廖良坤,張?zhí)K慧,周 偉,*,李積華,魏曉奕,崔麗虹,袁 源,王綏鑫,萬明正

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,廣東湛江 524001； 2.農(nóng)業(yè)部熱帶作物產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東湛江 524001； 3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,湖北武漢 430070； 4.海南景和農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司,海南?？?570100)

斜葉黃檀(Dalbergiapinnata(Lour.)prain.)主要產(chǎn)于廣西、海南等地,可用于制作佛珠、手串以及精制精油等,屬于降真香中的一個(gè)屬[1]。在《本草綱目》[2]中有關(guān)于斜葉黃檀資料的記載,可以被用作熏香用的香料,也可以在戰(zhàn)場(chǎng)上被用于治療跌打損傷和刀傷等藥材使用[3],因此斜葉黃檀兼具香藥兩方面的作用。斜葉黃檀作為降真香中的一種香料,目前有關(guān)斜葉黃檀的資料較少,多數(shù)曾將其降真香誤認(rèn)為降香,直到張丹雁[3]將其利用基因鑒定技術(shù)才得以鑒別。

精油是由多種成分所組成的混合物,目前關(guān)于植物精油功能活性的研究主要有抗氧化、抑菌、抗炎以及對(duì)酶活性的抑制等[1,4-14],其中研究最多的為抗氧化和抑菌。Sacchetti G等[15]比較了十一種不同精油的抗氧化活性,Saima Siddique等[16]通過瓊脂擴(kuò)散法和微量稀釋法研究白千層木精油對(duì)食源性病菌的抑菌和殺菌作用。由于植物精油殘留毒性和副作用小,因此近年來對(duì)不同精油的抑菌研究較多[17-20]。茶樹精油被開發(fā)為藥物和保健品,也被用作防腐劑和消毒劑等[21]。植物精油已有的抗氧化、抑菌等生物活性使得其備受關(guān)注,其應(yīng)用領(lǐng)域也越來越廣泛。

然而,目前關(guān)于斜葉黃檀的資料主要集中在品種鑒定及成分分析方面,而對(duì)斜葉黃檀精油功能活性方面的研究較少,趙維波等[22]采取水蒸氣蒸餾法提取斜葉黃檀中的精油并研究其抗氧化活性。本文主要通過超臨界CO2提取斜葉黃檀精油,測(cè)定其中多酚、黃酮的含量,并測(cè)定其體外抗氧化、抑菌能力以及抑制黑色素的形成能力,為斜葉黃檀精油的深入研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

斜葉黃檀精油 超臨界CO2萃取得到[23];沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度:HPLC≥98%)、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度UV≥98%) 上海源葉生物科技有限公司;福林酚、DPPH、ABTS 美國Sigma公司;亞硝酸鈉、磷酸氫二鈉、酪氨酸酶 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;L-酪氨酸 上海麥克林生化科技有限公司;熊果苷(化妝品級(jí)) 青島優(yōu)索化學(xué)科技有限公司;硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇、過硫酸鉀、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸(TCA)、磷酸鈉、鉬酸銨、三氯化鐵、硫酸、碳酸鈉、二叔丁基對(duì)甲苯(BHT) 均為國產(chǎn)分析純;測(cè)試菌種包括2株革蘭氏陽性菌:金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 25923)、化膿性鏈球菌(StreptococcusATCC 19615);3株革蘭氏陰性菌,大腸桿菌(EscherichiacoliCMCC(B)44103)、銅綠假單胞菌(PseudomonasaeruginosaATCC 27853)、鼠傷寒沙門氏菌(SalmonellaTyphimuriumATCC 14028);1株真菌,白色念珠菌(CandidaalbicansATCC 10231) 其中大腸桿菌來源于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司,其他五株菌均來源于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;牛肉粉、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、酵母粉、葡萄糖、碳酸氫鈉、氯化鈉、麥芽糖、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、胰蛋白胨 國產(chǎn)生化級(jí)。

