劉 成，湯 勃，孔建益，王興東

（武漢科技大學 機械自動化學院，湖北 武漢 430081）

1 引言

Flow Cytometry是一種對沿直線狀態(tài)中快速流動的單細胞懸液或其它微小生物顆粒進行多參數(shù)、定量、定性分析的生命科學儀器[1]，它包含了光電技術(shù)、電子物理技術(shù)、流體力學、細胞熒光化學技術(shù)、電子計算機、圖像處理技術(shù)等眾多學科范圍的知識成果，目前其已被廣泛應用于臨床醫(yī)學、細胞學、生物學、微生物學等領(lǐng)域，被譽為細胞生物實驗室的CT[2-3]。其主要結(jié)構(gòu)可以概括為3部分：液流系統(tǒng)、光學系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)[4]。流動室作為流式細胞儀的關(guān)鍵部件，是樣本液聚焦成直線快速狀態(tài)的場所，流動室是根據(jù)液流在層流前提下呈分層流動的特點設計而成的。在該流動室中，樣品流被鞘液流聚焦限制在流動室的中心軸線上，而鞘液包裹它周圍，激光光束經(jīng)光學系統(tǒng)聚焦直接照在樣品流的中心，從而完成對細胞或生物顆粒的檢測[5]。

樣品聚焦寬度過大，位置偏移等均會導致檢測誤差加大，檢測精度下降，因此對流動室的合理設計是保證儀器高精確性的重要前提[6-7]。而現(xiàn)在大多數(shù)的對于流動室液力聚焦的研究主要是針對對鞘液入口角度，聚焦錐面角度，進樣針位置，鞘液和樣本液的速率比這些影響參數(shù)展開的[8]，接下來在嘗試加入鞘液入口直徑，樣本流入口直徑以及檢測區(qū)直徑等新的影響參數(shù)擴展應用于流動室層流聚焦技術(shù)中，推導樣本流聚焦直徑的理論計算公式，利用Fluent仿真模擬不同的結(jié)構(gòu)參數(shù)對樣本流聚焦直徑的影響規(guī)律，并通過設計正交實驗[9]為流式細胞儀工程在實際中的應用提供參考依據(jù)。

2 流動室計算模型

對于流動室來說，鞘液入口方式主要有三種，第一種是鞘液入口和樣本液入口在流動室中呈共軸分布的結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)是比較理想的結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生的流體波動較小，能夠快速的形成穩(wěn)定的層流，而由于流動室的尺寸較小，加工難度較大，這種設計無疑會增大加工難度，增加成本；第二種就是鞘液入口設計在流動室側(cè)壁，并且垂直于側(cè)壁，鞘液入口與樣本針呈正交的狀態(tài)，這種入口方式對流體最容易造成沖擊，難以形成穩(wěn)定的層流；第三種入口方式就是鞘流入口與流動室側(cè)壁呈一個小于90°角的夾角結(jié)構(gòu)，采用的第三種鞘液入口方式，鞘液流產(chǎn)生的動量可以分流為前進的動量，從而減小對樣品流驅(qū)動力的限制，這種設計就介于前面兩種設計之間，容易形成穩(wěn)定的層流，也有利于與流動室的加工，如圖1所示。整個流動室主要包括三個區(qū)域：進樣區(qū)、聚焦區(qū)和檢測區(qū)。

待測樣本液入口d1位于左側(cè)中間，鞘液入口d2對稱位于上下兩側(cè)壁，并與流動室壁面成銳角狀態(tài)，鞘液從流動室兩側(cè)鞘流通道進入進樣區(qū)，主要完成對待測懸浮液的聚焦。制作成懸浮液的待測樣品流從d1口注入，在外部鞘液的層流“聚焦”力的擠壓的作用下，經(jīng)聚焦區(qū)聚焦加速后，將樣本液由較寬的入口狀態(tài)逐漸擠壓成非常小的聚焦狀態(tài)，最后包裹樣本液通過檢測區(qū)d3，完成對待測樣本液的熒光檢測，而后，所有的液體廢液從檢測區(qū)出口流道排出。

圖1 流動室結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic Diagram of Flow Chamber Structure

由質(zhì)量守恒定律可知，通過進樣針入口管路的流體質(zhì)量應與聚焦后檢測區(qū)樣本液流體質(zhì)量保持相等，因為這里采用的是二維狀態(tài)下的數(shù)值計算，故可以得到以下公式：

式中：V1—待測樣本液入口處的平均流速；

V3—檢測區(qū)形成細小聚焦狀態(tài)的樣本流的的平均速度；

d1—樣本液的入口直徑；

d—聚焦后穩(wěn)定的樣本液的寬度。

由于檢測區(qū)的液流處于層流狀態(tài)，所以在檢測區(qū)的截面速度為拋物線分布，流動室中心軸線上速度最大，而此時的樣本流的直徑又非常小，故可以將檢測區(qū)聚焦液流平均流速V3近似的等同于中心軸線流速Vmax，可得：

