袁詩(shī)俊,龔夢(mèng)瑀,李夢(mèng)林,順遠(yuǎn)楓,黃 毅

(西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川綿陽(yáng) 621010)

自由基是單質(zhì)或化合物均裂產(chǎn)生的帶有未成對(duì)電子的原子或基團(tuán),研究表明其與多種疾病的發(fā)生有密切的關(guān)系[1]，能夠有效抑制自由基的產(chǎn)生有助于有效地預(yù)防,延緩甚至治愈,如阿爾茲海默病[2]、慢性支氣管炎[3]和青光眼[4]等疾病。因此,近年來,抗氧化物質(zhì),特別是天然產(chǎn)物來源的抗氧化物質(zhì)的開發(fā)成為研究熱點(diǎn)。大量的化妝品中添加植物抗氧化劑,對(duì)抗自由基引起的皮膚衰老[5]。很多天然食品或藥品如葡萄、虎杖和桑椹中的白藜蘆醇等早已作為膳食補(bǔ)充劑,用于保健及疾病預(yù)防[6]。

大黃(Rhubarb)是蓼科大黃屬植物的干燥根莖,為我國(guó)常用中藥材，其臨床應(yīng)用廣泛,具有顯著止瀉、抗腫瘤和腦保護(hù)等效果。近年來,大黃抗氧化作用也受到了廣泛關(guān)注,其所含大黃酸[7]、大黃素[8]等蒽醌類衍生物以及鞣質(zhì)等能直接對(duì)抗自由基損傷細(xì)胞的效果,有利于機(jī)體機(jī)能修復(fù)及細(xì)胞的抗衰老,對(duì)于其他藥用功效也有較強(qiáng)的輔助效果。

本課題組在對(duì)傳統(tǒng)中藥材抗氧化能力的初步篩選系列工作中,發(fā)現(xiàn)大黃具有非常強(qiáng)的抑制自由基活性?，F(xiàn)有文獻(xiàn)對(duì)其抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)并不完全清晰,提取方面的報(bào)道更是著重某一化學(xué)類別物質(zhì)的工藝優(yōu)化而非以活性為檢測(cè)指標(biāo),如蒽醌類[9]或多糖類[10]等。為了促進(jìn)大黃作為天然抗氧化保健藥食品的開發(fā)以及其抗氧化活性物質(zhì)的后續(xù)分離工作,本文采用正交試驗(yàn)對(duì)大黃抗氧化活性物質(zhì)的提取工藝進(jìn)行研究,優(yōu)化提取方案。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大黃(產(chǎn)地青海,批號(hào) 160901)藥材飲片 于2017年購(gòu)自四川綿陽(yáng)桐君閣大藥房,經(jīng)鑒定為蓼科大黃屬植物藥用大黃(RheumofficinaleBaill)的干燥根莖,藥材經(jīng)60 ℃烘干,粉碎過50目篩,4 ℃避光干燥保存?zhèn)溆?整個(gè)提取工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)在1月內(nèi)完成;DPPH(1,1-二苯-2-苦肼自由基) 梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;無水乙醇 成都市科龍化工試劑廠;以上試劑 均為分析純；純水 為實(shí)驗(yàn)室自制(電阻率為18 MΩ·cm)。

7200型可見光分光光度計(jì) 龍尼柯(上海)儀器有限公司;小型中藥材粉碎機(jī) 上海淀久中藥機(jī)械廠;XH-C型渦旋混合器 金壇市天竟實(shí)驗(yàn)儀器廠;D1008E型小型離心機(jī) 美國(guó)Scilogex有限公司;KQ-200KDE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;BSA124S型電子天平 德國(guó)賽多利斯有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大黃中抗氧化物質(zhì)的提取 采用超聲輔助提取(功率恒定為200 W),準(zhǔn)確稱取500 mg大黃藥材粉末于具塞錐形瓶中,加入10 mL無水乙醇,封口并記錄瓶重,超聲提取10 min后,按記錄重量補(bǔ)足溶劑,將提取液于10000 r/min離心1 min,取上清液用于抗氧化活性檢測(cè)。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 影響提取效果的因素主要包括乙醇濃度,浸提溫度,提取時(shí)間和固液比,通過預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)浸提溫度對(duì)提取物抗氧化活性影響不大,因此選取剩余三因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。以DPPH自由基的清除率作為考察指標(biāo),固定提取時(shí)間為10 min,固液比為1∶10條件下考察了乙醇濃度100%、80%、60%、40%和20%對(duì)抗氧化物質(zhì)提取的影響;固定乙醇濃度為100%,固液比為1∶10,考察浸提時(shí)間10、30、50、70和90 min對(duì)抗氧化物質(zhì)的提取影響;固定乙醇濃度100%,浸提時(shí)間10 min,考察固液比為1∶90、1∶70、1∶50、1∶30、1∶10對(duì)大黃中抗氧化活性物質(zhì)提取的影響。為保證固液比測(cè)定的準(zhǔn)確性,不同固液比提取的最終溶液均稀釋到相同濃度進(jìn)行抗氧化活性比較。

1.2.3 正交試驗(yàn) 參考報(bào)道[11]文獻(xiàn),在各單因素實(shí)驗(yàn)的自由基清除率極大值附近選取三個(gè)水平,以DPPH自由基清除率為指標(biāo),設(shè)計(jì)3因素3水平正交表L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn),優(yōu)化大黃中抗氧化活性成分的提取工藝。

表1 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels in the L9(34)orthogonal test