UV-1780紫外可見分光光度計(jì) 島津儀器(蘇州)有限公司;垂直流超凈工作臺(tái) 上海智城分析儀器制造有限公司;Shimadzu QP2010-Plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司;全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器、pH計(jì)、離心機(jī)、恒溫振蕩培養(yǎng)箱 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.2 多酚含量的測(cè)定 參照國標(biāo)法測(cè)定多酚含量[24]。具體操作如下:配制濃度為1 mg/mL的沒食子酸溶液,分別取配制好的沒食子酸溶液0、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL于10 mL容量瓶中用蒸餾水定容。分別取上述稀釋后的沒食子酸溶液各2 mL于50 mL容量瓶,再依次加10 mL 10%福林酚試劑,8 mL 7% Na2CO3溶液,室溫下放置1 h,用蒸餾水定容至刻度線后于765 nm處測(cè)定吸光度值。以不同濃度沒食子酸為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品處理:將待測(cè)樣品用無水乙醇適度稀釋后取2 mL于50 mL容量瓶中,同樣加10 mL 10%福林酚試劑,8 mL 7% Na2CO3溶液,室溫下放置1 h后,用蒸餾水定容后于765 nm處測(cè)定吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到多酚含量。

1.2.3 黃酮含量的測(cè)定 對(duì)Behnaz Tohidi等[25]方法稍作修改。具體操作方法如下:配制濃度為0.24 mg/mL的蘆丁溶液,分別取0.24 mg/mL蘆丁溶液0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL于10 mL容量瓶,加入50 mg/mL NaNO2溶液0.5 mL,搖勻后放置6 min,再加入100 mg/mL Al(NO3)3溶液0.5 mL,搖勻后放置6 min,加入40 mg/mL NaOH溶液4 mL,最后用蒸餾水定容,搖勻后在室溫下放置15 min后于波長為510 nm處測(cè)定吸光度值,以蘆丁濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品處理:取適度稀釋后的待測(cè)樣品于10 mL容量瓶,加入50 mg/mL NaNO2溶液0.5 mL,搖勻后放置6 min,再加入100 mg/mL Al(NO3)3溶液0.5 mL,搖勻后放置6 min,加入40 mg/mL NaOH溶液4 mL,最后用蒸餾水定容,搖勻后在室溫放置15 min后于波長為510 nm處測(cè)定吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到黃酮含量。

1.2.4 抗氧化活性的測(cè)定

1.2.4.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 參考Hu等[26]的方法,操作如下:配制濃度為0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液,貯存于棕色瓶中備用。用無水乙醇將精油配制成不同濃度(0.02、0.06、0.10、0.14、0.18 mg/mL),取不同濃度精油待測(cè)液2 mL,加入DPPH乙醇溶液2 mL,混合均勻,放置室溫下于暗處反應(yīng)30 min,測(cè)定517 nm處的吸光度值A(chǔ)1;另取試管加入2 mL乙醇溶液和2 mL DPPH乙醇溶液,測(cè)定517 nm處吸光度A2;取不同濃度待測(cè)液2 mL,各加入2 mL乙醇溶液,測(cè)定517 nm處吸光度A0;平行3次試驗(yàn)取平均值。按上述條件,用不同濃度BHT(0.02、0.06、0.10、0.14、0.18 mg/mL)做陽性對(duì)照。按公式計(jì)算DPPH自由基清除率。

關(guān)小美1986年6月出生于洛陽市某縣，家境富裕。2008年從洛陽市某大學(xué)畢業(yè)后，被安排到某企業(yè)做行政工作，單位還給她分了一間單身宿舍，工作輕松又體面。

式(1)

1.2.4.2 ABTS自由基清除能力的測(cè)定 參考Miller等[27]的方法,ABTS待用液的配制如下:分別配制7 mmol/L的ABTS溶液和2.4 mmol/L過硫酸鉀溶液,將兩者等體積混合均勻后倒進(jìn)棕色的玻璃瓶里,室溫下暗處反應(yīng)12～16 h形成ABTS待用液。用無水乙醇稀釋到在734 nm處吸光度值為0.7±0.02。ABTS清除能力測(cè)定的具體操作為:配制不同濃度的精油待測(cè)樣品(0.02、0.06、0.10、0.14、0.18 mg/mL),分別取不同濃度待測(cè)樣品2 mL,在反應(yīng)體系中加入4 mL ABTS溶液,在734 nm處測(cè)定放于暗處反應(yīng)20 min后的吸光度值A(chǔ)A,同時(shí)用水代替樣品做空白對(duì)照的吸光度值為Ac。用同濃度的BHT做陽性對(duì)照。

ABTS自由基清除率(%)=[(Ac-AA)/Ac]×100

式(2)

