李晨霞,梁 晶,孫麗慧

(大連理工大學(xué)食品與環(huán)境學(xué)院,遼寧盤錦 124221)

γ-聚谷氨酸(γ-glutamic acid,簡(jiǎn)稱γ-PGA),是由D-谷氨酸和L-谷氨酸單體，通過γ-酰胺鍵連接而成的一類均聚氨基酸[1],最先發(fā)現(xiàn)于炭疽桿菌的莢膜中[2]。γ-PGA是一種水溶性、可被生物降解、不含毒性的大分子聚合物,其分子鏈上大量游離的羧基,使其具有羧基聚合物的普遍性質(zhì)。此外,大量活性位點(diǎn)使它便于進(jìn)行材料的功能化[3-4]。聚谷氨酸的應(yīng)用范圍十分廣泛,分為化妝品級(jí)、食品級(jí)、藥品級(jí)、水處理級(jí)、土壤、植物調(diào)節(jié)劑級(jí)等[5-6]。尤其在注重環(huán)保、強(qiáng)調(diào)可持續(xù)發(fā)展的社會(huì)大環(huán)境下,由生物合成的可降解功能型材料γ-PGA,正日益受到人們的關(guān)注,逐漸地應(yīng)用于醫(yī)藥制造[7]、食品加工、果蔬產(chǎn)品、海產(chǎn)品的防凍和保鮮,以及化妝品工業(yè)及植物種子保護(hù)等許多領(lǐng)域,是一種開發(fā)價(jià)值大、應(yīng)用前景廣闊的多功能新型生物材料[8],具有重要的研究?jī)r(jià)值。

目前合成γ-PGA的方法有化學(xué)合成法和生物合成法[9-10]。利用微生物發(fā)酵合成γ-PGA具有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn),例如:經(jīng)濟(jì)高效、對(duì)環(huán)境污染小、反應(yīng)條件溫和等。在γ-PGA的微生物發(fā)酵生產(chǎn)中,培養(yǎng)基的組成以及對(duì)發(fā)酵條件的控制都會(huì)顯著影響γ-PGA的分子結(jié)構(gòu)組成、相對(duì)分子量以及產(chǎn)率。盡管國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者已經(jīng)在發(fā)酵法生產(chǎn)γ-PGA上取得了很多的研究成果,但目前研究中仍存在著一些不足之處,或是底物谷氨酸鈉的利用率低;或是發(fā)酵產(chǎn)量比較低,這些問題都不利于γ-PGA的工業(yè)化生產(chǎn)。

本文從豆腐作坊周邊的土地取樣,篩選獲得一株高產(chǎn)γ-PGA的暹羅芽孢桿菌,并通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,提高了γ-PGA的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率,為發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA的工業(yè)化提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

土樣品 遼寧省某村莊豆腐作坊周邊的土壤取樣,表層土,下挖5 cm和10 cm的土;PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的試劑盒、PCR裂解液 寶生物工程(大連)有限公司;革蘭氏染色液試劑盒 青島海博生物技術(shù)有限公司;牛肉膏、胰蛋白胨、酵母膏、瓊脂、D-甘露糖、D-核糖、L-鼠李糖 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;味精(谷氨酸鈉含量≥99%) 紅梅味精有限公司;玉米漿 實(shí)驗(yàn)室自制;其他試劑 均為分析純。

梅里埃VITEK 2 COMPACT全自動(dòng)微生物鑒定儀 法國(guó)梅里埃公司;麥?zhǔn)媳葷醿x 法國(guó)梅里埃公司;SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;HPX-9272MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;ZWY-1102C恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 重慶東悅儀器有限公司;光學(xué)顯微鏡 寧波永新光學(xué)股份有限公司;SBA-40C生物傳感分析儀 山東省科學(xué)院生物研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 分離平板培養(yǎng)基(g/L):Na3C6H5O716,C5H8NO4Na 40,NH4Cl 7,K2HPO40.5,MgSO40.5,CaCl20.16,MnSO40.104,FeCl30.104,酵母膏5,瓊脂20,甘油16,pH7.0～7.4,115 ℃滅菌20 min;液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):C5H8NO4Na 80,NH4Cl 7,MgSO40.5,K2HPO40.5,MnSO40.104,CaCl20.05,葡萄糖45,胰蛋白胨40,酵母膏20,pH7.0,115 ℃滅菌20 min;種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10,蛋白胨10,酵母膏5,NaCl 5,pH7.0,115 ℃滅菌20 min。

