潘進(jìn)權(quán),周鮮嬌,劉玉婷

(嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,廣東湛江 524048)

鳶烏賊(Symplectoteuthisoualaniensis)是我國南海海域廣泛分布的一種大型可食性魚類,其資源相當(dāng)豐富,每年的捕撈量都高達(dá)200萬t左右[1-2]。檢測分析發(fā)現(xiàn),鳶烏賊是一種營養(yǎng)價值較高的食材,屬于典型的低脂高蛋白海產(chǎn)品，其氨基酸組成較合理,人體所需的8種必需氨基酸含量豐富[3-4]。此外,鳶烏賊脂肪含量低,內(nèi)臟及機(jī)體骨架結(jié)構(gòu)較簡單,是一種具有良好加工性能的食品原材料，但由于鳶烏賊肌肉組織較致密,肉質(zhì)較硬,直接加工食用口感較差[5],因此不太被大眾所接受,這導(dǎo)致其市場售價偏低,銷售受阻;國內(nèi)大部分的鳶烏賊都是經(jīng)粗加工制成魷魚絲出售,由于產(chǎn)品加工層次較低,導(dǎo)致鳶烏賊資源的利用率不高。因此開展鳶烏賊資源的深加工利用,提高其經(jīng)濟(jì)效益已是當(dāng)務(wù)之急。

酸溶性肽是蛋白原料經(jīng)酶解后得到的具有可溶于酸性環(huán)境的小肽混合物,其分子量小,具有很好的分散性,食品加工性能優(yōu)良,通常被作為原料廣泛應(yīng)用于各類食品的加工[6-8];此外,蛋白質(zhì)經(jīng)酶解得到的小肽,由于經(jīng)過了體外蛋白酶的預(yù)消化,進(jìn)入體內(nèi)后具有非常高的吸收利用率[9-12],在醫(yī)用食品中得到廣泛的應(yīng)用[13];另外,小肽通常賦有一定的生理保健功能[14-17],在功能食品領(lǐng)域已被作為一種重要的功能因子被廣泛應(yīng)用[18-22]。鳶烏賊是優(yōu)良的食品蛋白原料,然而國內(nèi)外對其加工利用的相關(guān)研究報道卻極少,僅有個別學(xué)者開展了鳶烏賊源抗氧化肽的相關(guān)研究,主要分析了鳶烏賊水解所得多肽的抗氧化效果[23-25],但對多肽生產(chǎn)工藝的研究卻較少。為有效利用鳶烏賊蛋白資源,本研究考察了酶解鳶烏賊組織蛋白制備酸溶性肽的工藝路線,比較了不同蛋白酶對鳶烏賊組織蛋白的水解性能,并對酶解工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化,其結(jié)果將為鳶烏賊酸溶性肽的加工與利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鳶烏賊 購于水產(chǎn)品市場;胰蛋白酶(227.2 U/mg)、木瓜蛋白酶(126.1 U/mg)、胃蛋白酶(95.4 U/mg)、微生物中性蛋白酶(158.2 U/mg)、微生物堿性蛋白酶(224 U/mg) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;所用其它試劑 均為分析純。

AUY120電子分析天平 日本SHIMADZU CORPORATION公司;723N可見分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司;SKD-600自動凱氏定氮儀、SKD-08S2紅外智能消化爐 上海市沛歐分析儀器有限公司;B-260恒溫水浴鍋 上海亞榮生化儀器廠;Sigma 3-18K高速冷凍離心機(jī) 博勱行儀器有限公司;DS-1高速組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白酶酶活測定 采用Folin-酚法[26]:1.5 mL離心管中加入0.3 mL稀釋的粗酶液及0.3 mL 1.5%酪蛋白(用適宜的緩沖液配制),40 ℃反應(yīng)10 min,加0.6 mL 0.4 mo1/L 的三氯乙酸終止反應(yīng),靜置15 min后，14000×g離心10 min,取上清液0.6 mL,加入3 mL 0.4 mol/L碳酸鈉溶液及0.6 mL福林酚試劑,于40 ℃顯色20 min;按相同的操作做一試劑空白。以空白為參照，于680 nm測定樣品顯色液的吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶活單位。

酶活定義:試驗條件下,每分鐘水解酪蛋白釋放出1 μg當(dāng)量酪氨酸所需酶量為1個活力單位。

1.2.2 鳶烏賊組織蛋白酶解工藝 參考文獻(xiàn)工藝流程[27]:烏賊去除內(nèi)臟取酮體肉→勻漿→稱量→加水稀釋→調(diào)pH→加酶水解→煮沸滅酶→離心取上清→得到水解液。

