魏旭青,段長平,3,劉連利,徐姝穎,李秋瑩,孫 彤,*,勵建榮,*

(1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧錦州 121013; 2.生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013; 3.中核四〇四有限公司,甘肅蘭州 730000; 4.渤海大學(xué)實(shí)驗(yàn)管理中心,遼寧錦州 121013)

在食品、印染及其它工業(yè)生產(chǎn)中,生物被膜會引起食品品質(zhì)及生產(chǎn)設(shè)備損傷[1-3]。研究發(fā)現(xiàn),生物被膜可導(dǎo)致細(xì)菌病原體的持續(xù)生長及食品的交叉感染[4-5],其污染的產(chǎn)品會引發(fā)疾病,危害人體健康[6-8]。同時,生物被膜可粘附于食品、食品加工設(shè)備及食品貯藏容器的表面[9],造成食品腐敗、設(shè)備表面受損及運(yùn)轉(zhuǎn)能耗增加[10-11]。由于生物被膜具有復(fù)雜的內(nèi)部環(huán)境,雖然表面的細(xì)菌易被抗生素殺死,但被膜細(xì)菌卻對抗生素不敏感,增加了抗生素的殺菌難度,從而降低其抗菌、殺菌作用[12-15]。因此,如何有效抑制材料表面生物被膜的形成及生長，成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。

目前應(yīng)用較多的無機(jī)抗菌材料包括銀系抗菌材料[16-17]、TiO2光催化抗菌材料[18-19]、載銅抗菌材料[20]等。ZnO作為一種無機(jī)抗菌材料,具有活性高、穩(wěn)定性好的特點(diǎn),同時具有良好的抑菌能力,已應(yīng)用于多個行業(yè)[21]。制備ZnO的液相方法主要有直接沉淀法[22-23]、水熱合成法[24-25]、溶膠凝膠法[26-27]等。其中,水熱合成法因其工藝簡單、顆粒形態(tài)尺寸可控及易于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化而被廣泛應(yīng)用[28-29]。研究表明,納米ZnO對細(xì)菌生物被膜的形成和生長均具有抑制性能[28-30]。Shams等[29]發(fā)現(xiàn)，ZnO納米粒子可以抑制口腔致病菌的生物膜形成,其釋放出的Zn2+和產(chǎn)生的活性氧可以破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜,從而達(dá)到殺菌的目的。同時,Rajendra等[30]發(fā)現(xiàn)ZnO納米粒子可以抑制銅綠假單胞菌生物被膜的形成。

腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)是冷藏海水魚類的優(yōu)勢腐敗菌,具有較強(qiáng)的致腐活性[31],能粘附于食品及容器表面，形成生物被膜[32],從而使食品腐敗加劇。因此,本實(shí)驗(yàn)選用腐敗希瓦氏菌為抑菌對象。由于ZnO納米粒子的微觀形貌影響其抑制生物被膜的性能[33-35],本文為獲得具有不同微觀結(jié)構(gòu)的ZnO薄膜,以陽極氧化法制備的多孔鈦片為基底,在真空輔助條件下,采用水熱合成法制備納米ZnO薄膜,研究水熱反應(yīng)時間對ZnO薄膜微觀結(jié)構(gòu)及其對腐敗希瓦氏菌生物被膜抑制性能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

腐敗希瓦氏菌(ATCC8071) 美國微生物菌種保藏中心,實(shí)驗(yàn)室保藏;LB肉湯、LB營養(yǎng)瓊脂 以上合成培養(yǎng)基均購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;實(shí)驗(yàn)所用試劑 均為分析純(AR);0.2 mm厚的高純鈦箔(99.99%) 清河縣佳潤金屬材料有限公司;3 mm厚高純石墨片 天津亞達(dá)電機(jī)配件廠。

WU800型角磨機(jī) 寶時得機(jī)械(中國)有限公司;SK8210HP型超聲波清洗器 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司;MS605D型直流穩(wěn)壓電源 東莞市邁豪電子科技有限公司;DF-Ⅱ型集熱式磁力加熱攪拌器 江蘇省榮華儀器制造有限公司;LDZX-50FBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;LRH型系列生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;SW-CJ-2FD型潔凈工作臺 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;PL602-L型電子天平 梅特勒-托利儀器有限公司;Rigaku Ultima IV型X射線粉末衍射儀 日本理學(xué)公司;S-4800型場發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本日立公司;OCA15EC型接觸角測量儀 北京東方德菲儀器有限公司;Victor X3型酶標(biāo)儀 上海珀金埃爾默儀器有限公司。