1.2.2 菌株的篩選 取適量土樣加入30 mL無菌水中,充分振蕩后靜置2 h,取上層清液100 μL,與900 μL無菌水混合均勻,按此方法進(jìn)行濃度梯度稀釋,選擇進(jìn)行涂布的稀釋度為10-4、10-5、10-6、10-7,每個(gè)稀釋度涂3個(gè)平板作為平行,每個(gè)平板接種200 μL,37 ℃培養(yǎng)24 h。待平板長(zhǎng)出菌落,對(duì)長(zhǎng)勢(shì)較好的單菌落進(jìn)行編號(hào),依次接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,37 ℃,220 r/min培養(yǎng)36 h。參照文獻(xiàn)[11]的方法測(cè)定γ-PGA的產(chǎn)量,檢測(cè)發(fā)酵液中γ-PGA的含量,選取γ-PGA含量最高的菌株，進(jìn)行進(jìn)一步純化至純種并保藏,以待后續(xù)研究。

1.2.3 菌株的保藏 按2%的接種量[9],將上述發(fā)酵液接種至種子培養(yǎng)基中,37 ℃,220 r/min培養(yǎng)18 h。將種子培養(yǎng)基與40%的甘油1∶1混合,于-20 ℃冷凍保藏。

1.2.4 菌株鑒定

1.2.4.1 菌落形態(tài)觀察 用肉眼觀察分離平板培養(yǎng)基上的菌落形態(tài),然后挑取少量菌落于載玻片進(jìn)行革蘭氏染色,用油鏡觀察。

1.2.4.2 分子生物學(xué)鑒定 16S rDNA序列擴(kuò)增與分析 挑取培養(yǎng)基上的菌體于50 μL TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR(Code No.9164)中變性后離心(12000×g 4 ℃,30 min)取上清作為模板,反應(yīng)條件:80 ℃,15 min;然后使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(Code No.RR176)進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后,切膠回收目的片段,由寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行測(cè)序,通過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)在線BLAST系統(tǒng)進(jìn)行序列比對(duì),以確定種屬。

系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建:使用BLAST將16S rDNA測(cè)序結(jié)果在NCBI(http://www.ncbi.nlm nih.gov/)上比對(duì),在比對(duì)結(jié)果中選擇模式菌株,據(jù)同源性搜索結(jié)果,使用MEGA 5.0生物學(xué)軟件,對(duì)測(cè)試菌株和相關(guān)菌株的多個(gè)序列進(jìn)行比對(duì)分析及Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4.3 生理生化鑒定 挑取純化的菌株加至3 mL生理鹽水中,振蕩混勻后，利用麥?zhǔn)媳葷醿x測(cè)定菌懸液濁度達(dá)到1.80-2.20麥?zhǔn)蠞舛?按照BCL芽孢桿菌鑒定卡的操作說明書，進(jìn)行VITEK 2 COMPACT全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)分析。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 分別以葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉、果糖為碳源,每種碳源的加入量為40 g/L;分別以牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、玉米漿、酵母膏為氮源,每種氮源的加入量為40 g/L,于37 ℃、pH7.0,220 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)36 h,考察不同碳、氮源對(duì)γ-PGA轉(zhuǎn)化率的影響。接著分別探究最適碳、氮源的濃度在30、35、40、45、50、55、60、65、70 g/L時(shí),于37 ℃、pH7.0,220 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)36 h,考察γ-PGA的轉(zhuǎn)化率的變化。以溫度(25、30、35、40、45 ℃),pH7.0,轉(zhuǎn)速220 r/min;pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0),溫度 37 ℃,轉(zhuǎn)速220 r/min;轉(zhuǎn)速(160、180、200、220、240 r/min),溫度37 ℃,pH7.0,于1.2.1的液體發(fā)酵培養(yǎng)基,振蕩培養(yǎng)36 h,測(cè)定其γ-PGA的產(chǎn)量,考察溫度、pH、轉(zhuǎn)速對(duì)γ-PGA的產(chǎn)量的影響。以底物谷氨酸鈉濃度(20、30、40、50、60 g/L),其余均與1.2.1所示的液體發(fā)酵培養(yǎng)基相同,溫度37 ℃,pH7.0,轉(zhuǎn)速220 r/min振蕩培養(yǎng)36 h,考察底物濃度對(duì)γ-PGA轉(zhuǎn)化率的影響。按1.2.2所述方法測(cè)得γ-PGA的產(chǎn)量,采用下列方程計(jì)算轉(zhuǎn)化率。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

