馮 鑫,何承云,徐茜茜,焦凌霞

(河南科技學院食品學院,河南新鄉(xiāng) 453003)

酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillusacidoterrestris)主要存在于土壤及水果加工產(chǎn)品中,具有在低pH和高溫條件下生存的能力,可導致酸性果汁在貨架期發(fā)生腐敗變質(zhì),使產(chǎn)品具有藥味和腐敗味等異味[1-2]。1998年的美國食品加工商協(xié)會(NFPA)報告顯示,35%的果汁污染與嗜酸芽孢桿菌有關(guān),而引起酸性果汁腐敗的嗜酸芽孢桿菌主要是酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌。該菌屬最早在巴氏滅菌蘋果汁中發(fā)現(xiàn)[3],隨后相繼在橙汁、番茄汁、菠蘿汁、西番蓮汁、葡萄汁、芒果汁及罐裝番茄丁等產(chǎn)品中檢出酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌[4-6]。目前,由酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌引起的腐敗，給果汁加工業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。研究認為，控制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌污染，是防止酸性飲料變質(zhì)的關(guān)鍵,國際出口貿(mào)易中嚴格要求，每10 mL濃縮果汁中，該菌的含量不大于一個[7],因此，酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的危害控制，已成為果汁產(chǎn)業(yè)普遍關(guān)注的問題。

酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌是耐酸、耐熱、好氧型、革蘭氏陽性芽孢桿菌,呈桿狀或短桿狀,生長pH范圍為2.5～6.0,生長溫度范圍為25～60 ℃,在不利于營養(yǎng)菌體生長的條件下形成中生芽孢、近端芽孢或終端橢圓形芽孢[8],該菌芽孢具有更強的耐高溫高酸特性,其芽孢經(jīng)傳統(tǒng)的巴氏殺菌(92 ℃,10 s)處理仍能夠存活,在蘋果汁中的D值范圍為D90 ℃=11.1 min至D100 ℃=0.7 min[9],對果汁工業(yè)的滅菌工藝提出了嚴峻的挑戰(zhàn)。休眠中的芽孢對外界環(huán)境非常敏感,一旦受到外源營養(yǎng)物(L-氨基酸、嘌呤氨基酸、AGFK)或非營養(yǎng)物(溶菌酶、鹽、高壓、Ca2+-DPA、表面活性劑)等刺激，即可啟動萌發(fā),恢復到一個活躍的營養(yǎng)菌體形式[10-11]。存在于果汁中的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌，其芽孢在適宜環(huán)境下就會迅速啟動萌發(fā)，進而生長繁殖,導致果汁腐敗變質(zhì)[12]。芽孢是細菌生長的特定階段,它的形成與菌種有關(guān),不同菌種的芽孢形成條件不同,同時還受到營養(yǎng)物質(zhì)及環(huán)境因素的影響[13]。本論文通過單因素和雙因素交互試驗，研究碳源、氮源及多種無機鹽對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌菌體生長和芽孢形成的影響,旨在探索影響該菌芽孢形成的因素及形成規(guī)律,為控制該菌芽孢污染及酸性水果產(chǎn)品保藏提供實驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌(AlicyclobacillusacidoterrestrisDSM 3922T) 德國菌種保藏中心;葡萄糖、硫酸鎂、氯化鈣、磷酸二氫鉀、硫酸錳、硫酸銨 均為分析純,天津市德恩化學試劑有限公司;酵母提取物、蛋白胨 北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司。

Quanta 200環(huán)境掃描電子顯微鏡 美國FEI公司;Varioskan Rash多功能酶標儀 美國賽默飛世爾科技公司;HV85全自動高壓滅菌鍋 平山制作所株式會社(HIRAYAMA);SW-CJ-IF型單人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;DNP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;ZQTY-70F型振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器。

1.2 培養(yǎng)基的制備

Alicyclobacillusacidoterrestrismedium(AAM)液體培養(yǎng)基:葡萄糖2.0 g,酵母浸粉2.0 g,MgSO4·7H2O 1.0 g,CaCl2·2H2O 0.5 g,KH2PO41.2 g,MnSO4·4H2O 0.5 g,(NH4)2SO40.4 g,無菌水定容至1 L,調(diào)節(jié)pH為4.0,作為芽孢形成試驗的基礎(chǔ)培養(yǎng)基;