1.2 多孔鈦片及其表面ZnO薄膜的制備和表征

1.2.1 陽極氧化法制備多孔鈦片 以鈦片為陽極,等面積石墨為陰極,在電極間距4.0 cm,電壓40.0 V條件下，于0.4%(V/V)氫氟酸(HF)電解液中，采用陽極氧化法處理鈦片60 min,分別用去離子水、乙醇清洗,120 ℃烘干 2 h,得孔徑約為50 nm的多孔鈦片[36]。

1.2.2 水熱合成法制備ZnO薄膜 將0.3 mol/L的Zn(CH3COO)2溶液和同濃度鹽酸羥胺溶液等體積混合后,加入0.1% wt的六偏磷酸鈉作為表面活性劑。在真空度為0.08 MPa條件下,將3 cm×1 cm多孔鈦片置于上述溶液中,浸漬20 min后轉(zhuǎn)入高壓反應(yīng)釜中,填充率80%,150 ℃反應(yīng)2、12和24 h,自然冷卻后取出,室溫陳化24 h,100 ℃干燥12 h,480 ℃煅燒2 h,得ZnO薄膜樣品[37]。

1.3 多孔鈦片及ZnO薄膜材料表征分析

采用X射線粉末衍射儀對樣品進(jìn)行晶型分析(CuKα輻射,40 kV,50 mA,步寬0.02°,掃描速度4 °/min)。采用場發(fā)射掃描電子顯微鏡，對樣品進(jìn)行微觀形貌表征。運(yùn)用切線法,采用接觸角測量儀，測定薄膜的水接觸角。

1.4 材料表面腐敗希瓦氏菌生物被膜附著性能測定

活化后OD值約0.5的腐敗希瓦氏菌的菌懸液按1∶200稀釋,吸取稀釋好的菌懸液1 mL于無菌離心管中,放入基片,即帶有ZnO薄膜的多孔鈦片,28 ℃培養(yǎng)2、4、8、12、24、36和48 h后取出,測定其表面生物被膜的性能指標(biāo)[38]。

1.4.1 鈦片及ZnO表面生物被膜粘附性能及被膜菌生長曲線測定 取出上述基片于無菌離心管中,1 mL 0.9%生理鹽水洗兩次以去除浮游菌,加入1 mL 1.0%結(jié)晶紫染色5 min,1 mL生理鹽水洗2次去除浮色,加入33%(V/V)冰乙酸0.2 mL脫色10 min,吸取脫色后溶液200 μL于96孔板中，用酶標(biāo)儀測定OD595,表征生物被膜的粘附性能。

取上述基片,用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH=7.4,KH2PO40.27 g,Na2HPO41.42 g,NaCl 8 g,KCl 0.2 g,加去離子水定容到1 L)沖洗3次,去除浮游菌,放入10 mL PBS中,于53 kHz、25 ℃條件下超聲處理10 min。梯度稀釋菌懸液,采用平板計數(shù)法測定生物被膜上腐敗希瓦氏菌的菌落數(shù)量,繪制其生長曲線。

1.4.2 生物被膜微觀形貌觀察 上述基片用無菌水沖洗3次,放入4 ℃預(yù)冷的2.5%(V/V)戊二醛中浸泡4 h,取出后分別在30%、50%、70%、90%(V/V)的乙醇中浸泡30 min,在無水乙醇中浸泡兩次,每次30 min,取出后于超凈臺內(nèi)自然風(fēng)干。樣品噴金后,用場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察其微觀形貌。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2007處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),采用Origin8.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 多孔鈦片及ZnO薄膜的表征分析

2.1.1 ZnO薄膜的XRD表征分析 ZnO的晶型和結(jié)晶狀態(tài)影響ZnO薄膜的抗菌性。Shams等[39]發(fā)現(xiàn)納米粒子的形狀影響生物被膜的形成,Dutta等[40]發(fā)現(xiàn)不同的結(jié)晶狀態(tài)影響其抗菌性。與ZnO薄膜同時制備粉體的XRD表征結(jié)果表明,樣品為六方纖鋅礦結(jié)構(gòu)ZnO晶體(JCPDS card No.36-1451),2θ角31.9°、34.5°、36.3°、47.6°、56.7°、62.9°和68.1°處的衍射峰分別對應(yīng)于ZnO晶體的(100)、(002)、(101)、(102)、(110)、(103)和(112)晶面。由圖可見,衍射峰峰形尖銳,說明樣品結(jié)晶度好,無雜相峰,樣品純度高。