1.2.4 DPPH抗氧化活性檢測(cè) 抗氧化活性測(cè)定包括DPPH法、羥基自由基、超氧陰離子自由基、總還原力和鐵螯合能力測(cè)定等多種方法,在預(yù)實(shí)驗(yàn)中筆者發(fā)現(xiàn)以上方法結(jié)果具有一致性。為方便工藝研發(fā)中活性的快速跟蹤,本實(shí)驗(yàn)選用了較為簡(jiǎn)便的DPPH自由基清除率實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行抗氧化活性判定。采用Pyrzynska等[12]報(bào)道的方法略作修改,準(zhǔn)確移取200 μL樣品溶液與4 mL DPPH溶液(30μg/mL,由無水乙醇配制,該溶液在517 nm處吸光度值約為0.8)于試管中,渦旋混勻后避光5 min,10000 r/min離心1 min,取上清液轉(zhuǎn)入比色皿,室溫下測(cè)定517 nm處吸收值。該值伴隨自由基清除劑量的增多而減弱,樣品抗氧化能力可用清除率(Scavenging rate,簡(jiǎn)寫為SR%)來表示,計(jì)算公式如下:

SR(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100

式中:Ai為0.2 mL測(cè)試溶液與4 mL DPPH溶液混合后的吸光度值;Aj為0.2 mL測(cè)試溶液與4 mL無水乙醇溶劑混合后的吸光度值;A0為0.2 mL制備測(cè)試溶液時(shí)所用溶劑與4 mL DPPH溶液混合后的吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3次,單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±SE表示,正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值表示,采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行ANOVA分析(顯著性水平p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度 由圖1可知,乙醇濃度小于60%時(shí),自由基清除率緩慢提高。伴隨乙醇濃度的繼續(xù)上升,清除率大幅下降。可推斷大黃中抗氧化活性物質(zhì)主要為親水性化合物,其更易溶于水而非乙醇。在后續(xù)正交試驗(yàn)中乙醇濃度這一因素選擇40%、60%和80% 這3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖1 乙醇濃度對(duì)清除率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on clearance rate

2.1.2 提取時(shí)間 由圖2可知,提取時(shí)間對(duì)抗氧化活性的影響呈鐘形分布。提取開始后,伴隨時(shí)間延長(zhǎng),溶劑充分浸透大黃粉末,促進(jìn)了顆粒中抗氧化物質(zhì)的充分溶出,使得清除率增加,抗氧化活性升高，到30 min時(shí)清除率基本達(dá)到最大值,此后,自由基清除率反而伴隨時(shí)間延長(zhǎng)而下降,原因可能是超聲時(shí)間過久,超聲波的空化效應(yīng)和熱效應(yīng)都會(huì)破壞抗氧化活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)[13]。后續(xù)正交試驗(yàn)中提取時(shí)間選取10、30和50 min 3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖2 提取時(shí)間對(duì)清除率的影響Fig.2 Effect of extraction time on clearance rate

2.1.3 固液比 由圖3可知,固液比在1∶10～1∶30(即樣品濃度大于33 mg·L-1)時(shí),DPPH的清除率隨著溶劑占比的增加而增大,說明伴隨溶劑量的增加,樣品中抗氧化活性物質(zhì)與溶劑接觸面積增加,使得更多的抗氧化活性物質(zhì)有效溶出，但當(dāng)固液比達(dá)到1∶30并繼續(xù)增加溶劑量時(shí),提取液對(duì)DPPH自由基的清除率并未繼續(xù)上升而是基本保持恒定狀態(tài)。鑒于溶劑用量過大會(huì)造成成本上升,因此選取1∶10、1∶30和1∶50這3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖3 固液比對(duì)清除率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on clearance rate

2.2 正交實(shí)驗(yàn)及驗(yàn)證

正交試驗(yàn)結(jié)果及分析見表2和表3,極差R值反應(yīng)出,影響大黃提取物的抗氧化活性的因素由主到次依次為A時(shí)間>B乙醇濃度>C固液比。A因素第2水平的均值最大,故因素A的優(yōu)選水平為2,同理因素B和C的優(yōu)選水平均為2。所以本實(shí)驗(yàn)的最佳工藝條件為A2B2C2,即提取時(shí)間為30 min,乙醇濃度為60%,固液比為1∶30。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析Table 2 Orthogonal test results and range analysis

表3 方差分析表Table 3 Variance analysisTable

根據(jù)以上最優(yōu)條件:提取時(shí)間30 min,乙醇濃度60%和固液比為1∶30進(jìn)行最優(yōu)工藝驗(yàn)證,3組平行實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果為96.02%±1.36%,該結(jié)果符合預(yù)期且優(yōu)于以上所有水平表現(xiàn),表明該優(yōu)化參數(shù)可行。

3 結(jié)論

由于抗氧化活性物質(zhì)種類多樣,已報(bào)道的工藝開發(fā)方法雖然明確了化合物類別,但提取時(shí)容易遺漏具有抗氧化活性的其他類成分。本研究以生物活性為指標(biāo)進(jìn)行工藝優(yōu)化避免了以上問題的出現(xiàn)。最終,通過單因素和正交試驗(yàn),以提取物對(duì)自由基的清除率為指標(biāo),得到大黃抗氧化活性物質(zhì)的最佳提取條件為提取時(shí)間30 min、乙醇濃度60%和固液比為1∶30,此時(shí)其自由基清除率可達(dá)96.02%±1.36%,該工藝可為大黃作為保健藥食品的開發(fā)利用提供一定的理論和應(yīng)用依據(jù)。