計數(shù)培養(yǎng)基(SK固體培養(yǎng)基[14]):酵母浸粉2.5 g,蛋白胨5.0 g,葡萄糖1.0 g,CaCl20.25 g,瓊脂15 g,無菌水定容至1 L,調(diào)節(jié)pH為4.0,菌落計數(shù)用。

1.3 實驗方法

1.3.1 酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長曲線及芽孢形成曲線測定 挑取平板上酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌單菌落,接種到AAM液體培養(yǎng)基中,45 ℃,250 r/min振蕩培養(yǎng)6 h活化菌種,經(jīng)活化后的菌懸液中活菌數(shù)約達108cfu/mL。將此菌懸液按1%的接種量轉(zhuǎn)接到100 mL AAM液體培養(yǎng)基中(500 mL三角瓶),45 ℃,250 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。每2 h取出3 mL菌液,采用稀釋涂布平板法，測定菌體總數(shù)和芽孢數(shù)[15]。其中1 mL菌液進行梯度稀釋后涂布平板,測得的菌落總數(shù)即為菌體總數(shù);1 mL菌液置于80 ℃水浴中處理20 min,除去酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌營養(yǎng)菌體后，再進行梯度稀釋,然后涂布平板,測得菌落總數(shù)即為芽孢數(shù);另外1 mL菌懸液于5000×g條件下離心10 min，收集菌體,用來進行菌體形態(tài)的掃描電鏡觀察。芽孢數(shù)與菌體總數(shù)的比值即為芽孢形成率(芽孢形成率=芽孢數(shù)/菌體總數(shù)×100)。以培養(yǎng)時間為橫坐標,菌體總數(shù)和芽孢數(shù)的對數(shù)值為縱坐標,制作菌體生長曲線和芽孢形成曲線。

1.3.2 菌體形態(tài)的掃描電鏡觀察 將1.3.1中離心收集的菌體用預冷的無菌超純水反復清洗5次,置于含有2.5%的戊二醛(C5H8O2)溶液中，進行菌體形態(tài)的固定,4 ℃固定2 h備用。將固定好的樣品用無菌超純水清洗1次,再用乙醇梯度脫水(35%、50%、70%、80%、90%、100%)1～2次,每次脫水10～15 min。將脫過水的樣品浸泡在乙酸異戊酯(C7H14O2)與乙醇1∶1的混合液中15～20 min,再置于乙酸異戊酯中浸泡20 min并溫和振搖,自然風干后，利用掃描電鏡觀察菌體的形態(tài)變化。

1.3.3 營養(yǎng)因子單因素水平設(shè)置 以AAM液體培養(yǎng)基中各種營養(yǎng)因子的添加量為固定水平,分別進行梯度遞減和增加,共設(shè)置5個水平。取活化后的菌液,按1%的接種量，分別接入含有不同濃度營養(yǎng)因子的50 mL培養(yǎng)基(250 mL三角瓶)中,45 ℃,250 r/min振蕩培養(yǎng)24 h,按照1.3.1所述方法取樣，檢測菌體總數(shù)和芽孢數(shù),每個處理設(shè)3個重復。進行單因素試驗。

碳源:以葡萄糖作為唯一碳源,濃度設(shè)定為0、1、2、3、4 g/L。

氮源:以酵母浸粉作為有機氮源,(NH4)2SO4作為無機氮源。酵母浸粉的濃度設(shè)定為0、1、2、3、4 g/L;(NH4)2SO4的濃度設(shè)定為0、0.2、0.4、0.6、0.8 g/L。

無機鹽:本實驗中的無機鹽包括CaCl2、MnSO4·H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4。CaCl2的濃度設(shè)定為:0、0.19、0.38、0.57、0.76 g/L;MnSO4·H2O的濃度設(shè)定為:0、0.19、0.38、0.57、0.76 g/L;MgSO4·7H2O的濃度設(shè)定為:0、0.5、1、1.5、2.0 g/L;KH2PO4的濃度設(shè)定為:0、0.6、1.2、1.8、2.4 g/L。