圖1 ZnO薄膜的XRD譜圖Fig.1 XRD patterns of the ZnO films

2.1.2 多孔鈦片及ZnO薄膜的SEM表征分析 由圖2可見,經(jīng)陽極氧化處理后,獲得孔徑約50～60 nm均勻排列TiO2孔洞的多孔鈦片(圖2(a)),水熱反應(yīng)2 h得到的薄膜表面ZnO總量較小,且ZnO顆粒首先附著在TiO2多孔膜的孔道頂端及邊緣,并沿著骨架縱向堆積(圖2(b))。說明在水熱反應(yīng)高溫高壓條件下,過飽和的鋅在多孔鈦片孔道頂端的TiO2晶體表面沉積,形成ZnO晶體。水熱反應(yīng)12 h所得的薄膜表面上ZnO密集堆積,附著量明顯增大,在多孔鈦片表面形成一層密集的ZnO薄膜,但表面粗糙,ZnO無序堆積使薄膜分布不均勻(圖2(c))。水熱反應(yīng)24 h所得薄膜表面ZnO有序堆積,附著量繼續(xù)增大,表面ZnO顆粒分布更加均勻(圖2(d))。說明隨著水熱反應(yīng)時間延長,ZnO晶體繼續(xù)沉積,材料表面的孔道被ZnO晶體顆粒充滿。受孔道導(dǎo)向作用的影響,繼續(xù)生長的ZnO晶體沿固定方向有序生長,形成有序、均勻的多層結(jié)構(gòu)。

圖2 多孔鈦片及不同水熱反應(yīng)時間 制備的ZnO薄膜掃描電鏡圖Fig.2 SEM images of the porous titanium sheet and ZnO films prepared after different hydrothermal time注:(a)多孔鈦片;(b)ZnO薄膜2 h;

2.1.3 多孔鈦片及ZnO薄膜表面親疏水性表征分析 根據(jù)檢測的接觸角的大小,可以將測試材料的親疏水性能分為以下三種:接觸角<90゜為親水性,90゜<接觸角<150゜為疏水性,接觸角>150゜為超疏水性[41]。由表1可見,多孔鈦片呈疏水性,ZnO薄膜均呈親水性,水熱反應(yīng)時間越長,樣品的親水性越強(qiáng)。分析認(rèn)為,由于納米管的存在,多孔鈦片與水接觸時,水滴無法與基底直接接觸,而與納米管及納米管中的空氣接觸,液滴與氣體接觸面積占比較大,故表現(xiàn)出較好的疏水性。由于納米ZnO粒徑小,且顆粒表面有毛細(xì)孔水和表面吸附水,其比表面積和表面能較大,使其親水性增強(qiáng)。隨著水熱時間延長,ZnO沉積量增大,薄膜表面能繼續(xù)增大,接觸角減小,材料表面親水性增強(qiáng)。

表1 多孔鈦片及不同水熱反應(yīng)時間 制備的ZnO薄膜的水接觸角Table 1 The water contact angles of the porous titanium sheet and ZnO films prepared after different hydrothermal time

2.2 材料表面腐敗希瓦氏菌生物被膜附著性能研究

2.2.1 材料表面腐敗希瓦氏菌生物被膜粘附率及被膜菌生長曲線 由圖3可見,0～2 h,材料表面腐敗希瓦氏菌生物被膜粘附率和被膜菌總數(shù)上升很快,表明生物被膜從最初的可逆附著轉(zhuǎn)化為不可逆附著,生物被膜經(jīng)歷了生化作用階段和菌體附著階段,且菌體在生物被膜內(nèi)迅速繁殖。2～12 h,材料表面生物被膜粘附率及被膜菌菌落總數(shù)持續(xù)增長,即生物被膜進(jìn)入生長階段。12～36 h,被膜粘附率及被膜菌菌落總數(shù)變化較小,說明生物被膜進(jìn)入成熟期,基片表面附著的多糖和蛋白質(zhì)為細(xì)菌提供營養(yǎng),使被膜菌數(shù)量持續(xù)增加。36 h后,材料表面生物被膜粘附率和被膜菌總數(shù)下降,生物被膜進(jìn)入衰退期。

圖3 多孔鈦片及不同水熱反應(yīng)時間制備的 ZnO薄膜表面生物被膜生長情況Fig.3 The growth states of the biofilms on the porous titanium sheet and ZnO films prepared after different hydrothermal time注:(a)生物被膜粘附率;(b)被膜菌生長曲線。