γ-PGA轉(zhuǎn)化率(%)=發(fā)酵液γ-PGA質(zhì)量濃度(g/L)/底物質(zhì)量濃度(g/L)×100

1.2.6 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取溫度、pH、轉(zhuǎn)速及底物濃度這四個(gè)因素作為多因素交叉組合實(shí)驗(yàn)的考察因素,以γ-PGA的產(chǎn)量作為響應(yīng)值,利用響應(yīng)面中的Box-Behnken Design方法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)組合的因素水平編碼見表1。

表1 Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.3 數(shù)據(jù)處理

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Design-Expert 8.0 軟件進(jìn)行分析處理,采用origin Pro 8.0進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)γ-PGA菌株的篩選

利用分離平板培養(yǎng)基共檢出12個(gè)菌株,通過觀察菌落形態(tài),初步確定這些菌株為芽孢桿菌。將上述獲得的菌株分別進(jìn)行搖瓶培養(yǎng),發(fā)酵條件為37 ℃,220 r/min,培養(yǎng)36 h,利用參考文獻(xiàn)[11]所示方法，檢測(cè)發(fā)酵液中γ-PGA的含量,結(jié)果如表2所示。

由表2可知,不同芽孢桿菌產(chǎn)γ-PGA的能力不同,從表層土中篩選出的菌株(以B開頭的編號(hào))產(chǎn)γ-PGA的能力要明顯好于從下挖5 cm(以X5開頭的編號(hào)),下挖10 cm(以X10開頭的編號(hào))的土樣中篩選出的菌株,菌株B-6578產(chǎn)γ-PGA的能力相對(duì)較高,達(dá)到17.53 g/L,因此將其進(jìn)一步分離純化,保藏待用。

表2 不同發(fā)酵液中γ-PGA含量比較結(jié)果Table 2 Comparison of γ-PGA production after fermentation by different bacillus

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察 將菌株B-6578在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)36 h后,菌株在平板上的單菌落呈圓形,隆起,表面有褶皺,濕潤(rùn),不透明,邊緣不齊,顏色為淡黃色(圖1a),革蘭氏染色鑒定為陽性菌(圖1b),呈桿狀。

圖1 菌株B-6578菌落形態(tài)(a)和革蘭氏染色鏡檢結(jié)果(b)Fig.1 Colony morphology(a)and Gram-stain microscopic examination(b)of strain B-6578

2.2.2 菌株16S rDNA序列分析 以菌株基因組DNA為模板，經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,目的片段大約為1500 bp,將PCR產(chǎn)物回收純化后測(cè)序,確定該片段實(shí)際長(zhǎng)度為1513 bp。該序列已提交Genbank,登記號(hào)為MG066538。將該序列在NCBI中Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn),菌株與暹羅芽孢桿菌(Bacillussiamensis),解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens),地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)的同源性極高,序列相似性達(dá)到99%。使用分子軟件MEGA 5.0對(duì)B-6578相似度較高的菌株進(jìn)行多序列比對(duì)分析,并利用Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。由圖可以看出,芽孢桿菌B-6578與暹羅芽孢桿菌(Bacillussiamensis)同源性最高,結(jié)合生理生化鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表3),鑒定為暹羅芽孢桿菌。

圖2 芽孢桿菌B-6578基于16S rDNA序列及Neighbor-Joining法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of bacillus strain B-6578 using neighbor-joining based on 16S rDNA

表3 菌株B-6578生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定結(jié)果Table 3 Identification results of physiological and biochemical test of strain B-6578