1.3.4 營養(yǎng)因子雙因素試驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,設(shè)計雙因素實驗(表1)，觀察不顯著因素的交互作用對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的菌體生長和芽孢形成的影響。

表1 三種非顯著營養(yǎng)因子缺陷的培養(yǎng)基Table 1 The mediums of defecting three kinds of non-significant nutritional factors

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長及芽孢形成

酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌在45 ℃條件下生長狀況良好,培養(yǎng)2 h后進入對數(shù)生長初期,培養(yǎng)6～8 h為對數(shù)中期,12 h進入穩(wěn)定期(圖1)。一些營養(yǎng)菌體在培養(yǎng)8 h時，出現(xiàn)頂端膨脹,10 h時，大多數(shù)菌體進入芽孢形成階段,18 h時，菌體幾乎全部形成芽孢(圖2)。

圖1 酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌DSM 3922T 在45 ℃條件下的生長和芽孢形成曲線Fig.1 Growth and spore formation curve of Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 3922T at 45 ℃

圖2 酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌DSM 3922T在45 ℃條件下培養(yǎng)不同時間的菌體形態(tài)Fig.2 Microbial morphology of Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 3922Tat 45 ℃ for varying durations注:A:6 h,B:8 h,C:10 h,D:18 h。

2.2 碳源對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長及芽孢形成的影響

由圖3可知,當培養(yǎng)液中不含葡萄糖時,45 ℃,250 r/min振蕩培養(yǎng)24 h,菌體總數(shù)為7.06 lg cfu/mL,芽孢數(shù)為6.92 lg cfu/mL,芽孢形成率為73.2%。隨著培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的提高,菌體總數(shù)和芽孢數(shù)均有所增加。當葡萄糖濃度增加到2 g/L時,菌體總數(shù)達到7.66 lg cfu/mL,芽孢數(shù)達到7.64 lg cfu/mL,芽孢形成率達到97.8%,較對照組提高了24.6%。繼續(xù)提高葡萄糖濃度,菌體總數(shù)和芽孢數(shù)均無明顯增加。方差分析結(jié)果表明，葡萄糖對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的菌體生長和芽孢形成影響顯著(p<0.05)。

圖3 葡萄糖濃度對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌 DSM 3922T菌體總數(shù)和芽孢數(shù)的影響Fig.3 Effects of glucose concentrations on cell growth and spore production of Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 3922T注:不同小寫字母表示同一指標間 差異顯著(p<0.05),圖4、圖5同。

碳源是細胞生長和新陳代謝必需的營養(yǎng)物質(zhì),其種類和濃度直接影響芽孢的形成速率和產(chǎn)量。王天云等[16]探討培養(yǎng)基成分對乳酸芽孢桿菌芽孢形成的影響時,發(fā)現(xiàn)碳源濃度是影響乳酸芽孢桿菌芽孢形成的關(guān)鍵因素。Osadchaya等[17]通過豐富芽孢培養(yǎng)基碳源的組成,使細胞和芽孢產(chǎn)量較單一碳源時有了顯著提高。本試驗發(fā)現(xiàn)葡萄糖對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的營養(yǎng)菌體生長和芽孢形成具有顯著的促進作用,當其濃度達到2 g/L時,即可有效地提高菌體總數(shù)和芽孢形成率。

