穆惠敏,朱常亮,沈照鵬,3,孟 蕾,江曉路,3,,*

(1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003; 2.中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院,山東青島 266003; 3.青島海洋生物醫(yī)藥研究院,山東青島 266071; 4.青島明月海藻集團有限公司,海藻活性物質(zhì)國家重點實驗室,山東青島 266400)

紫菜屬于紅藻門紫菜屬,是一種重要的海洋經(jīng)濟藻類,廣泛分布于世界各地,以人工養(yǎng)殖為主,品種較多,壇紫菜、條斑紫菜和甘紫菜為常見養(yǎng)殖種類[1]。近幾年來,我國紫菜栽培規(guī)模不斷擴大,栽培面積增長較快,但是在條斑紫菜良種選育方面發(fā)展較為滯后,仍以依靠傳統(tǒng)育種為主[2],而我國傳統(tǒng)的紫菜養(yǎng)殖基本選用未經(jīng)遺傳改良的自然群體,在育種過程中易出現(xiàn)病爛、產(chǎn)量及質(zhì)量下降等問題,限制了我國紫菜栽培的發(fā)展,故紫菜育種過程中苗種穩(wěn)定性差及低優(yōu)質(zhì)率成為亟待解決的問題[3]。而原生質(zhì)體作為育種基礎(chǔ)研究及作物改良的理想材料[4-6],可極大的縮短育種時間、簡化紫菜育種工藝,同時原生質(zhì)體還是紫菜基因工程與體細(xì)胞雜交的良好材料,故而分離高質(zhì)量的原生質(zhì)體是進行紫菜育種、原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交的先決條件[7-8]。

原生質(zhì)體的制備主要有機械法和酶解法,其中機械法制備原生質(zhì)體具有操作條件劇烈、損傷大、收率低等缺點[9-12],而唐延林[13]首次利用一種從食藻性的粒嶸螺消化腺中提取、制備出的復(fù)合酶制劑分離紫菜原生質(zhì)體,但其使用的復(fù)合酶制劑不易獲得。

本研究利用市場上易于購買的瓊膠酶制劑、纖維素粗酶粉等,通過復(fù)合酶法制備原生質(zhì)體,針對一些外在因素如:反應(yīng)時間、加酶量、酶解溫度、轉(zhuǎn)速、鹽度、金屬離子及酶中各組分的比例設(shè)計了實驗。采取單因素實驗與正交試驗,以原生質(zhì)體的數(shù)量為衡量指標(biāo),對紫菜原生質(zhì)體的制備條件進行優(yōu)化。旨在選取高效的酶解工藝,從紫菜藻體上分離大量活力較高的原生質(zhì)體,以期促進紫菜遺傳育種方面的研究進展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

條斑紫菜 葉片長2～5 cm,青島第三海水浴場;瓊膠酶制劑(5000 U/mg、貨號A6306)、纖維素粗酶粉(700 U/g、貨號C2730) 均購于Sigma公司;卡拉膠酶(6.8 U/mL) 由本實驗室假交替單胞菌發(fā)酵制得;消毒海水 采自青島第三海水浴場,經(jīng)過濾除去浮游藻類等固體雜質(zhì)后,再經(jīng)煮沸消毒后冷卻后使用,含鹽量為31.54‰。

TDL-5-A臺式離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠;SHZ-82(A)回旋式水浴恒溫振蕩器 金壇市科技儀器有限公司;OLYMPUS生物化學(xué)顯微鏡CHC-212-W 上海巴玖實業(yè)有限公司;Qi3536血細(xì)胞計數(shù)器 上海熙揚儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫菜材料的前處理 將條斑紫菜在良好的通風(fēng)狀態(tài)下陰干,在其含水量在30%左右時冷凍保存于-20 ℃;實驗時提前將室溫解凍復(fù)蘇后的紫菜切成不超過2 mm×2 mm的小塊,備用。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 酶解溫度對紫菜原生質(zhì)體制備的影響 將0.5 g處理好的紫菜樣品置于100 mL的三角瓶中,加入86.77 U/mL的瓊膠酶10 mL和3%(M/M,相對于紫菜質(zhì)量)的纖維素酶,分別在22、24、26、28、30、32 ℃搖床中,以100 r/min的轉(zhuǎn)速進行避光酶解120 min,測定其原生質(zhì)體數(shù)以確定最適酶解溫度。

1.2.2.2 加酶量對紫菜原生質(zhì)體制備的影響 在最適酶解溫度28 ℃下,以不同的加酶量(復(fù)合酶液組分參照1.2.2.1)設(shè)計2、4、6、8、10、12、14 mL的梯度,加酶量低于14 mL的以消毒海水補至14 mL,分別對0.5 g處理好的紫菜樣品進行酶解,測定其原生質(zhì)體數(shù)以確定加酶量。