暹羅芽孢桿菌對(duì)禾谷鐮刀菌有很好的拮抗作用,禾谷鐮刀菌可引起小麥赤霉病,導(dǎo)致小麥產(chǎn)量的大幅降低和品質(zhì)的嚴(yán)重?fù)p失。因此,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,暹羅芽孢桿菌可提高植株抗病能力[14-16]。更為重要的是,尚未見該菌株在γ-PGA生產(chǎn)領(lǐng)域的相關(guān)報(bào)道,因此,本文對(duì)暹羅芽孢桿菌產(chǎn)γ-PGA的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 不同碳源對(duì)發(fā)酵的影響 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,分別以40 g/L葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉、果糖作為碳源,考察不同碳源對(duì)發(fā)酵的影響(圖3)?？傮w來看,菌體利用淀粉、蔗糖的能力較差,生長(zhǎng)受到一定程度的抑制;葡萄糖、麥芽糖、果糖均顯示了較好的γ-PGA的生產(chǎn)性,綜合考慮生產(chǎn)成本和原料來源這兩個(gè)因素[18-19],選擇葡萄糖為最佳碳源。進(jìn)一步研究初始葡萄糖濃度為30～70 g/L對(duì)發(fā)酵的影響(圖4)。結(jié)果顯示,隨著葡萄糖濃度的增加,發(fā)酵液中γ-PGA的終濃度逐漸增加。而在初始葡萄糖濃度為45 g/L時(shí),γ-PGA的轉(zhuǎn)化率最高,而后,隨著初始葡萄糖濃度的增加,γ-PGA的轉(zhuǎn)化率反而出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。這可能是由于在高濃度糖基質(zhì)中,發(fā)酵液滲透壓增加,從而對(duì)菌體生長(zhǎng)及其代謝造成一定的抑制作用。因此為了獲得較高的γ-PGA轉(zhuǎn)化率,避免高糖濃度對(duì)微生物造成的抑制作用,考慮選擇發(fā)酵初始葡萄糖濃度為45 g/L,進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

圖3 碳源種類對(duì)發(fā)酵γ-PGA的影響Fig.3 Effects of different carbon sources on the fermentation γ-PGA

圖4 葡萄糖濃度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA的影響Fig.4 Effects of different glucose concentrations on the production of γ-PGA

2.3.2 不同氮源對(duì)發(fā)酵的影響 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,分別以40 g/L的牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、玉米漿[10]、酵母膏作為氮源,考慮氮源種類對(duì)發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA的影響(圖5)。從圖5中可以看出,胰蛋白胨和酵母膏的γ-PGA的轉(zhuǎn)化率明顯高于其他氮源,這可能是因?yàn)橐鹊鞍纂撕徒湍父嘀邪被暮烤笥?%,可以滿足微生物生長(zhǎng)和代謝的需要。因此,采用胰蛋白胨與酵母膏2∶1的復(fù)合氮源進(jìn)行發(fā)酵[20-21],有利于芽孢桿菌的生長(zhǎng)。進(jìn)一步研究當(dāng)該復(fù)合氮源初始濃度為30～70 g/L對(duì)發(fā)酵的影響(圖6),結(jié)果顯示,初始復(fù)合氮源濃度為40 g/L時(shí),γ-PGA的轉(zhuǎn)化率最高,因此,以胰蛋白胨和酵母膏的比為2∶1的復(fù)合氮源的最適濃度為40 g/L。

圖5 氮源種類對(duì)發(fā)酵γ-PGA的影響Fig.5 Effects of different nitrogen sources on the fermentation γ-PGA

圖6 復(fù)合氮源不同濃度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA的影響Fig.6 Effect of different compound nitrogen source concentrations on the production of γ-PGA

2.3.3 溫度對(duì)發(fā)酵的影響 溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA的影響結(jié)果如圖7所示?？梢?當(dāng)溫度為35 ℃時(shí),芽孢桿菌B-6578合成γ-PGA的產(chǎn)量最高,為20.39 g/L。溫度過高或過低不僅對(duì)菌株的正常生長(zhǎng)有影響,而且發(fā)生反應(yīng)所需要的酶在高溫下失活,在低溫下活性受到較大的抑制,從而導(dǎo)致γ-PGA的產(chǎn)量降低。而梁金鐘等[22]在利用枯草芽孢桿菌時(shí)發(fā)現(xiàn)，菌株在37 ℃時(shí),γ-PGA的產(chǎn)量最高,與本文的結(jié)果基本相近。因此,本研究選擇35 ℃作為進(jìn)一步發(fā)酵培養(yǎng)的溫度。

圖7 溫度對(duì)B-6578合成γ-PGA的影響Fig.7 Effect of temperature on γ-PGA production from bacillus strain B-6578