將鳶烏賊去除內(nèi)臟后切成小塊,稱量一定量的酮體肉,按酮體肉∶水=1∶1的質(zhì)量比混合,用高速組織搗碎機(jī)10000 r/min勻漿;用凱氏定氮儀測定肉漿的蛋白質(zhì)含量(為6.813%);加入適量的水使肉漿的蛋白質(zhì)含量達(dá)到3%,并調(diào)節(jié)其pH到8.5;將肉漿液預(yù)熱到50 ℃,按照每克組織蛋白加入2500 U的蛋白酶,然后保溫酶解5 h;水解結(jié)束后,將酶解液加熱煮沸并維持10 min滅酶;冷卻后于5000 r/min離心10 min,收集上清即得到水解液。此為酶解工藝的基本方法,后續(xù)條件優(yōu)化在此基礎(chǔ)上開展。

1.2.3 蛋白酶的選擇 在參考所選酶的最適水解條件[28]和預(yù)實驗的基礎(chǔ)上,選用五種酶在其最適pH條件下進(jìn)行實驗,其中胃蛋白酶pH為2.0,木瓜蛋白酶pH為7.0,胰蛋白酶pH為8.5,微生物中性蛋白酶pH7.5,微生物堿性蛋白酶9.5;控制其他條件相同:底物濃度為3%,加酶量為3000 U/g,酶解溫度為40 ℃,酶解時間為5 h;按1.2.2方法進(jìn)行酶解試驗,比較了不同蛋白酶對鳶烏賊組織蛋白水解效率的差異。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 pH對胰蛋白酶水解鳶烏賊組織蛋白的影響 按照1.2.2所述方法,分別在pH7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5條件下進(jìn)行酶解試驗,研究pH對水解液中酸溶性肽得率的影響。

1.2.4.2 酶解溫度對胰蛋白酶水解鳶烏賊組織蛋白的影響 按照1.2.2所述方法,分別在30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃條件下進(jìn)行酶解試驗,研究溫度對水解液中酸溶性肽得率的影響。

1.2.4.3 加酶量對胰蛋白酶水解鳶烏賊組織蛋白的影響 按照1.2.2所述方法,加酶量分別為500、1000、2000、3000、4000、5000、6000 U/g條件下進(jìn)行酶解試驗,考察了加酶量對水解液中酸溶性肽得率的影響。

1.2.4.4 底物濃度對胰蛋白酶水解鳶烏賊組織蛋白的影響 按照1.2.2所述方法,底物濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%的條件下進(jìn)行酶解試驗,研究了底物濃度對水解液中酸溶性肽得率的影響。

1.2.4.5 酶解時間對胰蛋白酶水解鳶烏賊組織蛋白的影響 按照1.2.2所述方法,酶解時間分別為0.5、1、2、3、4、5、6、7 h條件下進(jìn)行酶解,考察了酶解時間對水解液中酸溶性肽得率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面實驗 采用響應(yīng)面分析法中的Box-Behnken試驗設(shè)計,對加酶量、溫度與pH三個因素做進(jìn)一步考察,以確定鳶烏賊組織蛋白水解的最佳工藝條件,各因素及水平取值如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗的因素水平Table 1 Factors and levels for response surface experiments

1.2.6 蛋白水解度的測定 采用凱氏定氮法測定原水解液中(蛋白)總氮含量;

采用甲醛滴定法測定水解液中的氨基態(tài)氮含量[29];

水解度(DH)定義:蛋白質(zhì)水解過程中被裂解的肽鍵數(shù)占給定蛋白質(zhì)總肽鍵數(shù)的百分?jǐn)?shù)。

DH(%)=(水解液中氨基態(tài)氮含量/水解液中原蛋白總氮含量)×100

1.2.7 酸溶性肽含量的檢測及得率計算 水解液中多肽含量的測定采用酸溶性蛋白測定方法[30]:取水解液5 mL,加入濃度2 mol/L的三氯乙酸5 mL,充分混勻后靜置10 min，然后于8000 r/min離心10 min,收集上清液;采用凱氏定氮法測定上清液中氮含量。水解液中酸溶性肽得率計算:

酸溶性肽得率(%)=水解液中酸溶性肽氮含量/原酶解液中總氮含量×100

1.2.8 酸溶性肽氨基酸組成分析 參照國標(biāo)方法檢測[31]。采用優(yōu)化后的酶解工藝制備水解液,取5 mL水解液加入濃度為2 mol/L的三氯乙酸5 mL,充分混勻后靜置10 min，然后于8000 r/min離心10 min,收集得到上清液;取一定量上清液經(jīng)酸水解后，利用氨基酸自動分析儀測定樣液中各氨基酸的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用PASW Statistics 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素實驗數(shù)據(jù)分析及作圖;采用Design-Expert V10.0.3軟件進(jìn)行響應(yīng)面實驗設(shè)計及相關(guān)數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的選擇