2.3 氮源濃度對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長及芽孢形成的影響

由圖4A可知,當培養(yǎng)液中不含酵母浸粉而以(NH4)2SO4為唯一氮源時,45 ℃,250 r/min振蕩培養(yǎng)24 h,菌體總數(shù)為6.61 lg cfu/mL,芽孢數(shù)為6.53 lg cfu/mL,芽孢形成率為82.54%。當酵母浸粉添加濃度為1 g/L時,菌體總數(shù)增加至7.70 lg cfu/mL,芽孢數(shù)增加至7.68 lg cfu/mL,芽孢形成率由82.54%提高到95.41%。繼續(xù)增加酵母浸粉的濃度,菌體總數(shù)和芽孢數(shù)均不再隨酵母浸粉濃度的提高而明顯增加。當培養(yǎng)基中酵母浸粉的添加量為2～4 g/L時,菌體總數(shù)分別為7.66、7.63和7.63 lg cfu/mL,芽孢數(shù)分別為7.64、7.61和7.62 lg cfu/mL。研究表明,培養(yǎng)基中的氮源也是影響芽孢形成的因素之一[18],方差分析結(jié)果表明，酵母浸粉作為唯一有機氮源，對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌菌體生長和芽孢形成具有顯著的影響(p<0.05),而無機氮源(NH4)2SO4對菌體生長和芽孢形成在p<0.05水平上影響不顯著(圖4B)。即使培養(yǎng)基中不含(NH4)2SO4，而以酵母浸粉為唯一碳源時,菌體總數(shù)仍高達7.69 lg cfu/mL,芽孢數(shù)達7.67 lg cfu/mL,而且增加(NH4)2SO4的添加濃度,菌體總數(shù)和芽孢數(shù)均無增加趨勢。

圖4 酵母浸粉和(NH4)2SO4 對Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 3922T菌體生長和芽孢產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of yeast extract and(NH4)2SO4 concentrations on cell growth and spores production of Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 3922T

一般來講,有機氮源營養(yǎng)豐富,比無機氮源更有利于營養(yǎng)菌體生長,但是對細菌芽孢形成的影響并不清楚。作為革蘭氏陽性菌的模式菌株,枯草芽孢桿菌B68在以無機氮為唯一氮源時，生長較弱,在有機氮源中長勢較好[19]。酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌對有機氮源的利用也明顯高于無機氮源,在以酵母浸粉為唯一氮源時,比以(NH4)2SO4為唯一氮源時所得的菌體總數(shù)提高了11.02倍,芽孢數(shù)提高了12.81倍,芽孢形成率提高了12.96%。

2.4 無機鹽對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長及芽孢形成的影響

AAM培養(yǎng)液中的無機鹽成分為CaCl2、KH2PO4、MnSO4·H2O、MgSO4·7H2O,各種無機鹽離子對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的菌體生長和芽孢形成的影響如圖5所示。方差分析結(jié)果表明，Ca2+和K+濃度對菌體生長及芽孢形成的影響均不顯著(p>0.05),即使培養(yǎng)液中不含Ca2+或K+,菌體總數(shù)也達到7.59 lg cfu/mL,芽孢數(shù)達到7.49 lg cfu/mL,芽孢形成率為80.51%(圖5A、5B)。研究認為,在芽孢形成過程中,母細胞中產(chǎn)生的PDA與Ca2+結(jié)合形成Ca2+-DPA復合物,貯存在芽孢核中,在降低芽孢核含水量、增強芽孢耐熱性方面起著重要的作用[20]。金華等[21]研究發(fā)現(xiàn),當溶液中含有較高濃度的鈣離子時,丁酸梭狀芽孢桿菌形成的芽孢數(shù)量較多,培養(yǎng)基中CaCl2濃度為0.8 g/L時,菌體數(shù)量和芽孢形成率均獲得最大值。陳秋紅等[22]研究發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)基中添加K2HPO4后凝結(jié)芽孢桿菌的菌體數(shù)量、芽孢數(shù)量和芽孢形成率均有所提高,表明K+對凝結(jié)芽孢桿菌的菌體生長和芽孢形成有促進作用。在本試驗中,培養(yǎng)液中單一缺乏Ca2+和K+，對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的菌體生長和芽孢形成均無顯著影響,增大CaCl2和KH2PO4的添加濃度對該菌的菌體生長和芽孢形成也沒有顯著的促進作用。酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌具有嗜酸耐熱的雙重生理特性,其芽孢具有更強的耐熱耐酸等抗逆特性,參與其芽孢形成過程的必需離子是否與其他種屬的微生物不同，仍需進一步的研究。

