張開娟 云驁 楊猛 盧艷 王文華

摘要：防御素在抗生素取代方面有良好的發(fā)展前景，但目前在防御素大規(guī)模表達(dá)方面仍有難點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)著重探究如何實(shí)現(xiàn)防御素的大規(guī)模表達(dá)。實(shí)驗(yàn)通過設(shè)計(jì)目的基因引物、PCR擴(kuò)增目的基因、將雞8防御素7（AvBD7）基因克隆到大腸桿菌BL21表達(dá)載體質(zhì)粒pET32a中、擴(kuò)增大腸桿菌、對(duì)雞AvBD7基因進(jìn)行鑒定、分離純化目的蛋白并進(jìn)行檢測的過程方法，完成重組雞AvBD7基因的克隆與表達(dá)，得到雞AvBD7基因可以在大腸桿菌BL21中表達(dá)的結(jié)論，為雞AvBD7基因的進(jìn)一步臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：β-防御素；原核表達(dá)；蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)；蛋白質(zhì)檢測

中圖分類號(hào)：S8 31.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：2095-9737（2018）06-0001-04

防御素是一種具有廣譜高效的抗微生物活性[1]和非特異性細(xì)胞毒作用及調(diào)節(jié)體內(nèi)適應(yīng)性免疫的陽離子活性肽[2]，具有獨(dú)特的抗菌機(jī)理。早在1965年由Hrish等首次從兔的PMN中提取出1種具有殺菌活性的陽離子蛋白，稱為“吞噬素”，之后Zeya和Spitznageleta發(fā)現(xiàn)此陽離子活性蛋白富含精氨酸和半胱氨酸，并將其命名為“溶酶體陽離子蛋白”[3]。20世紀(jì)80年代，Ganz等由于其廣譜的抗微生物活性首次將其命名為“防御素”，且Evans首次從雞的異嗜性白細(xì)胞中分別純化得到Ga-ll～2[4]，之后國際統(tǒng)一將防御素命名為AvBD。8防御素最先從牛的支氣管黏膜上皮細(xì)胞中分離得到，雞中的防御素均為β-防御素，β-防御素7主要分布于雞的骨髓[5-6]。

防御素相對(duì)分子質(zhì)量較小，熱穩(wěn)定性和水溶性均較好，可以在腸道內(nèi)吸收，且防御素屬于多肽成分，在體內(nèi)容易被蛋白酶降解為氨基酸，動(dòng)物采食后在體內(nèi)一般無殘留，故在畜牧業(yè)中有良好的應(yīng)用前景。但防御素在雞體內(nèi)含量較低，對(duì)其進(jìn)行提取純化不僅在技術(shù)上有一定的難度，而且若想獲得大量的目的蛋白，需要投入大量的人力物力。通過基因工程可實(shí)現(xiàn)防御素的大量表達(dá)，使其成為一種不易使病原微生物產(chǎn)生耐藥性的、具有良好前景的“抗生素替代品”[7-8]，減少抗生素廣泛運(yùn)用帶來的危害?；陔uβ-防御素1—6的研究基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)選用遺傳背景清楚、生長繁殖快、轉(zhuǎn)化效率高、成本低廉的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)雞AvBD7基因進(jìn)行初步研究，完成雞AvBD7基因的克隆與表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)菌種及質(zhì)粒載體：菌株大腸桿菌BL21、質(zhì)粒載體pET32a由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物分子病理實(shí)驗(yàn)室提供。

主要試劑：限制性內(nèi)切酶EcoR I、Not I、T4DNA連接酶、TaKaRAa DNA marker購于寶生物公司，質(zhì)粒提取、PCR產(chǎn)物純化試劑盒與RNA提取試劑盒購于天根公司，SDSPAGE凝膠快速配置試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)：P0012AC）購于碧云天公司。

主要儀器：PCR儀購于Eppendorf公司，恒溫培養(yǎng)箱與超凈工作臺(tái)購于上海博訊公司，凝膠成像系統(tǒng)購于北京君意公司，恒溫?fù)u床購自上海申能博彩公司，細(xì)胞超聲波粉碎機(jī)購于寧波新芝生物有限公司，SDS- PAGE電泳槽購于北京六一公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)Genbank中登記的雞AvBD7基因序列（登錄號(hào)NM_ 001001194.1），應(yīng)用Premier5.o軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物。AvBD7 F的5端有EcoRI酶切位點(diǎn)，AvBD7 R的5端有NotI酶切位點(diǎn)。設(shè)計(jì)好的引物由華大基因科技公司合成。PCR擴(kuò)增所用引物（見表1）。

