楊衛(wèi)星

摘要 以尾巨桉DH32-28半木質(zhì)化萌發(fā)莖段為組織培養(yǎng)外植體材料，在不同的誘導(dǎo)、增殖和生根培養(yǎng)基條件下誘導(dǎo)不定芽，確定了適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，為加快優(yōu)良無(wú)性系分化速度、縮短培養(yǎng)周期、降低生產(chǎn)成本奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 尾巨桉DH32-28；外植體；組織培養(yǎng)

中圖分類號(hào) Q94；S792.39 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2018）13-0138-02

Study on Tissue Culture and Rapid Propagation of Eucalyptus grandis×E.urophylla DH32-28

YANG Wei-xing

（Guangxi Paiyangshan State Forest Farm，Ningming Guangxi 532500）

Abstract The semi-lignified stem sections of Eucalyptus grandis×E.urophylla DH32-28 were used as tissue culture explant materials.The adventitious buds were induced by different induction，proliferation and rooting conditions.The suitable medium and culture conditions were determined，which laid a theoretical foundation for speeding up the differentiation speed of fine clones，shortening the period of culture and reducing the cost of production.

Key words Eucalyptus grandis×E.urophylla DH32-28；explant；tissue culture

桉樹(shù)為桃金娘科（Myrtlefamily）桉屬（Eucalyptus）常綠高大喬木，原產(chǎn)地為澳大利亞[1]。桉樹(shù)耐炎熱干旱，不耐寒，抗病性強(qiáng)，生長(zhǎng)速度快，生命力強(qiáng)，用途廣泛，栽培種植經(jīng)濟(jì)效益可觀，在世界上多個(gè)國(guó)家和地區(qū)均有栽植，是世界上著名的三大速生樹(shù)種之一[2]。我國(guó)桉樹(shù)栽培歷史已逾100年，在林業(yè)經(jīng)濟(jì)樹(shù)種中占有重要地位[3]。尾巨桉DH32-28是廣西國(guó)有東門林場(chǎng)從純種子代測(cè)試和雜交育種試驗(yàn)中選育的優(yōu)良桉樹(shù)品種，具有年生長(zhǎng)量高、抗逆性和適用性強(qiáng)且性狀穩(wěn)定的特點(diǎn)。目前，已通過(guò)國(guó)家林木良種審定，已在營(yíng)林生產(chǎn)中大規(guī)模推廣應(yīng)用，并產(chǎn)生了良好的經(jīng)濟(jì)效應(yīng)、社會(huì)效應(yīng)及生態(tài)效應(yīng)[3-6]。

近年來(lái)，組培擴(kuò)繁技術(shù)應(yīng)用于林木育種已越來(lái)越成熟，通過(guò)組培擴(kuò)繁技術(shù)能夠快速獲得高質(zhì)量、穩(wěn)定遺傳的種苗。據(jù)相關(guān)資料顯示，目前尚無(wú)關(guān)于尾巨桉DH32-28的組培技術(shù)資料和論文。因此，建立尾巨桉DH32-28組織培養(yǎng)與再生體系，一方面能夠突破商品化規(guī)模育苗瓶頸，另一方面又有利于轉(zhuǎn)基因體系的建立，為通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段進(jìn)行桉樹(shù)性狀改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

外植體選用三年生尾巨桉DH32-28半木質(zhì)化萌發(fā)莖段。雨后天氣晴朗3 d后，于10：00—15：00采集萌芽條；用飽和洗衣粉溶液刷洗干凈，再進(jìn)行滅菌處理，切成1～2 cm長(zhǎng)莖段，每段帶1個(gè)節(jié)；接種到培養(yǎng)基上，置于光強(qiáng)3 000 lx、溫度25 ℃條件下誘導(dǎo)不定芽。培養(yǎng)條件為溫度24～26 ℃、光照12～14 h/d、光強(qiáng)2 500～3 000 lx，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體取材與滅菌

由表2可知，處理C為最佳方案，污染率較處理A、B、D分別高35.0%、54.5%、11.2%，但處理A、B的灼傷率分別是處理C的6.0、5.3倍，較處理D低27.1%；處理C成活率最高，達(dá)到53.7%，分別較處理A、B、D高46.3%、62.2%、17.0%；且滅菌后的外植體生長(zhǎng)良好、萌芽較快。這說(shuō)明酒精+氯化汞的消毒方法能夠有效降低外植體污染率，但會(huì)一定程度上傷害苗木，導(dǎo)致外植體褐化、灼傷甚至死亡。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，將10%次氯酸鈉消毒過(guò)程分成2次，可在保證滅菌效果的同時(shí)，有效緩解黃化、白化、灼傷現(xiàn)象。