由圖5C可知,培養(yǎng)液中Mn2+濃度對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌菌體生長及芽孢形成的影響顯著(p<0.05)。培養(yǎng)液中不含Mn2+時,菌體總數(shù)為7.58 lg cfu/mL,芽孢數(shù)為7.49 lg cfu/mL,芽孢形成率為80.25%。Mn2+添加濃度較低時(0.24～0.48 g/L),對菌體生長和芽孢形成有一定的促進作用,繼續(xù)增加Mn2+的添加濃度,菌體總數(shù)和芽孢數(shù)均呈下降趨勢,當Mn2+濃度達到0.96 g/L時,菌體總數(shù)僅為4.03 lg cfu/mL。結(jié)果表明,一定濃度的Mn2+可以促進酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的營養(yǎng)菌體生長和芽孢形成,高濃度Mn2+反而抑制其菌體生長。這與文獻報道的Mn2+含量達到某一域值時，將會抑制菌體生長的結(jié)論相一致[23]。而在此Mn2+濃度下,芽孢數(shù)為4.00 lg cfu/mL,芽孢形成率高達96%,可見高Mn2+濃度對其菌體生長有明顯的抑制作用,但卻促進了芽孢形成。據(jù)報道,多種金屬離子可以促進細菌芽孢的形成[24]。Mn2+作為一種微生物生長所需的微量元素是超氧化物歧化酶、L-阿拉伯糖異構(gòu)酶等許多酶的輔助因子,與碳水化合物的代謝有密切關(guān)系,影響細胞的生長和芽孢的形成[18],已有研究表明,金屬離子Mn2+能促進芽孢產(chǎn)生,提高芽孢得率[22,25-26],本研究也得到了同樣的結(jié)論。

圖5 CaCl2、KH2PO4、MnSO4、MgSO4濃度對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌DSM 3922T菌體生長和芽孢形成的影響Fig.5 Effects of CaCl2,KH2PO4,MnSO4 and MgSO4 concentrations on cell growth and spore production of Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 3922T

由圖5D可以看出,Mg2+對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌菌體生長和芽孢形成的有顯著的影響(p<0.05),增加Mg2+濃度可以顯著提高酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的菌體總數(shù)、芽孢數(shù)和芽孢形成率。在Mg2+的添加濃度為0～0.34 g/L的范圍內(nèi),菌體總數(shù)隨Mg2+濃度的增加而增加。當Mg2+濃度為0.34 g/L時,與不含Mg2+的對照組相比,菌體總數(shù)從3.72 lg cfu/mL增加到7.66 lg cfu/mL,芽孢數(shù)從3.18 lg cfu/mL增加到7.64 lg cfu/mL,芽孢形成率也由29.31%上升到95.80%。繼續(xù)增加Mg2+濃度,菌體總數(shù)沒有顯著變化,芽孢數(shù)略有降低,可見高濃度Mg2+對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌菌體生長和芽孢形成沒有明顯的抑制效果。姚露燕等[27]發(fā)現(xiàn),一定濃度的Mg2+對枯草桿菌BS-MM03的菌體生長及芽孢形成均有顯著的促進作用,但當Mg2+濃度大于0.03%時,菌體總量和芽孢形成率均下降。另有文獻報道,對于納豆芽孢桿菌,Mg2+有利于其菌體生長但不利于其芽孢的行成[28],而對丁酸梭狀芽孢桿菌,增加Mg2+濃度對其菌體生長沒有明顯的促進作用,但能促進其芽孢形成[21]。這些研究表明,Mg2+對不同微生物的菌體生長和芽孢形成有著不同的影響。Kolodziej 和Slepecky[29]推測,Mg2+是作為芽孢轉(zhuǎn)化過程中關(guān)鍵酶的輔助組分而起作用,其對不同微生物芽孢形成的影響機理尚待進一步研究。

2.5 不顯著因素交互作用對芽孢形成的影響

表2 不顯著營養(yǎng)因子的交互作用 對Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 3922T菌體生長和芽孢形成的影響Table 2 Effects of interaction of two non-significant nutritional factors on cell growth and spore production of Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 3922T

3 結(jié)論