比較不同蛋白酶對鳶烏賊組織蛋白的水解效果,結(jié)果如表2所示。

表2 不同蛋白酶對鳶烏賊組織蛋白水解效果的比較Table 2 Comparison on the hydrolysis of protein from Symlectoteuthis oualaniensis with different proteases

由表2可知,除了木瓜蛋白酶與微生物中性蛋白酶之間無顯著性差異外,其它幾種蛋白酶之間均表現(xiàn)出顯著性差異(p<0.05);其中,胰蛋白酶與微生物堿性蛋白酶對鳶烏賊組織蛋白的水解能力較強(qiáng),初步說明這兩種蛋白酶的肽鍵選擇性[32]與鳶烏賊組織蛋白的氨基酸組成及分布有較好的對應(yīng)關(guān)系;胃蛋白酶對鳶烏賊組織蛋白的水解能力最差,這與胃蛋白酶不同的肽鍵選擇性有直接關(guān)系[32]。此外,在強(qiáng)酸性條件下鳶烏賊組織蛋白的不溶[4]也是導(dǎo)致胃蛋白酶水解性能差的原因之一。另外,從表中結(jié)果還發(fā)現(xiàn),微生物堿性蛋白酶與胰蛋白酶對鳶烏賊組織蛋白的水解特點(diǎn)略有不同,微生物堿性蛋白酶所得水解液的水解度是最高的,然而其多肽得率卻顯著低于胰蛋白酶(p<0.05),這說明微生物堿性蛋白酶在鳶烏賊組織蛋白的肽鏈上有相對更多的酶切位點(diǎn)，而胰蛋白酶在鳶烏賊組織蛋白肽鏈上的酶切位點(diǎn)相對略少,但是位點(diǎn)分布較均勻,因此水解液中肽得率相對較高。鑒于本研究的目的是以獲得酸溶性肽為主,因此選取了胰蛋白酶做后續(xù)的研究。

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 pH對鳶烏賊組織蛋白水解的影響 從圖1的結(jié)果來看,相對較高的pH有利于鳶烏賊組織蛋白的水解,這與胰蛋白酶最適作用pH偏堿性的特點(diǎn)是一致的,而且堿性條件也有助于組織蛋白的溶出,可進(jìn)一步加速組織蛋白的水解;當(dāng)酶解體系的pH超過9.5后,鳶烏賊組織蛋白的水解效率會下降,這應(yīng)該是由于胰蛋白酶在過強(qiáng)的堿性條件下變性失活所導(dǎo)致[33]。綜合以上試驗結(jié)果來看,鳶烏賊組織蛋白較適宜的酶解pH在9.5左右。

圖1 pH對鳶烏賊組織蛋白水解的影響Fig.1 Effect of pH on the hydrolysis of protein from Symplectoteuthis oualaniensis

2.2.2 酶解溫度對鳶烏賊組織蛋白水解的影響 由圖2所示:在30～50 ℃溫度范圍內(nèi),酶解體系的多肽得率會隨著溫度的升高而升高,顯示出組織蛋白的水解效率逐步上升,這是由于適當(dāng)升溫增加了蛋白酶的活力,并提高了組織蛋白的溶出速率;當(dāng)酶解體系的溫度超過60 ℃,多肽得率則隨著溫度的升高而下降,這應(yīng)該是高溫使蛋白酶變性失活所致。從圖中的結(jié)果來看,鳶烏賊組織蛋白較適宜的酶解溫度在50 ℃左右,與類似文獻(xiàn)報道結(jié)果基本一致[34]。

圖2 酶解溫度對鳶烏賊組織蛋白水解的影響Fig.2 Effect of temperature on the hydrolysis of protein from Symplectoteuthis oualaniensis

2.2.3 加酶量對鳶烏賊組織蛋白水解的影響 如圖3所示,加酶量對酸溶性多肽的得率有較大的影響,隨著酶量的增加,酶解體系的多肽得率逐漸增加;當(dāng)酶量增加到4000 U/g后,酶解體系的多肽得率達(dá)到最高并趨于穩(wěn)定,說明蛋白酶相對于底物濃度已基本趨于飽和。根據(jù)以上試驗結(jié)果可初步確定，酶解體系的加酶量在4000 U/g左右。