1.2.2.3 酶解時間對紫菜原生質(zhì)體制備的影響 在酶解溫度28 ℃,加酶量12 mL條件下進行酶解,酶解時間分別為30、60、90、120、180 min,通過測定原生質(zhì)體數(shù)以確定最適酶解反應(yīng)時間。

1.2.2.4 轉(zhuǎn)速對紫菜原生質(zhì)體制備的影響 在酶解溫度28 ℃,加酶量12 mL,酶解時間100 min條件下,將搖床轉(zhuǎn)速設(shè)計成50、75、100、125、150、175、200 r/min的梯度,進行酶解實驗,通過測定原生質(zhì)體數(shù)以選出最適的搖床轉(zhuǎn)速。

1.2.2.5 卡拉膠酶對紫菜原生質(zhì)體制備的影響 分別設(shè)計10 mL瓊膠酶+2 mL蒸餾水，10 mL瓊膠酶+2 mL消毒海水與10 mL瓊膠酶+2 mL卡拉膠酶,三組實驗中纖維素酶的含量均為3%,在酶解溫度28 ℃,加酶量12 mL,酶解時間100 min,轉(zhuǎn)速125 r/min的條件下,進行酶解實驗,通過測定原生質(zhì)體數(shù)確定卡拉膠酶對紫菜原生質(zhì)體制備的影響。

1.2.2.6 復(fù)合酶中各組分比率對紫菜原生質(zhì)體制備的影響 參考1.2.2.5單因素實驗中的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)卡拉膠酶對紫菜細(xì)胞的細(xì)胞壁降解作用不明顯,因此復(fù)合酶選用瓊膠酶與纖維素酶組合。在10 mL酶活為 86.77 U/mL瓊膠酶中分別加入1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%的纖維素酶,之后以海水補足12 mL,以設(shè)置不同組分比例的瓊膠酶與纖維素酶復(fù)合酶液。在酶解溫度28 ℃,加酶量12 mL,酶解時間100 min,轉(zhuǎn)速125 r/min的條件下,進行酶解實驗,通過測定原生質(zhì)體數(shù)以確定復(fù)合酶中各組分最適比率。

1.2.2.7 NaCl濃度對紫菜原生質(zhì)體的制備的影響 選用NaCl作為影響因素,考慮其對紫菜原生質(zhì)體滲透壓的影響以及對酶活力的影響,設(shè)計了2%、3%、4%、5%的NaCl梯度,在酶解溫度28 ℃,加酶量12 mL,酶解時間100 min,轉(zhuǎn)速125 r/min,3%纖維素酶的條件下,進行酶解實驗,通過測定原生質(zhì)體數(shù)確定最適NaCl濃度。

1.2.2.8 金屬離子對紫菜原生質(zhì)體制備的影響 已知所有酶中大約三分之一的酶需要金屬離子的存在才能充分發(fā)揮其催化活性[5]。本因素中選取CaC12、FeSO4、MnSO4三種金屬陽離子作為研究方向,分別設(shè)置0、25、50、75、100 mmol/L的濃度梯度,在酶解溫度28 ℃,加酶量12 mL,酶解時間100 min,轉(zhuǎn)速125 r/min,3%纖維素酶、4% NaCl的條件下進行酶解實驗。

1.2.3 正交優(yōu)化試驗 經(jīng)過單因素實驗得到了每個因素的最佳值，正交試驗因素水平如表1所示。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levelstable of orthogonal experiment

在酶解溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速125 r/min、3%纖維素酶的條件下,體積不足的13 mL以消毒海水補至13 mL,按照正交實驗表進行酶解實驗,測定原生質(zhì)體數(shù)。

1.2.4 紫菜原生質(zhì)體數(shù)的計算實驗指標(biāo)的測定均采取三個平行,酶解操作均在避光下進行。酶解結(jié)束后,直接取三角瓶中的酶解液,在顯微鏡下用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞計數(shù)器進行計數(shù)。以1 g紫菜樣品經(jīng)酶解得到的原生質(zhì)體數(shù)作為測定結(jié)果指標(biāo),經(jīng)過美蘭染色活細(xì)胞計數(shù)[13],換算出酶解樣中原生質(zhì)體的數(shù)。