根據(jù)流體動力學聚焦原理，樣本流被聚焦后將形成穩(wěn)定的的層流，而流動室中的樣本液和鞘液之間的物質(zhì)擴散和混合可以忽略不計。根據(jù)質(zhì)量守恒定律，可知：

其中，流動室兩側(cè)的鞘液入口處的鞘液密度和流體速度是相同的，式中：ρ1，ρ2—待測樣本液的流體密度；ρ3—檢測區(qū)的混合流體的平均密度；V2—鞘液入口處鞘液的平均流速；V4—檢測區(qū)出口處的混合流體流體的平均速度。

根據(jù)流體在檢測區(qū)出口呈拋物面的性質(zhì)，可得：

綜合上式（1）～式（5）可得：

由于檢測區(qū)的樣本流的直徑相對于檢測區(qū)直徑來說非常小，故檢測區(qū)的流體的平均密度可以近似的等同于鞘液密度，故聚焦直徑的最終理論計算公式為：

通過上述聚焦直徑的理論計算式（7）可以推測，樣品流的聚焦直徑與鞘液和樣品液的流度比、樣本流入口直徑、鞘液入口直徑、檢測區(qū)直徑有關(guān)，聚焦直徑隨著鞘液和樣本液速度之比的增大而逐漸減小，隨著樣本流入口直徑增大而減小，隨著鞘液入口直徑增大而減小，而在檢測區(qū)直徑越小時，樣本流聚焦寬度也越小。為了驗證上述推測，下面我們將通過Fluent軟件對其進行仿真分析，通過我們的仿真結(jié)果來判斷這四個因素對其影響規(guī)律，并且通過設計正交實驗，找出影響其聚焦直徑的主次因素。

3 各關(guān)鍵參數(shù)仿真與分析

3.1 初始值和邊界條件的給定

各仿真初始值為：流動室總長度為50mm，進樣區(qū)長度為25mm，鞘液入口位置為5mm，進樣區(qū)內(nèi)的進樣針長度為21mm，檢測區(qū)的長度為15mm，流動室進樣區(qū)直徑為5mm，樣本液入口直徑為0.8mm，鞘液入口直徑為1mm，鞘液入口角度為30°，檢測區(qū)直徑為0.4mm。

依據(jù)上述結(jié)構(gòu)參數(shù)，利用Fluent主要對鞘液流速、樣品流入口直徑、鞘液入口直徑、檢測區(qū)直徑這四個參數(shù)進行分仿真分析。流體屬性和邊界條件的設定，如表1所示。在改變其中一個參數(shù)的情況下，其他的參數(shù)保持默認設置，對其進行數(shù)值仿真計算。

表1 流體屬性和邊界條件設置Tab.1 Fluid Properties and Boundary Conditions

3.2 探究鞘液流速對樣本流聚焦直徑的影響

為了探究鞘液流速對樣本流聚焦直徑的影響，在保持其它條件不變的前提下，作為變量的鞘液流速的變化范圍為（0.11-0.16），在此變量取值范圍內(nèi)對其分為六組實驗進行仿真分析，仿真結(jié)果整理，如圖2所示。

圖2 聚焦直徑與鞘流流速的關(guān)系Fig.2 The Relationship Between the Focus Diameter and the Sheath Flow Velocity

通過圖2可以看出，樣本流聚焦直徑隨著鞘液流的增大而減小，且仿真結(jié)果與理論計算結(jié)果的誤差范圍為（1.1～4.7）%，仿真結(jié)果與理論計算結(jié)果基本一致，說明我們的仿真結(jié)果比較準確。

3.3 探究樣本流入口直徑對樣本流聚焦直徑的影響

為了探究樣本流入口直徑對樣本流聚焦直徑的影響，在保持其它條件不變的前提下，作為變量的樣本流入口直徑的變化范圍為（0.5～0.8），在此變量取值范圍內(nèi)對其分為六組實驗進行仿真分析，仿真結(jié)果整理，如圖3所示。

圖3 聚焦直徑與樣本流入口直徑的關(guān)系Fig.3 The Relationship Between the Focus Diameter and the Diameter of the Sample Inlet

通過圖3可以看出，樣本流聚焦直徑隨著樣本流入口直徑的增大而增大，仿真結(jié)果與理論計算結(jié)果的誤差范圍為（12.2～13.5）%，誤差在可接受范圍之內(nèi)，仿真結(jié)果能夠較為準確的反應樣本流入口直徑對樣本流聚焦直徑的影響規(guī)律。

3.4 探究鞘液入口直徑對樣本流聚焦直徑的影響

為了探究鞘液入口直徑對樣本流聚焦直徑的影響，在保持其它條件不變的前提下，作為變量的鞘液入口直徑的變化范圍為（0.5～1.5），在此變量取值范圍內(nèi)對其分為六組實驗進行仿真分析，仿真結(jié)果整理，如圖4所示。通過圖4可以看出，樣本流聚焦直徑隨著鞘液入口直徑的增大而減小，仿真結(jié)果與理論計算結(jié)果的誤差范圍為（6.5～13.8）%，最大誤差＜15%，在可接受范圍之內(nèi)，驗證了鞘液入口直徑與樣本流聚焦直徑之間關(guān)系的準確性。