圖3 加酶量對鳶烏賊組織蛋白水解的影響Fig.3 Effect of enzyme amount on the hydrolysis of protein from Symplectoteuthis oualaniensis

2.2.4 底物濃度對鳶烏賊組織蛋白水解的影響 如圖4所示,底物濃度對鳶烏賊組織蛋白的水解有明顯的影響:當(dāng)?shù)孜锏鞍诐舛鹊陀?%時,酶解體系的多肽得率較高,說明組織蛋白的水解較徹底;當(dāng)?shù)孜锏鞍诐舛瘸^3%后,酶解體系的多肽得率會隨著蛋白濃度的增加迅速降低,顯示出組織蛋白水解不徹底。可能是由于酶解體系中小肽濃度增加，導(dǎo)致對蛋白酶的反饋抑制作用增強(qiáng),從而導(dǎo)致酶解體系中有效酶活降低;另外,隨著底物濃度的增加,體系的粘稠度也迅速上升,導(dǎo)致蛋白分子運(yùn)動能力降低,從而在一定程度上降低了組織蛋白的水解效率。根據(jù)以上試驗結(jié)果,并綜合考慮酶解工藝的實用價值及設(shè)備利用率,最終確定酶解體系適宜的底物蛋白濃度為3%。

圖4 底物濃度對鳶烏賊組織蛋白水解的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on the hydrolysis of protein from Symplectoteuthis oualaniensis

2.2.5 酶解時間對鳶烏賊組織蛋白水解的影響 如圖5所示。整個酶解過程可分為3個階段:0～2 h為快速酶解期,這一階段中鳶烏賊組織蛋白的溶出較迅速,胰蛋白酶對組織蛋白肽鏈上最敏感的肽鍵進(jìn)行切割,酶解體系的多肽得率迅速上升;2～5 h為緩慢酶解期,在這一階段由于酶解體系中底物蛋白濃度較低,組織蛋白的溶出速率下降,胰蛋白酶主要作用于大片段肽段上的次級敏感鍵,酶活性降低,因此酶解體系的多肽得率表現(xiàn)為緩慢上升;5～7 h為酶解穩(wěn)定期,在這一階段由于底物蛋白已基本消耗完全,另外由于小肽對胰蛋白酶的反饋抑制會使蛋白酶活力降低,因此酶解過程基本處于停滯,酶解體系的多肽得率維持穩(wěn)定。此外,由于蛋白水解液極易被微生物污染而變質(zhì),影響其品質(zhì),因此水解時間也不宜過長。綜合考慮,確定了酶解體系的水解時間為5 h。

圖5 酶解時間對鳶烏賊組織蛋白水解的影響Fig.5 Effect of reaction time on the hydrolysis of protein from Symplectoteuthis oualaniensis

2.3 酶解工藝的響應(yīng)面實驗結(jié)果

從單因素試驗結(jié)果可以看出,上述5個因素對鳶烏賊組織蛋白水解均有較大的影響:酶解時間越長，多肽得率越高,水解越充分。但是考慮到酶解后期水解液易滋生微生物腐敗,在確保水解較完全的前提下不宜再延長水解時間,可固定酶解時間為5 h;另外,單因素實驗結(jié)果顯示，底物蛋白濃度越低,酶解效果越好,然而考慮到酶解工藝的實用性及設(shè)備利用率,底物蛋白濃度又不宜過低,在確保相對較高多肽得率的前提下，可固定酶解體系適宜的底物蛋白濃度為3%。為此,酶解時間及底物蛋白濃度這兩個因素不再參與后續(xù)的工藝優(yōu)化,僅選取了pH、加酶量及溫度3個因素進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化試驗。其試驗設(shè)計與結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Response surface design scheme and corresponding experimental results

運(yùn)用Design Expert 10.0軟件對表3中的試驗結(jié)果進(jìn)行回歸分析,可以得到酸溶性肽得率(Y)相對于pH(A)、酶解溫度(B)、加酶量(C)的數(shù)學(xué)模型(因素采用編碼值):

Y=73.32+1.63A-4.34B+0.76C+0.70AB+0.95AC+0.52BC-3.77A2-7.55B2-2.10C2

對以上的回歸模型及數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(如表4所示),結(jié)果顯示回歸模型具有非常高的顯著性(p<0.01),失擬項不顯著(p=0.1252>0.05),說明模型對實驗結(jié)果的擬合度非常高;模型的R2達(dá)到了0.9771,說明該模型預(yù)測值可以解釋97.71%的試驗結(jié)果;對各因素項的分析可以看出A、B、A2、B2、C2項對鳶烏賊組織蛋白水解有極顯著影響(p<0.01);對三個因素的交互作用分析可以看出,在試驗設(shè)置的各因素取值范圍內(nèi)三因素間的交互作用不顯著。