2.3.4 pH對(duì)發(fā)酵的影響 適宜的pH是菌株生長(zhǎng)的必要條件,更重要的是會(huì)影響菌株的代謝途徑,從而起到調(diào)控代謝的作用。通過對(duì)pH優(yōu)化發(fā)現(xiàn)(圖8),隨著初始pH的不斷增加,芽孢桿菌B-6578合成γ-PGA的量也在不斷增加,當(dāng)初始pH達(dá)到7時(shí),產(chǎn)量最大,為17.28 g/L,之后隨著初始pH的繼續(xù)增加,γ-PGA的產(chǎn)量卻逐漸降低。另外,該菌株在pH為6～8時(shí),能保持較好的生長(zhǎng),而任尚美等[10]和Feng等[23]結(jié)果均表明，pH為7時(shí),γ-PGA的產(chǎn)量最高,與本文結(jié)果相符。因此,選擇pH為7作為進(jìn)一步發(fā)酵的pH。

圖8 pH對(duì)B-6578合成γ-PGA的影響Fig.8 Effect of pH on γ-PGA production from bacillus strain B-6578

2.3.5 轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵的影響 搖床的轉(zhuǎn)速和裝液量影響著發(fā)酵液中溶解氧的含量,這對(duì)于好氧微生物的發(fā)酵是一個(gè)重要因素,產(chǎn)γ-PGA的暹羅芽孢桿菌是好氧菌,且在γ-PGA這種高黏度的發(fā)酵體系中尤為突出,γ-PGA的產(chǎn)量與氧的傳遞和料液的氧密度緊密相關(guān),當(dāng)裝液量為50 mL/250 mL時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)量最高[24]。

通過對(duì)轉(zhuǎn)速的研究發(fā)現(xiàn)(圖9),當(dāng)轉(zhuǎn)速大于200 r/min時(shí),γ-PGA的產(chǎn)量較高,轉(zhuǎn)速較低時(shí),由于發(fā)酵液的黏度較高,含氧量低,不利于菌株的生長(zhǎng),γ-PGA的產(chǎn)量也就較低。因此,選擇轉(zhuǎn)速200 r/min進(jìn)行進(jìn)一步發(fā)酵。

圖9 轉(zhuǎn)速對(duì)B-6578合成γ-PGA的影響Fig.9 Effect of rotational speed on γ-PGA production from bacillus strain B-6578

2.3.6 底物濃度對(duì)發(fā)酵的影響 底物谷氨酸鈉對(duì)γ-PGA合成的影響如圖10,可以看出,隨著谷氨酸鈉濃度的增大,γ-PGA的轉(zhuǎn)化率也逐漸增大,當(dāng)谷氨酸鈉濃度變?yōu)?0 g/L時(shí),γ-PGA的轉(zhuǎn)化率最大,為44.78%,之后隨著谷氨酸鈉濃度的繼續(xù)增大,γ-PGA的轉(zhuǎn)化率反而出現(xiàn)下降?？梢?底物濃度過高時(shí),可能會(huì)降低參與反應(yīng)的酶活,從而導(dǎo)致實(shí)際轉(zhuǎn)化率降低[25]。在芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA的途徑中,作為底物的谷氨酸鈉的濃度至關(guān)重要。濃度過低,菌株不能充分發(fā)揮催化轉(zhuǎn)化的能力,濃度過高則會(huì)造成轉(zhuǎn)化率低,使成本增加。任尚美等[10]通過正交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),谷氨酸鈉用量對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響最大。因此,選擇谷氨酸鈉的濃度為40 g/L進(jìn)行進(jìn)一步發(fā)酵。

圖10 底物濃度對(duì)B-6578合成γ-PGA的影響Fig.10 Effect of substrate concentration on γ-PGA production from bacillus strain B-6578

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化芽孢桿菌B-6578合成γ-PGA條件

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken 中心組合設(shè)計(jì)原理,選擇溫度、pH、轉(zhuǎn)速、底物濃度為優(yōu)化參數(shù),以產(chǎn)量為響應(yīng)值,對(duì)芽孢桿菌B-6578發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA實(shí)驗(yàn)進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面設(shè)計(jì),結(jié)果見表4。采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合,回歸結(jié)果與方差分析見表5,得到目標(biāo)響應(yīng)值與各因素關(guān)系的二階經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?