1.2.4.3 總還原力的測(cè)定 參考李順峰等[28]方法,將待測(cè)的不同濃度精油(0.03、0.06、0.09、0.12、0.15、0.18 mg/mL)各吸取1 mL于試管中,分別加入1.5 mL磷酸鹽緩沖液(PBS,pH=6.6 0.2 mol/L)、1.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6),混勻后于50 ℃恒溫水浴中反應(yīng)20 min,冷卻至室溫后各加入1.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的TCA,充分混勻后在離心機(jī)中以4000 r/min離心10 min,取上清液2.5 mL、加入0.5 mL新配制的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的三氯化鐵溶液和2 mL蒸餾水,在常溫下充分混勻后在波長為700 nm處測(cè)定各個(gè)試管中樣品的吸光度值。用同濃度的BHT做陽性對(duì)照。

1.2.4.4 總抗氧化能力的測(cè)定 采用磷鉬絡(luò)合法測(cè)定精油的總抗氧化能力[29]。將待測(cè)精油用無水乙醇溶解后配成不同濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL),吸取1 mL于試管中,依次加入已配制好的濃度分別為0.6 mol/L硫酸、28 mmol/L磷酸鈉和4 mmol/L的鉬酸銨各1 mL,在常溫下充分搖蕩均勻后在95 ℃的水浴鍋中水浴1.5 h,后取出冷卻至室溫,于695 nm處測(cè)定吸光度值,陽性對(duì)照BHT做同樣處理。

1.2.5 抑菌活性的測(cè)定 該實(shí)驗(yàn)選取兩株革蘭氏陽性菌,三株革蘭氏陰性菌和一株真菌作為待測(cè)菌株,測(cè)定斜葉黃檀精油對(duì)六株菌的抑菌圈直徑以及最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)。具體操作如下:

1.2.5.1 抑菌圈的測(cè)定 參考劉曉生等[30]法,并加以修改。具體操作如下:將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的菌原液取200 μL在已凝固的固體培養(yǎng)基上,涂布均勻后在上方均勻?qū)ΨQ放置三張濾紙片(直徑為6 mm),取待測(cè)精油5 μL加在濾紙片上,在37 ℃下培養(yǎng)24 h,通過測(cè)量抑菌區(qū)域的直徑判斷精油的抑菌活性,每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。抑菌圈實(shí)驗(yàn)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)為:抑菌圈大于20 mm,極敏;15～20 mm,高敏;10～15 mm,中敏;7～10 mm,低敏;小于7 mm,不敏感。

1.2.5.2 MIC和MBC的測(cè)定 用肉湯稀釋法(二倍稀釋法)測(cè)定精油的MIC和MBC。用吐溫80將精油配成不同濃度(1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125 μL/mL),在各試管中依次加入8.9 mL培養(yǎng)基、0.1 mL菌懸液、1 mL不同濃度精油,最終精油濃度為100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125 μL/mL,24 h后觀察細(xì)菌生長情況,無明顯渾濁的最小濃度為MIC,取無明顯菌落生長的試管,挑取后平板劃線,24 h后仍無菌落生長的為MBC。

1.2.6 抑制酪氨酸酶活性的測(cè)定 參考Baurin N等[31]方法并做修改,具體操作如下:依次配制如下試劑:磷酸鹽緩沖液(pH=6.8,0.2 mol/L磷酸二氫鈉,0.2 mol/L磷酸氫二鈉)、L-酪氨酸溶液(1.5 mmol/L)、酪氨酸酶溶液(酶活:50 U/mL)、樣品(用甲醇配制濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL),用同濃度的熊果苷做陽性對(duì)照。

在反應(yīng)體系中依次按如表1加入磷酸鹽緩沖液、不同濃度待測(cè)樣品、酪氨酸酶,30 ℃水浴10 min后,向反應(yīng)體系中加入L-酪氨酸溶液,反應(yīng)20 min后在475 nm處吸光度值。

表1 抑制酪氨酸酶活性實(shí)驗(yàn)各物質(zhì)添加順序Table 1 The order of adding substance tyrosinase activity inhibition experiment

抑制率(%)=[(A-B)/A]×100

式(3)

式中：A-標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照吸光度值;B-待測(cè)物吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

化合物采用峰面積歸一化法進(jìn)行計(jì)算,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)表示,以O(shè)rigin 8.1軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 精油中揮發(fā)性成分分析