表4 響應(yīng)面試驗結(jié)果的方差分析Table 4 Analysis of variance(ANOVA)of the experimental results of response surface design

對上述模型進(jìn)行曲面擬合可得到圖6～圖8的響應(yīng)面圖,從響應(yīng)面圖外形可以清晰看出以上模型擬合得到的是一個典型的凸曲面,其對應(yīng)的等高線圖呈現(xiàn)向內(nèi)收縮數(shù)值遞增的變化趨勢,其圓心為最大值,這說明在響應(yīng)曲面上是存在最大響應(yīng)值的。此外,三個響應(yīng)面圖所對應(yīng)的等高線圖均為橢圓形,說明溫度、pH及加酶量三因素間存在一定的交互作用。利用Design Expert10.0軟件優(yōu)化可確定出該最大響應(yīng)值為73.899%,各因素的最適取值分別是pH9.23,酶解溫度52.3 ℃,加酶量為4210 U/g。

圖6 酶解溫度與pH對胰蛋白酶水解鳶烏賊組織蛋白的影響Fig.6 Effect of temperature and pH on the the hydrolysis of protein from Symplectoteuthis oualaniensis

圖7 加酶量與pH對胰蛋白酶 水解鳶烏賊組織蛋白的影響Fig.7 Effect of enzyme amount and pH on the the hydrolysis of protein from Symplectoteuthis oualaniensis

圖8 溫度與加酶量對胰蛋白酶 水解鳶烏賊組織蛋白的影響Fig.8 Effect of temperature and enzyme amount on the the hydrolysis of protein from Symplectoteuthis oualaniensis

根據(jù)以上的單因素及響應(yīng)面試驗確定了鳶烏賊組織蛋白水解的最佳工藝條件為:蛋白濃度4%,加酶量4210 U/g蛋白,pH9.23,酶解溫度52.3 ℃,酶解時間5 h。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行了驗證實驗,5次獨(dú)立實驗的平均結(jié)果為(74.02%±0.41%),與預(yù)測值相一致,說明上述擬合模型具有可靠性。此外,對比文獻(xiàn)報道可以看出,優(yōu)化后的多肽得率明顯高于類似文獻(xiàn)的報道結(jié)果[35]。

2.4 酸溶性肽氨基酸組成分析

運(yùn)用氨基酸自動分析儀對水解所得酸溶性肽的氨基酸組成進(jìn)行了分析,結(jié)果如表5所示。鳶烏賊酮體蛋白有較高的營養(yǎng)價值,它含有人體所需的17種氨基酸(因檢測條件限制沒能檢測色氨酸),8種必需氨基酸含量高,約占氨基酸總量的38%。比較酮體蛋白與水解液的氨基酸組成可以看出,經(jīng)水解所得的多肽混合物基本上保持了鳶烏賊組織蛋白的氨基酸組成,未出現(xiàn)氨基酸缺失情況;個別氨基酸,如甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸會因為水解表現(xiàn)出富集效應(yīng);僅蛋氨酸在水解后有少許的損失。

表5 酸溶性肽氨基酸組成分析結(jié)果Table 5 The results of amino acid composition of the acid soluble peptides

3 結(jié)論

不同類型蛋白酶對鳶烏賊組織蛋白水解的效率有顯著性差異:其中,胰蛋白酶的水解能力最強(qiáng),酸溶性肽得率最高,胃蛋白酶的水解性能最差;微生物堿性蛋白酶對鳶烏賊組織蛋白也有較強(qiáng)的水解作用,而且其水解特點(diǎn)不同于胰蛋白酶。采用響應(yīng)面優(yōu)化法確定的鳶烏賊組織蛋白酶解工藝條件為:蛋白濃度3%,加酶量4210 U/g蛋白,pH9.23,酶解溫度52.3 ℃,酶解時間5 h。在優(yōu)化的工藝條件下,酸溶性肽的得率可以達(dá)到(74.02%±0.41%)。此外,氨基酸分析結(jié)果表明,經(jīng)酶解得到的酸溶性肽很好地保持了鳶烏賊組織蛋白的氨基酸組成,人體所需氨基酸較齊全,8種必須氨基酸含量豐富。綜合以上結(jié)果來看,采用胰蛋白酶水解鳶烏賊制備酸溶性肽的工藝具有較好可行性。