圖4 聚焦直徑與鞘液入口直徑的關(guān)系Fig.4 The Relationship Between the Focus Diameter and the Inlet Diameter of the Sheath

3.5 探究檢測區(qū)直徑對樣本流聚焦直徑的影響

為了探究檢測區(qū)直徑對樣本流聚焦直徑的影響，在保持其它條件不變的前提下，作為變量的檢測區(qū)直徑的變化范圍為（0.2～0.7），在此變量取值范圍內(nèi)對其分為六組實驗進行仿真分析，仿真結(jié)果整理，如圖5所示。通過圖5可以看出，樣本流聚焦直徑隨著檢測區(qū)直徑的增大而增大，仿真結(jié)果與理論計算結(jié)果的誤差范圍為（5.3～14.3）%，最大誤差＜15%，在可接受范圍之內(nèi)，仿真結(jié)果比較準確。

圖5 聚集直徑與檢測區(qū)直徑的關(guān)系Fig.5 The Relationship Between the Aggregate Diameter and the Diameter of the Detection Region

4 正交實驗

為了繼續(xù)探討這四個影響因素對樣本流聚焦寬度影響程度及識別出主次因素，為從結(jié)構(gòu)參數(shù)上來優(yōu)化流動室提供理論指導依據(jù)，下面將會針對以上因素設計正交實驗。本次正交實驗采用四因素四水平正交實驗表，各參數(shù)的取值范圍，如圖6所示。

圖6 四因素四水平正交實驗表參數(shù)的取值范圍Fig.6 The Parameter Range of the Four-Factor Four-Level Orthogonal Experimental Table

圖中這行所在的四個數(shù)分別是因素：鞘液速度、樣本流入口直徑、鞘液入口直徑、檢測區(qū)直徑的第1水平所在的實驗中對應的聚焦直徑之和；K2，K3，K4每一行的四個數(shù)依次為上述四個因素的第2水平、第3水平和第4水平所在的實驗中對應的聚焦直徑之和，L1，L2，L3，L4，每行的每個數(shù)，依次是 K1，K2，K3，K4每行對應的每個數(shù)的均值（即為 K/4）；極差是 L1，L2，L3，L4每一列中最大值與最小值的差值。極差值的大小可以判斷因素的水平改變對我們實驗的評價指標的影響大小。極差值越大，說明那一列所在的因素對實驗結(jié)果產(chǎn)生的影響越大，極差值最大，則那一列所在的因素就是影響我們實驗評價指標最重要的因素。

表2 正交實驗表Tab.2 Orthogonal Experiment Table

通過對表2中數(shù)據(jù)的分析可知，這四列的極差分別為0.004，0.003，0.011，0.008，鞘液入口直徑的極差是最大，其次是檢測區(qū)直徑，鞘液流速和樣本流入口直徑的極差比較接近，所以各因素對樣本聚焦直徑的影響按大小次序應當是鞘液入口直徑，檢測區(qū)直徑，鞘液流速，樣本流入口直徑。其中最主要的影響因素是鞘液入口直徑和檢測區(qū)直徑。

5 結(jié)論

通過對流動室物理模型進行理論推導，得出了樣本流聚焦直徑的理論計算公式，并且結(jié)合Fluent軟件模擬仿真鞘液流速、樣本流入口直徑、鞘液入口直徑、檢測區(qū)直徑這四個因素對樣本流的聚焦直徑的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)在保持其它條件不變的情況下，聚焦直徑隨著鞘液流速的增大而逐漸減小，隨著樣本流入口直徑增大而增大，隨著鞘液入口直徑增大而減小，而在檢測區(qū)直徑越小時，樣本流聚焦寬度也越小，同時通過正交實驗發(fā)現(xiàn)最主要的影響因素是鞘液入口直徑和檢測區(qū)直徑，其次是鞘液流速，樣本流入口直徑。然而一味地為追求聚焦效果而增大鞘液流速，將會導致鞘流流量激增，造成不必要的浪費，同時也會給檢測系統(tǒng)帶來壓力；也不能一味的降低樣本流速，這樣的話就會造成樣本流量不足從而影響儀器檢測的快速性。在鞘液入口直徑過大時，鞘液進入進樣區(qū)時將會撞擊到進樣管然后再反射。這無疑將增加了鞘液的湍動程度不利于層流的形成，并且增大了鞘液流量，使得檢測成本增加。通過仿真實驗可知，當檢測區(qū)直徑＜0.2mm，在聚焦區(qū)會產(chǎn)生湍流，造成噴嘴處的堵塞。通過正交實驗可知樣本流入口直徑對聚焦效果的影響是最小的，所以不必過于追求聚焦效果而減小樣本流入口直徑，進樣針不應小于0.5mm，過小的話會增加加工難度。通過上述的結(jié)論為今后我們優(yōu)化流動室結(jié)構(gòu)設計提供了理論依據(jù)。