表2為經(jīng)超臨界CO2提取得到的精油中主要成分,其中欖香素所占比例高達(dá)75.54%,威士忌內(nèi)酯、4-烯丙基-2,6-二甲氧基苯酚和甲基丁香酚所占百分含量分別為0.47%、1.27%和2.35%。而趙維波等[22]采用水蒸氣蒸餾法提取得到的揮發(fā)油中的欖香素、威士忌內(nèi)酯、4-烯丙基-2,6-二甲氧基苯酚和甲基丁香酚的含量分別為:89.74%、0.41%、0%和2.67%。此外后者揮發(fā)油類還含有水楊醛、芳樟醇等成分,在本實(shí)驗(yàn)中并未得到此類揮發(fā)性成分,可能是原料來源不同或者儀器參數(shù)等的差別,使得提取得到的精油揮發(fā)性成分存在差異性。在精油中所檢測(cè)到的成分中,欖香素主要有較強(qiáng)的催眠作用、抗蚊殺蟲及抗真菌、抗肺炎等作用[32],甲基丁香酚具有降壓、抗氧化、抑菌等作用[33],4-烯丙基-2,6-二甲氧基苯酚具有抑制脂質(zhì)過氧化的作用,以及清除自由基等抗氧化作用[34],威士忌內(nèi)酯具有較強(qiáng)的抑菌、抗炎及抗氧化等作用,可用于糖果、餅干等各類食品的食用香料[22]。鑒于主要成分本身具有的特殊功能活性,故而對(duì)精油的總體功能活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

表2 斜葉黃檀精油揮發(fā)性成分分析Table 2 Analysis of volatile constituents of essential oil from Dalbergia pinnata

2.2 精油中多酚含量測(cè)定結(jié)果

經(jīng)測(cè)定多酚標(biāo)曲為y=0.0846x+0.0194,R2=0.9993,斜葉黃檀精油中多酚含量為95.52 μg沒食子酸當(dāng)量/mg精油,含量為9.552%。與其他植物精油相比,含量相對(duì)較高,周海旭[35]在用無水乙醇作為提取溶劑且在最優(yōu)條件下提取樟樹中的多酚,得到的多酚得率為5.41%,以及Abdelwahab S I等[36]通過水蒸氣蒸餾法提取得到的樟樹中精油的多酚含量為5.04%。多酚含量均小于本實(shí)驗(yàn)提取得到的多酚含量。

2.3 精油中黃酮含量測(cè)定結(jié)果

繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=12.084x-0.0124,R2=0.9993,斜葉黃檀中黃酮含量為0.0913 mg蘆丁/mg精油,即黃酮含量百分比為9.13%。與其他植物精油相比,含量也存在差異性,經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)麝香草中T.fallax中黃酮含量為8.14%,T.vulgaris中黃酮含量為8.55%[37],要低于本實(shí)驗(yàn)所提取得到的精油中的黃酮含量。

2.4 抗氧化活性分析

2.4.1 精油對(duì)DPPH自由基清除能力的影響 斜葉黃檀精油對(duì)DPPH自由基清除能力的影響見圖1。隨著精油濃度的升高,其對(duì)DPPH自由基的清除能力也逐漸增大,斜葉黃檀精油與DPPH自由基清除能力呈現(xiàn)出較好的量效關(guān)系。本研究中精油濃度為0.18 mg/mL時(shí),清除率為70%左右,而趙維波等[22]通過水蒸氣蒸餾提取得到的揮發(fā)油在清除率為70%左右時(shí),其精油濃度為16 mg/mL。說明斜葉黃檀精油對(duì)DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除能力,提取方法的不同使得精油對(duì)DPPH自由基的清除能力存在差異。此外精油與陽性對(duì)照BHT相比,其DPPH自由基清除能力弱于陽性對(duì)照,且與陽性對(duì)照存在較大差異,隨著濃度的升高,差異逐漸減小。

圖1 斜葉黃檀精油對(duì)DPPH自由基清除能力的影響Fig.1 Effect of free scavenging activity of Dalbergia pinnata(Lour.)Prain. essential oil on DPPH radical

2.4.2 精油對(duì)ABTS自由基清除能力的影響 圖2為斜葉黃檀精油對(duì)ABTS自由基清除能力的影響。斜葉黃檀精油對(duì)ABTS自由基的清除能力隨著濃度的增大而增強(qiáng),呈現(xiàn)較好的量效關(guān)系。在相同濃度下,其清除能力要弱于陽性對(duì)照BHT。在濃度為0.18 mg/mL時(shí),對(duì)ABTS自由基的清除能力達(dá)80%以上,可見其對(duì)ABTS自由基的清除能力較強(qiáng)。

圖2 斜葉黃檀精油對(duì)ABTS自由基清除能力的影響Fig.2 Effect of free scavenging activity of Dalbergia pinnata(Lour.)Prain. essential oil on ABTS radical

