(jié)果

黑曲霉突變菌兩次Ames試驗(yàn)結(jié)果如表2、表3。

表2 黑曲霉突變菌Ames第一次試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Aspergillus niger Ames first test

表3 黑曲霉突變菌Ames第二次試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Aspergillus niger Ames second test

試驗(yàn)結(jié)果表明,陽(yáng)性對(duì)照組的細(xì)菌回變菌落數(shù)均超過(guò)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和五個(gè)試驗(yàn)劑量組的細(xì)菌回變菌落數(shù)兩倍以上。陽(yáng)性對(duì)照組表現(xiàn)出極強(qiáng)的誘變性,陽(yáng)性對(duì)照組可靠,證明本次試驗(yàn)具有可靠性。不同劑量組的黑曲霉突變菌在加S9和不加S9的試驗(yàn)條件下,回變菌落數(shù)均未超過(guò)陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的細(xì)菌回變菌落數(shù)兩倍，差異不顯著(p>0.05)。兩次重復(fù)試驗(yàn)得出結(jié)果大致相同,即可認(rèn)為黑曲霉突變菌的小鼠Ames試驗(yàn)結(jié)果為陰性。在本次試驗(yàn)條件下，黑曲霉突變菌對(duì)小鼠未見(jiàn)致突變作用。

2.3 小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果

黑曲霉突變菌各劑量組的精子畸形率如表4。

表4 黑曲霉突變菌對(duì)小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果(n=5)Table 4 Test results of Aspergillus niger on sperm abnormality in mice(n=5)

小鼠陽(yáng)性對(duì)照組的精子畸形率與陰性對(duì)照組的精子畸形率相比較具有極顯著性差異(p<0.01)，說(shuō)明小鼠對(duì)環(huán)磷酰胺敏感,陽(yáng)性對(duì)照組可靠，證明本次試驗(yàn)結(jié)果具有可靠性。小鼠的各個(gè)劑量組與陰性對(duì)照組的精子畸形率均在正常范圍內(nèi),通過(guò)高倍顯微鏡對(duì)小鼠的精子形態(tài)觀察,未出現(xiàn)雙頭、雙尾、尾折疊、胖頭等畸變類(lèi)型,黑曲霉突變菌各劑量組精子畸形率與陰性對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(p>0.05)。所以在此試驗(yàn)條件下,黑曲霉突變菌的小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果為陰性[29-31]。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究中,通過(guò)最大耐受計(jì)量法測(cè)得黑曲霉突變菌屬于無(wú)毒級(jí)別。采用Ames試驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)、小鼠精子畸形試驗(yàn)的方法，對(duì)誘變后的黑曲霉突變菌的遺傳毒性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，在Ames試驗(yàn)中,無(wú)論是否添加S9,黑曲霉突變菌Ames試驗(yàn)結(jié)果均為陰性。表明黑曲霉突變菌無(wú)致突變作用。在小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)中,黑曲霉突變菌不能引起哺乳動(dòng)物嗜多染紅細(xì)胞的微核細(xì)胞率增加，試驗(yàn)結(jié)果為陰性,表明黑曲霉突變菌并無(wú)致突變作用。在小鼠精子畸形試驗(yàn)中,試驗(yàn)結(jié)果為陰性,表明黑曲霉突變菌并未對(duì)小鼠的精子產(chǎn)生致畸作用。綜上所述,在此試驗(yàn)條件下,經(jīng)電子束輻照處理后的黑曲霉突變菌屬無(wú)毒性,并無(wú)遺傳毒性作用。