原生質(zhì)體數(shù)=A/5×B×C×25×10000

式中,A為5個中方格中的原生質(zhì)體總數(shù),B為稀釋倍數(shù),C為酶解液的體積。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 酶解溫度對紫菜原生質(zhì)體制備的影響 如圖1所示,酶解溫度為22～28 ℃的范圍內(nèi),紫菜原生質(zhì)體的分離效果隨著酶解溫度的升高而提高;當(dāng)超過28 ℃后,紫菜原生質(zhì)體的總量減少。這是因為,隨著酶解溫度的升高,分離產(chǎn)生的原生質(zhì)體被高溫所破壞,或者是酶解溫度促進酶的催化效率,使其對原生質(zhì)體的進一步降解。有報道稱,分離原生質(zhì)體時的最適酶解溫度以26～30 ℃為宜[14],考慮到瓊膠酶與纖維素酶的最適酶解溫度皆高于32 ℃[15],選擇28 ℃作為原生質(zhì)體酶解制備的酶解溫度。

圖1 酶解溫度對紫菜原生質(zhì)體制備的影響Fig.1 Effect of temperature on the preparation of protoplast of seaweed

2.1.2 加酶量對紫菜原生質(zhì)體制備的影響 由圖2可知,加酶量在0～12 mL范圍內(nèi),隨著加酶量的增加,原生質(zhì)體數(shù)逐步增加;在12 mL時效果最佳;當(dāng)加酶量大于12 mL時,原生質(zhì)體總數(shù)隨著加酶量的增加反而減少。這是因為,隨著加酶量增加,過量的酶進一步與生成的紫菜原生質(zhì)體壁結(jié)合而酶解破壞,使原生質(zhì)體總數(shù)減少。故本實驗選擇的加酶量為12 mL。

圖2 加酶量對紫菜原生質(zhì)體制備的影響Fig.2 Effect of enzyme amount on the preparation of protoplast of seaweed

2.1.3 時間對紫菜原生質(zhì)體制備的影響 由圖3可知,時間對紫菜原生質(zhì)體的分離效果明顯,0～120 min范圍內(nèi),隨著時間的增長原生質(zhì)體數(shù)增大;在100 min原生質(zhì)體數(shù)達到最佳值;而隨著酶解時間的進一步延長,原生質(zhì)體的破壞程度進一步加深,從而使得原生質(zhì)體總數(shù)下降,故選擇酶解時間為100 min。

圖3 酶解時間對紫菜原生質(zhì)體制備的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on the preparation of protoplast of seaweed

2.1.4 轉(zhuǎn)速對紫菜原生質(zhì)體制備的影響 由圖4可知,不同搖床轉(zhuǎn)速下酶解的效果明顯在50～125 r/min范圍內(nèi),隨著轉(zhuǎn)速的增大,復(fù)合酶得以與紫菜細(xì)胞壁充分結(jié)合,加速酶解反應(yīng)效率,從而使得酶解分離的原生質(zhì)體增多;在125 r/min時原生質(zhì)體數(shù)達到最大。當(dāng)轉(zhuǎn)速進一步增大時,原生質(zhì)體總數(shù)急劇減少。這是因為,隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加,剪切力增大,破壞原生質(zhì)體,造成原生質(zhì)體數(shù)量減少。故本實驗選擇的轉(zhuǎn)速為125 r/min。

圖4 轉(zhuǎn)速對紫菜原生質(zhì)體制備的影響Fig.4 Effect of rotating speed on the preparation of protoplast of seaweed

2.1.5 卡拉膠酶對紫菜原生質(zhì)體制備的影響 由圖5所示,卡拉膠酶的有無對紫菜原生質(zhì)體分離效果明顯。纖維素與紫菜多糖是紫菜屬海藻細(xì)胞壁中主要的多糖成分[16],其較紫菜多糖主要分為紫菜膠和瓊膠兩大類[17],故卡拉膠在紫菜細(xì)胞壁中含量極少,卡拉膠酶的酶解效果并不明顯,故出于經(jīng)濟效益與實驗操作的有效性,本實驗中混合酶液不再考慮卡拉膠酶。

圖5 卡拉膠酶對紫菜原生質(zhì)體制備的影響Fig.5 Effect of compound enzyme on the preparation of protoplast of seaweed注:1:不加卡拉膠酶(補加蒸餾水);2:加卡拉膠酶; 3:不加卡拉膠酶(補加消毒海水)。

2.1.6 復(fù)合酶中各組分比例對紫菜原生質(zhì)體制備的影響 由圖6可知,在1.0%～3.0%范圍內(nèi),隨著纖維素酶含量的提高,酶解原生質(zhì)體數(shù)升高;在纖維素酶含量為3.0%處出現(xiàn)拐點;當(dāng)纖維素酶含量大于3.0%時,原生質(zhì)體數(shù)的增長趨勢趨緩,這是因為,酶與底物的結(jié)合程度趨于飽和,酶解反應(yīng)速度增長減緩。綜合各因素考慮,選取3.0%為纖維素含量最適值。