1.2.2

PCR擴(kuò)增雞AvBD7基因序列

以雞AvBD7基因序列為模板，用合成的引物擴(kuò)增出雞AvBD7基因序列。PCR反應(yīng)步驟：94℃變性5 min；開始將下面三個(gè)步驟進(jìn)行32個(gè)循環(huán)：變性（94℃，40 s），退火（59℃，30 s），復(fù)性（72℃，l min）；最后72℃反應(yīng)10 min。得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳。切下含雞AvBD7基因條帶的膠塊進(jìn)行純化后送華大公司測序。

下面是含雞AvBD7基因膠塊純化的步驟（使用前先在漂洗液PW中加入無水乙醇，加人體積參照瓶上的標(biāo)簽）。

柱平衡步驟：本步驟需要使用當(dāng)天處理過的柱子。向放人收集管中的吸附柱CA2中加入500 μL平衡液BL，12000 r/min離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放人收集管中。

將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下，注意要盡量切除多余部分。將條帶放人干凈的離心管中，稱取重量。

向膠塊中加入等倍體積溶液PN。如果凝膠重為0.lg，其體積可視為100 μL，則加入100 μL PN溶液。將體系于50℃水浴放置，其間不斷溫和的上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解，若還有未溶的膠塊，則繼續(xù)放置幾分鐘或再補(bǔ)加一些溶膠液，直至膠塊完全溶解。膠塊體積過大時(shí)，需事先將膠塊切成碎塊。

將上一步所得溶液加入置于收集管中的吸附柱CA2中，室溫放置2 min，12000 r/min離心30～60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中。吸附柱容積為800μL，若樣品體積大于800 μL，需分批加入。

確認(rèn)已加入無水乙醇后，向吸附柱CA2中加入600 μL漂洗液PW，12000 r/min離心30～60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中。

重復(fù)上一步操作步驟。

將吸附柱CA2放回收集管中，12000 r/min離心2 min，盡量除盡漂洗液，再將吸附柱CA2置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底的晾干，以防止殘留的漂洗液影響下一步實(shí)驗(yàn)。

將吸附柱CA2放于一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量洗脫緩沖液BE，室溫放置2 min，12000 r/min離心2 min收集DNA溶液。進(jìn)行后續(xù)測序時(shí)，需使用ddH20做洗脫液，并保證其pH值在7.O～8.5范圍內(nèi)，pH值低于7.0會(huì)影響洗脫效率。另外DNA產(chǎn)物應(yīng)該保存在 20℃，以防DNA降解。DNA也可以用緩沖液（lOmMTris- Cl，pH8.o）洗脫。為了提高DNA回收量，需將離心得到的溶液重新加回離心吸附柱中，室溫放置2 min，12000 r/min離心2 min，將DNA溶液收集到離心管中。

1.2.3 重組雞AvBD7基因表達(dá)載體的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后用EcoRI和NotI雙酶切，酶切后對(duì)其進(jìn)行回收純化，然后與經(jīng)雙酶切并純化的質(zhì)粒pET32a連接，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞并用具有氨芐青霉素的平板篩選轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子在平板上生長出兩個(gè)菌落，搖菌擴(kuò)增之后，分別進(jìn)行菌落PCR，所用引物與目的基因引物相同。經(jīng)測定，兩個(gè)菌落均成陽性，但其中一個(gè)菌落條帶更加明亮。選取此菌落轉(zhuǎn)化子進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將陽性菌送華大基因公司測序，并將連接轉(zhuǎn)化菌體序列與實(shí)驗(yàn)PCR所得基因序列作對(duì)比。

雞AvBD7基因雙酶切反應(yīng)體系和連接轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系（見表2、表3）

1.2.4重組雞AvBD7基因的誘導(dǎo)表達(dá)與提取純化

將測序正確的菌株接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)至渾濁后加入蛋白誘導(dǎo)劑IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間，收集菌體，超聲破碎，收取沉淀和上清液分別做SDS- PAGE，確定其蛋白表達(dá)是在沉淀包涵體中。然后再經(jīng)過條件優(yōu)化摸索出最佳誘導(dǎo)的IPTG濃度及時(shí)間，從而提高蛋白的表達(dá)，即將AvBD7載體菌擴(kuò)增至OD=0.6，加入蛋白誘導(dǎo)劑IPTG使其終濃度為1 mmol/L，37℃恒溫?fù)u床繼續(xù)培養(yǎng)6h，分別取加入IPTG后Oh、2h、4h、6h4個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的菌體，超聲破碎，取包涵體并進(jìn)行包涵體純化后，進(jìn)行SDSPAGE檢測。檢測雞AvBD7基因的誘導(dǎo)表達(dá)情況。