2.4.3 精油對(duì)總還原力的影響 圖3為斜葉黃檀精油對(duì)總還原力的影響,斜葉黃檀精油的總還原力值與濃度關(guān)系密切,隨著濃度的增高,總還原力值也隨之增加,呈現(xiàn)出良好的正相關(guān)性。但與陽性對(duì)照相比,仍較低,陽性對(duì)照在濃度為0.12 mg/mL時(shí)總還原力值就達(dá)0.8以上,而斜葉黃檀精油僅有0.4左右。

圖3 斜葉黃檀精油對(duì)總還原能力的影響Fig.3 Effect of Dalbergia pinnata(Lour.)Prain. essential oil on the total reducing power

2.4.4 精油對(duì)總抗氧化能力的影響 圖4為斜葉黃檀精油對(duì)總抗氧化能力的影響,與陽性對(duì)照BHT對(duì)比,總抗氧化能力相對(duì)較弱,在精油濃度為1 mg/mL為總抗氧化值達(dá)到0.4,而同濃度的陽性對(duì)照BHT的總抗氧化值達(dá)到0.7以上?？偪寡趸芰﹄S著精油濃度的增加而呈現(xiàn)較好的正相關(guān)性。

圖4 斜葉黃檀精油對(duì)總抗氧化能力的影響Fig.4 Effect of the total antioxidant capacity of Dalbergia pinnata(Lour.)Prain. essential oil

2.5 精油的抑菌結(jié)果

表3為斜葉黃檀精油對(duì)不同測(cè)試菌的抑菌能力大小,從表3中抑菌直徑結(jié)果可以看出,斜葉黃檀精油對(duì)金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌以及白色念珠菌均為中敏程度。但對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌三株革蘭氏陰性菌無明顯的抑菌效果。故而可以判斷斜葉黃檀精油具有抑制革蘭氏陽性菌和真菌的活性。

表3 斜葉黃檀精油的抑菌結(jié)果Table 3 The results of bacteriostasia of Dalbergia pinnata(Lour.)Prain. essential oil

針對(duì)斜葉黃檀精油具有的抑制革蘭氏陽性菌和真菌的作用,測(cè)定其MIC和MBC,值越小表明抑菌性越強(qiáng),可見斜葉黃檀精油對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC和MBC值最小,對(duì)其抑菌性最為明顯。對(duì)化膿性鏈球菌的MIC和MBC值次之,而金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌均是存在于人體表面的細(xì)菌,因精油具有明顯的抑菌效果，可以擴(kuò)大精油的應(yīng)用范圍。

2.6 精油對(duì)酪氨酸酶抑制率的影響

圖5為精油和陽性對(duì)照熊果苷對(duì)酪氨酸酶的抑制率結(jié)果。隨著精油濃度的升高,精油對(duì)酪氨酸酶的抑制率存在著正相關(guān)性。斜葉黃檀精油與陽性對(duì)照熊果苷均有強(qiáng)的抑制酪氨酸酶活性,進(jìn)而抑制黑色素的形成,且精油對(duì)酪氨酸酶的抑制活性強(qiáng)于陽性對(duì)照熊果苷。間接證明了斜葉黃檀精油具有抑制黑色素形成的能力。故而為斜葉黃檀精油的廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)。

圖5 斜葉黃檀精油抑制酪氨酸酶活性Fig.5 The inhibition activity of Dalbergia pinnata(Lour.)Prain. essential oil on tyrosinase

3 結(jié)論

本文較為系統(tǒng)的研究了斜葉黃檀精油中的多酚、黃酮含量以及精油的抗氧化、抑菌和抑制黑色素形成能力的功能活性,結(jié)果證明該精油具有較好的清除DPPH和ABTS自由基能力,較強(qiáng)的總還原力以及總抗氧化能力,綜合證明該精油具有較強(qiáng)的抗氧化活性;對(duì)革蘭氏陽性菌(G+,主要是金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌)以及真菌具有較好的抑制活性,以及具有抑制酪氨酸酶活性的功效,從而抑制黑色素的形成。精油是由多種成分組成的復(fù)雜體系,其具有多方面的功能活性是多種復(fù)雜成分共同作用的結(jié)果,本研究結(jié)果為精油的深入研究以及在應(yīng)用方面提供一定的理論依據(jù),也為開發(fā)更多產(chǎn)品提供一定的參考價(jià)值。