圖6 復(fù)合酶中各組分比例對紫菜原生質(zhì)體制備的影響Fig.6 Effect of components ratio of complex enzyme on the preparation of protoplast of seaweed

2.1.7 NaCl濃度對紫菜原生質(zhì)體的制備的影響 由圖7可知,在NaCl濃度為4%的條件下,酶解得到原生質(zhì)體數(shù)最多,可能是因為,隨著NaCl濃度的增加,反應(yīng)體系滲透壓變大,有利于原生質(zhì)體的穩(wěn)定性,減少了分離的原生質(zhì)體的損失;而NaCl濃度的進一步增大可能對酶的活力有所抑制,從而導(dǎo)致過高鹽度下酶解效果的不佳,故NaCl濃度過大過小都會直接影響體系中滲透壓的大小,影響紫菜原生質(zhì)體制備，故本實驗選擇的NaCl濃度為4%。

圖7 NaCl濃度對紫菜原生質(zhì)體制備的影響Fig.7 Effect of compound enzyme on the preparation of protoplast of seaweed

2.1.8 金屬離子對紫菜原生質(zhì)體的制備的影響 如8所示,金屬離子Mn2+、Fe2+、Ca2+的存在對酶活力有所抑制,其中Ca2+的抑制作用最為突出,可能是因為金屬離子與酶的結(jié)合,改變了空間構(gòu)象影響到酶的生物催化活性[18]，這與報道分析所認(rèn)為的瓊膠酶的三維結(jié)構(gòu)與催化特性使其對這三種金屬離子具有非依賴性的結(jié)果相一致。同時發(fā)現(xiàn),金屬離子對瓊膠酶具有抑制作用,且加酶量的增加會造成分離原生質(zhì)體的破壞,故應(yīng)減少金屬離子對原生質(zhì)體的制備造成的不利影響[19-21]。

圖8 金屬離子對紫菜原生質(zhì)體制備的影響Fig.8 Metal ions on the impact of laver protoplast formation

2.2 正交優(yōu)化試驗

通過極差(表2)與方差(表3)分析結(jié)果可知,各因素對紫菜原生質(zhì)體制備的影響的主次順序為C>B>A>D,即NaCl濃度>酶解時間>加酶量>空白,且NaCl濃度(p<0.05)、酶解時間(p<0.01)對其影響顯著,加酶量(p>0.05)無顯著影響。通過分析四個因素的均值得知,最佳的組合為A2B2C3,即加酶量12 mL,酶解100 min,NaCl濃度為4%。因此得到紫菜原生質(zhì)體的最佳條件為:酶解時間28 ℃,轉(zhuǎn)速125 r/min,3.0%纖維素酶,NaCl濃度4%,加酶12 mL,酶解時間100 min。

表2 紫菜原生質(zhì)體酶解正交實驗結(jié)果分析Table 2 Analysis of laver protoplast digestion orthogonal experiment

表3 正交試驗方差分析Table 3 Analysis of orthogonal test variance

因正交試驗的最優(yōu)組合并未出現(xiàn)在正交試驗中,為進一步考察上述優(yōu)選工藝的穩(wěn)定性,按上述優(yōu)化條件A2B2C3進行重復(fù)三次實驗,結(jié)果為(16.88±0.22)×106個/g,均高于正交試驗最高值,所以說明選擇A2B2C3為最優(yōu)組合,同時也表明此工藝具有較好的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

紫菜細(xì)胞壁中含有瓊膠、纖維素,需要專一性水解多糖的工具酶,本研究所用的酶制劑可以專一高效的作用于紫菜細(xì)胞壁。實驗發(fā)現(xiàn)復(fù)合酶的水解效果要遠高遠單一酶的水解效果,故本研究在單因素實驗的基礎(chǔ)上,選取加酶量、酶解100 min與NaCl濃度三個因素進行正交試驗,進一步得出復(fù)合酶液法高效制備紫菜原生質(zhì)體的最佳工藝,即4% NaCl濃度,酶解時間100 min,加酶量12 mL,酶解溫度28 ℃,轉(zhuǎn)速125 r/min,3%纖維素酶,且在最優(yōu)工藝條件下酶法制備的原生質(zhì)體數(shù)達(16.88±0.22)×106個/g。復(fù)合酶法反應(yīng)條件溫和、操作簡單,同時可以高效制備高存活率的原生質(zhì)體,為紫菜育種、原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交等研究工作奠定基礎(chǔ)。