表4 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Experiment design and results of Box-Behnken response surface

表5 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)方差分析Table 5 Variance analysis of Box-Behnken experiment

R1=26.14-0.64A+1.32B+1.67C+4.76D-0.23AB+0.34AC-1.20AD+1.17BC+3.62BD+0.36CD-6.56A2-9.74B2-5.18C2-4.52D2

式中:R1為γ-PGA的產(chǎn)量(g/L),A、B、C、D分別為溫度(℃),pH,轉(zhuǎn)速(r/min),底物濃度(g/L)。

2.4.2 各因素交互作用分析 通過Design-Expert 8.0.6軟件繪制響應(yīng)面圖及等高線圖(圖11～圖16),等高線圖可以直觀的反映各因素之間交互作用的強(qiáng)弱,橢圓表示兩因素交互作用明顯,而圓形則表示交互作用較小或沒有交互作用[12-13]?？梢?隨著各因素水平的升高,γ-PGA的產(chǎn)量先增加后減少,底物濃度和pH之間的交互作用如圖12所示,響應(yīng)面曲面的坡度陡峭,等高線呈橢圓形,說明產(chǎn)量對(duì)底物濃度和pH的變化比較敏感,底物濃度和pH之間交互作用較強(qiáng),對(duì)產(chǎn)量的影響顯著(p=0.0245<0.05)。而底物濃度和溫度、pH和溫度、轉(zhuǎn)速和溫度、轉(zhuǎn)速和pH、底物濃度和轉(zhuǎn)速之間的交互作用如圖11、13、14、15、16所示,響應(yīng)面的坡度較為平緩,等高線近似圓形,所以底物濃度和溫度、pH和溫度、轉(zhuǎn)速和溫度、轉(zhuǎn)速和pH、底物濃度和轉(zhuǎn)速之間的交互作用較弱,但也對(duì)芽孢桿菌B-6578產(chǎn)γ-PGA具有一定的影響。

圖11 底物濃度和溫度對(duì)芽孢桿菌 B-6578發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA的影響Fig.11 Effect of substrate concentration and temperature on γ-PGA production from bacillus strain B-6578

圖12 底物濃度和pH對(duì)芽孢桿菌 B-6578發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA的影響Fig.12 Effect of substrate concentration and pH on γ-PGA production from bacillus strain B-6578

圖13 pH和溫度對(duì)芽孢桿菌 B-6578發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA的影響Fig.13 Effect of pH and temperature on γ-PGA production from bacillus strain B-6578

圖14 轉(zhuǎn)速和溫度對(duì)芽孢桿菌 B-6578發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA的影響Fig.14 Effect of rotational speed and temperature on γ-PGA production from bacillus strain B-6578

圖15 轉(zhuǎn)速和pH對(duì)芽孢桿菌 B-6578發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA的影響Fig.15 Effect of rotational speed and pH on γ-PGA production from bacillus strain B-6578

圖16 底物濃度和轉(zhuǎn)速對(duì)芽孢桿菌 B-6578發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA的影響Fig.16 Effect of substrate concentration and rotational speed on γ-PGA production from bacillus strain B-6578

2.4.3 最優(yōu)發(fā)酵條件及驗(yàn)證 結(jié)合響應(yīng)值與各因素關(guān)系的二階經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ图叭S響應(yīng)面圖,確定溫度、pH、轉(zhuǎn)速、底物濃度的最佳優(yōu)化水平分別為37.5 ℃、pH7.48、240 r/min、52.70 g/L,預(yù)測(cè)γ-PGA的產(chǎn)量為23.96 g/L,采用該優(yōu)化發(fā)酵條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn),得到實(shí)際γ-PGA的產(chǎn)量為24.82 g/L(實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,SD=0.1068)。γ-PGA的轉(zhuǎn)化率為47.10%,比優(yōu)化前提高了25.19%。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從豆腐作坊周邊的表層土中篩選出一株產(chǎn)γ-PGA的菌株,通過菌落形態(tài)和分子生物學(xué)分析,可確定該菌株為暹羅芽孢桿菌。本實(shí)驗(yàn)所采用的菌株B-6578,初始γ-PGA的產(chǎn)量為17.53 g/L,γ-PGA的轉(zhuǎn)化率為21.91%,通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化,采用溫度37.5 ℃,pH7.48,轉(zhuǎn)速240 r/min,底物谷氨酸鈉濃度52.70 g/L的條件,測(cè)得γ-PGA的產(chǎn)量為24.82 g/L,該結(jié)果與模型預(yù)測(cè)的結(jié)果吻合較好,因此,優(yōu)化后γ-PGA的轉(zhuǎn)化率為47.10%,比優(yōu)化前提高了25.19%。