2.2 桉樹(shù)組織培養(yǎng)體系的建立

由表3可知，誘導(dǎo)培養(yǎng)基的激素濃度以處理C效果最佳，增殖倍數(shù)適宜，芽長(zhǎng)勢(shì)及狀態(tài)良好，萌芽健壯，葉片舒展，速度快，長(zhǎng)勢(shì)旺；處理A、B、D保存率分別較處理C低6.8%、6.0%、5.0%。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在激素不適宜時(shí)，容易出現(xiàn)褐化和玻璃化現(xiàn)象，生長(zhǎng)緩慢，難以馴化。濃度過(guò)高時(shí)，芽生長(zhǎng)速度快，但質(zhì)量差、變異增多，易形成無(wú)效芽；濃度過(guò)低時(shí)，芽生長(zhǎng)速度減緩、數(shù)量減少，延緩了育苗生產(chǎn)進(jìn)度。

由表4可知，增殖培養(yǎng)階段以處理B效果最佳，增殖個(gè)數(shù)適宜，達(dá)到3.7個(gè)，芽分化良好。處理A激素濃度過(guò)高，增殖個(gè)數(shù)和莖芽伸長(zhǎng)較處理B低37.8%和24.1%，長(zhǎng)勢(shì)較弱，芽點(diǎn)過(guò)密，基部多見(jiàn)愈傷團(tuán)塊；處理C、D激素濃度偏低，增殖個(gè)數(shù)和莖芽伸長(zhǎng)分別較處理B低16.2%、48.6%和10.3%、31.0%，莖葉細(xì)長(zhǎng)，長(zhǎng)勢(shì)逐漸減弱。

由表5可知，生根培養(yǎng)階段以處理B效果最佳，根系發(fā)達(dá)，側(cè)根較多，根長(zhǎng)達(dá)7.6 cm，長(zhǎng)勢(shì)整齊旺盛，移栽成活率達(dá)98%。處理A激素濃度過(guò)高，苗高較處理B低22.2%，根長(zhǎng)較處理B低22.4%，生根率較處理B低8.2%，培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)褐化、根基部膨大、部分不生根現(xiàn)象，長(zhǎng)勢(shì)弱且不整齊，移栽成活率低。處理C、D激素濃度偏低，苗高較處理B低17.8%和35.6%，根長(zhǎng)較處理B低18.4%和30.3%，生根率較處理B低6.1%和16.3%，根系不發(fā)達(dá)，側(cè)根少，生長(zhǎng)緩慢，長(zhǎng)勢(shì)弱且不整齊，移栽成活率低。

3 討論與結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，尾巨桉DH32-28最佳外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.4 mg/L，萌芽率為87.5%；最佳增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.7 mg/L+NAA 0.35 mg/L，增殖個(gè)數(shù)為3.7個(gè)；最佳生根培養(yǎng)基1/2MS+IBA 0.3 mg/L+ABT1 0.6 mg/L，生根率可達(dá)98%，根長(zhǎng)7.6 cm。

外植體采集后，應(yīng)立刻用飽和洗衣粉水刷洗干凈，并及時(shí)清洗消毒，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，以最大程度地保持枝條活性，提高萌芽率，降低污染率。酒精+氯化汞外植體消毒法污染率低，但對(duì)外植體傷害較大，褐化現(xiàn)象嚴(yán)重；新潔爾滅+次氯酸鈉消毒法的污染率較高，但對(duì)外植體傷害較小，萌芽較快且成活率高[7]。

外植體誘導(dǎo)階段不同的激素濃度及配比對(duì)誘導(dǎo)結(jié)果影響較大，MS+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.4 mg/L誘導(dǎo)出芽效果最好。誘導(dǎo)階段激素濃度過(guò)高時(shí)，易發(fā)生畸形異變，且愈傷組織呈白色松散團(tuán)狀；濃度過(guò)低時(shí)，芽分化延遲[8]。增殖培養(yǎng)階段激素濃度過(guò)高也會(huì)出現(xiàn)畸形、玻璃化等現(xiàn)象。此外，工廠化生產(chǎn)中還應(yīng)注意調(diào)節(jié)好暗培養(yǎng)、弱光培養(yǎng)及自然光培養(yǎng)時(shí)間，才能夠獲得長(zhǎng)勢(shì)旺盛、增殖適宜的無(wú)菌芽，建立有效的無(wú)菌繁殖體系[7]。桉樹(shù)根系發(fā)育階段以自然光照射，有利于生根培養(yǎng)過(guò)程的根系發(fā)育、莖葉生長(zhǎng)以及植株形成木質(zhì)化，同時(shí)也可提高移栽成活率。此外，工廠化生產(chǎn)中生根研究的關(guān)鍵是減輕莖段基部褐化現(xiàn)象[8-10]，適量加入抗壞血酸（0.01～0.02 mg/L）和活性炭（40 mg/L）可以有效抑制褐化。

建立無(wú)菌芽誘導(dǎo)和無(wú)菌體系是組培快繁的核心技術(shù)環(huán)節(jié)。隨著桉樹(shù)種植規(guī)模的不斷擴(kuò)大，對(duì)桉樹(shù)組織培養(yǎng)技術(shù)的要求也不斷提高[11]，如何加快優(yōu)良無(wú)性系分化速度、縮短培養(yǎng)周期、降低生產(chǎn)成本，有待進(jìn)一步的研究。

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