包涵體的提取與純化步驟：將大量表達(dá)的菌液收集并分裝入lOmL離心管，4℃，8000 r/min，離心25 min；根據(jù)收集菌量加PBS重懸菌液，分裝于1.5 mL的EP管。用超聲破碎儀破碎大腸桿菌，4℃，12000 r/min，離心15 min，棄上清液。用9倍體積的洗滌液I重懸沉淀，室溫靜置5 min；12000 r/min，15 min，棄上清液。用9倍體積的洗滌液Ⅱ重懸沉淀，室溫靜置5 min；12000 r/min，15 min，棄上清。用9倍體積的洗滌液重懸沉淀，室溫靜置5 min；12000 r/min，15 min，棄上清。按照100 mL菌液加4 mL溶解液的比例加入溶解液充分溶解th后，12000 r/min，15 min，所得上清液就是溶解的包涵體。

2 結(jié)果

2.1 PCR獲得雞AvBD7基因

PCR擴(kuò)增得到約300bp的雞AvBD7基因序列，如圖1。雞AvBD7基因大小是514bp，PCR所得雞AvBD7基因包含編碼區(qū)的基因片段。

PCR所得雞AvBD7基因與從Genbank中所獲得的基因符合度較高，CDS區(qū)完全一致，如下圖2、3。

2.2 成功構(gòu)建重組雞AvBD7基因表達(dá)載體

獲得EcoRI和Notl雙酶切并回收純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如圖4。

表達(dá)載體質(zhì)粒pET32a雙酶切，如圖6。

對(duì)大腸桿菌BL21轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR，得到兩個(gè)陽性菌落，如圖5。

連接轉(zhuǎn)化菌體序列與實(shí)驗(yàn)PCR所得基因序列作對(duì)比，可見雞AvBD7基因已正確連接到菌體中，如圖7。

2.3 完成重組雞AvBD7基因的誘導(dǎo)表達(dá)與提取純化

雞AvBD7成熟肽表達(dá)的大小在6kb左右，但本實(shí)驗(yàn)重組表達(dá)的雞AvBD7基因因與his標(biāo)簽的共同表達(dá)，故大小約在20kb。如圖可見蛋白在沉淀中表達(dá)較多，可證明蛋白是在包涵體中表達(dá)，如圖8。

獲得時(shí)間梯度下，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)，由圖可見，雞AvBD7蛋白表達(dá)量隨時(shí)間梯度變化，且在4h表達(dá)的最多，如圖9。

3 討論

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在家禽的集中化養(yǎng)殖模式中，抗生素被廣泛應(yīng)用。然而長期使用抗生素會(huì)使禽群的耐藥性提高，且抗生素易在家禽體內(nèi)殘留，不利于養(yǎng)殖業(yè)健康的發(fā)展。之前的研究表明防御素具有廣譜高效的抗微生物活性和獨(dú)特的抗菌特性，可以避免禽群耐藥性的產(chǎn)生，且作為一種天然抗菌肽，防御素也不存在藥物殘留的問題，可以有效提高農(nóng)產(chǎn)品的安全性[9]，由此可見，防御素具有極高的研究意義。但天然防御素在動(dòng)物體內(nèi)含量少且提取操作較為復(fù)雜，成本高，若利用基因工程手段構(gòu)建防御素基因表達(dá)載體，將載體轉(zhuǎn)入合適的宿主表達(dá)細(xì)胞，便能大量生產(chǎn)防御素，為防御素的廣泛利用提供有效的途徑[10]，因此防御素在基因工程上具有很大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

實(shí)驗(yàn)通過查閱文獻(xiàn)獲得防御素的基本信息，確立了對(duì)雞AvBD7基因的研究方向，根據(jù)Genbank中登記的雞AvBD7的基因序列設(shè)計(jì)出引物并使用質(zhì)粒pET32a完成雞AvBD7基因表達(dá)載體的構(gòu)建，利用轉(zhuǎn)化效率高且成本低廉的大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，成功誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)并運(yùn)用SDS - PAGE完成了對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的測定。由實(shí)驗(yàn)可得，100 mL LB菌液可得到4 mL濃度為100～200 μg/mL的蛋白質(zhì)溶液。為保證實(shí)驗(yàn)成功，實(shí)驗(yàn)操作中有許多需要注意的地方，例如在雞AvBD7基因膠體純化步驟中，洗脫液體積不應(yīng)小于30 μL，體積過小影響回收效率，且需要嚴(yán)格控制洗脫液的pH值來保證洗脫效率。

未來需要進(jìn)一步對(duì)雞AvBD7基因的作用進(jìn)行探究，例如對(duì)其在抗菌抑菌、抗腫瘤效果及其臨床應(yīng)用等方面進(jìn)探究，去發(fā)現(xiàn)當(dāng)前未被發(fā)現(xiàn)的性能，挖掘其更大的功能意義，使雞AvBD7基因的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的得到更大的提升。

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