由圖3(a)可見,ZnO薄膜表面生物被膜粘附率均低于同期多孔鈦片表面的被膜粘附率,且水熱反應(yīng)時間越長,所制備的ZnO薄膜表面的被膜粘附率越低。由圖3(b)可見,材料表面被膜菌生長規(guī)律與生物被膜的粘附率呈正相關(guān),即ZnO薄膜的抗生物被膜性能優(yōu)于多孔鈦片,且ZnO附著量越大,ZnO薄膜抗生物被膜性能越優(yōu)。分析認(rèn)為,根據(jù)ZnO的離子溶出機(jī)理,ZnO薄膜上附著了生物被膜后,Zn2+溶出進(jìn)入生物被膜中,與被膜菌的菌體蛋白酶結(jié)合,使之失去活性,從而使細(xì)菌死亡[42]。部分被膜菌死亡后,其分泌胞外多糖等被膜粘附物質(zhì)的能力下降,因此ZnO薄膜的抗生物被膜性能優(yōu)于多孔鈦片。前期研究表明,材料表面疏水性提高有利于其抗生物被膜性能提高[33],但本研究中多孔鈦片的疏水性并未降低其表面生物被膜的粘附性能,包括被膜初始生長階段的粘附率。而被膜的初始粘附率及各時期粘附率均與ZnO的附著量呈正相關(guān)。說明ZnO薄膜對生物被膜中被膜菌的殺菌性能在抗生物被膜性能中的貢獻(xiàn)遠(yuǎn)高于材料表面的疏水性。比較各ZnO薄膜,水熱反應(yīng)時間越長,ZnO顆粒在材料表面的附著量越大,雖然其表面的多孔結(jié)構(gòu)消失,且親水性更強(qiáng),但其抗生物被膜性能更優(yōu),進(jìn)一步說明ZnO薄膜的抗菌性決定了其抗生物被膜性能。由圖3(a)可見,ZnO薄膜上生物被膜的粘附率下降略早于多孔鈦片,這是由于被膜菌被殺死后，其分泌胞外多糖等粘附物質(zhì)的能力下降所致。

2.2.2 材料表面腐敗希瓦氏菌生物被膜微觀形貌分析 由圖4可見,在生物被膜培養(yǎng)2 h后,多孔鈦片及ZnO薄膜表面形成了粘附多糖及蛋白質(zhì)膜,說明此階段生物被膜處于最初的粘附階段。12 h時,材料表面的胞外多糖膜增厚,多孔鈦片表面的生物被膜基本鋪滿,甚至有的將菌體包裹其中,此時生物被膜處于生長期。36 h時,可見粘附多糖形成的連續(xù)膜部分脫落,且部分細(xì)菌細(xì)胞受損,說明生物被膜經(jīng)歷生長期并開始進(jìn)入衰退期。48 h后,生物被膜大部分脫落,且可見部分不完整菌體,此時為生物被膜的衰退期。比較同期各材料表面的生物被膜,多孔鈦片表面的生物被膜粘附物較多,ZnO薄膜表面的被膜粘附物和菌體數(shù)量較少,與材料表面生物被膜粘附率及被膜菌生長曲線的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖4 多孔鈦片及不同水熱反應(yīng)時間制備的ZnO薄膜表面生物被膜的掃描電鏡圖Fig.4 SEM images of the biofilms on the porous titanium sheet and ZnO films prepared after different hydrothermal time注:(a)多孔鈦片;(b)ZnO薄膜水熱2 h;(c)ZnO薄膜水熱12 h;(d)ZnO薄膜水熱24 h; 生物被膜培養(yǎng)不同階段:(1)2 h;(2)12 h;(3)36 h;(4)48 h。

3 結(jié)論

在水熱反應(yīng)過程中,ZnO首先在多孔鈦片TiO2孔的孔道頂端及邊緣沉積,隨著水熱反應(yīng)時間延長,TiO2孔道被ZnO晶體顆粒充滿,繼而形成有序、均勻的多層結(jié)構(gòu),且附著量明顯增大。多孔鈦片呈疏水性,ZnO薄膜呈親水性,且隨水熱時間的延長,其親水性增強(qiáng)。由于ZnO具有殺菌性能,ZnO薄膜對腐敗希瓦氏菌生物被膜的抑制性能增強(qiáng),且水熱反應(yīng)時間越長,其對腐敗希瓦氏菌生物被膜的抑制性能更優(yōu)。

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