李麗芳，賈球鋒，喬 琳，張 晉 ，李嘉威 ，張瑞強(qiáng)

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)信息學(xué)院，山西太谷030800；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷030801）

神經(jīng)生長因子（Nerve Growth Factor，NGF）是大約在60 a前首次被發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)神經(jīng)生長的蛋白質(zhì)，對產(chǎn)前感覺神經(jīng)和交感神經(jīng)的生長必不可少[1]。許多資料報道，NGF除具有對神經(jīng)元的作用外，還具有多方面的生物學(xué)效應(yīng)，目前也有研究表明，NGF還與阿爾茨海默病和頑固性疼痛有關(guān)[2]，其廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等。而NGF發(fā)揮效應(yīng)是通過NGFR（神經(jīng)生長因子受體）介導(dǎo)的，已發(fā)現(xiàn)NGF有2種受體，Trk為高親和力受體，P75為低親和力受體。P75受體在細(xì)胞生殖及凋亡中有雙重作用[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，在雄性動物的生殖系統(tǒng)中NGF及NGFR均有不同程度的表達(dá)，它們可以通過自分泌和旁分泌途徑對生殖器官的生長、發(fā)育及功能起重要的調(diào)控作用[5]。通過對不同物種的研究發(fā)現(xiàn)，NGF的表達(dá)在物種間存在一定的差異性。有關(guān)NGF在生殖系統(tǒng)中的研究主要以哺乳動物為主[6-9]，禽類相關(guān)的研究內(nèi)容報道較少。

本研究采用Western blot技術(shù)及免疫組織化學(xué)技術(shù)對雄雞睪丸組織NGF及其受體P75的定位及表達(dá)情況進(jìn)行研究，探討NGF及P75蛋白在雄雞睪丸組織中的表達(dá)規(guī)律及其在雄性生殖系統(tǒng)機(jī)能調(diào)節(jié)中所起的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 分別于14，20，24，35周齡時對山西省太谷縣回馬村一養(yǎng)雞場同批次飼養(yǎng)的雄雞采樣，每次取4只重復(fù)，共取16只。宰殺后取睪丸組織，一部分經(jīng)液氮速凍處理后，暫存于-80℃冰箱，用于提取總蛋白；另取一部分立刻投入Bouins固定液中，用于組織切片的制作。

1.1.2 試劑 組織裂解液RIPA（含PMSF），購自北京Solarbio公司。一抗（多克隆兔抗NGF和P75抗體）、二抗，均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。DAB試劑盒購自天津灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，ECL顯色液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，其余為常規(guī)試劑。

1.2 方法

1.2.1 總蛋白提取及Western blot鑒定 稱取組織樣品約0.1 g，加入液氮研磨成粉末，之后加入1 mL RIPA裂解液，冰上裂解約30 min，期間多次振蕩混勻，12 000 r/min，4℃離心5 min后取上清，吸取50 μL用微量蛋白測定儀測定蛋白含量。每孔加入約20 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，然后再經(jīng)100 mA，100 min冰浴作用將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，封閉液封閉2 h。加入兔抗NGF及P75蛋白抗體（1∶1 000），4℃孵育過夜。次日TBS-T洗膜3次，每次 8 min。二抗（1∶5 000）室溫孵育 2 h，TBS-T洗膜3次，每次8 min。最后用ECL顯色液顯色并拍照保存。

掃描NC膜，應(yīng)用FluorChem Q SA軟件對結(jié)果進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參與目的比較進(jìn)行半定量分析，計算公式如下。

1.2.2 免疫組織化學(xué)技術(shù) 取經(jīng)Bouins固定的睪丸組織，石蠟包埋，切片脫蠟至水，PBS緩沖液漂洗3次，每次5 min，滴加3%H2O2在室溫條件下孵育15 min，以消除組織中存在的內(nèi)源性過氧化物酶，PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min，用A液（正常山羊血清工作液）封閉后滴加一抗（均為1∶300），陰性對照用PBS緩沖液代替一抗，4℃過夜，PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min，再滴加B液（生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG工作液），PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min，滴加C液（辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液），PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)石蠟切片脫水、樹膠封片。顯微鏡下觀察、拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 Western blot檢測結(jié)果分析

Western blot結(jié)果顯示，雄雞睪丸組織總蛋白中存在能與兔抗NGF和兔抗P75抗體發(fā)生免疫陽性反應(yīng)的蛋白條帶，P75分子質(zhì)量大小約為75 ku，NGF分子質(zhì)量大小約為26 ku（圖1）。本試驗結(jié)果顯示，NGF及其受體在雄雞睪丸內(nèi)不同發(fā)育階段均有表達(dá)，所用一抗特異性好。

通過FluorChem Q SA軟件分析灰度值，由圖2可知，NGF及P75受體蛋白含量隨日齡增加呈遞增趨勢，但P75受體蛋白增加的階段性不如NGF明顯，且在35周齡左右接近峰值。

2.2 免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果分析

NGF及其受體P75免疫組織化學(xué)染色結(jié)果如圖3所示，雄雞睪丸組織的曲細(xì)精管在性成熟前以圓筒形為主，性成熟后以橢圓型為主。支持細(xì)胞呈不規(guī)則形，曲細(xì)精管與間質(zhì)細(xì)胞的聯(lián)系并不緊密，且間質(zhì)細(xì)胞不發(fā)達(dá)。NGF及P75蛋白在各發(fā)育階段均有陽性反應(yīng)，且均勻分布于核周細(xì)胞質(zhì)中，對照組未觀察到陽性細(xì)胞。

14周齡雄雞睪丸組織內(nèi)曲細(xì)精管腔不明顯，主要為精原細(xì)胞、支持細(xì)胞及少量間質(zhì)細(xì)胞所構(gòu)成。精原細(xì)胞大多成群排列，精原細(xì)胞和支持細(xì)胞的界限不明顯。NGF及P75蛋白特異性免疫產(chǎn)物主要集中在支持細(xì)胞和精原細(xì)胞，間質(zhì)細(xì)胞含量較少。

20周齡開始隨著睪丸組織發(fā)育，曲細(xì)精管直徑增加，開始出現(xiàn)空腔。NGF及P75蛋白特異性免疫產(chǎn)物主要集中在各級生精細(xì)胞、支持細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞。

從20周齡至24周齡基本達(dá)到性成熟，并在35周齡達(dá)到最高峰。睪丸組織內(nèi)曲細(xì)精管管腔已十分明顯，可見各級精細(xì)胞及成熟精子，精原細(xì)胞呈多層排列。NGF及P75蛋白特異性免疫產(chǎn)物在各細(xì)胞中均可見。

對照組試驗切片中NGF及P75蛋白免疫反應(yīng)均為陰性。

3 討論

近年來，對NGF在非神經(jīng)組織內(nèi)的研究越來越多，NGF在生殖系統(tǒng)的作用也逐漸被揭示出來。BRIAN等[10]在1991年提出，睪丸不僅具有生精功能，同時也具有內(nèi)分泌功能。它能夠通過產(chǎn)生肽類生長因子，以自分泌和旁分泌的作用方式，參與細(xì)胞的生長、發(fā)育與成熟過程，且其中NGF的潛在作用可能是介導(dǎo)細(xì)胞間的相互作用。同時附睪也具有內(nèi)分泌功能，可通過分泌雄激素對儲存的精子的成熟和獲能起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，染氟可使大鼠附睪的內(nèi)部結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度的損傷，從而影響其功能[11]。吳建云等[12]在對大鼠睪丸組織中NGF的表達(dá)研究中發(fā)現(xiàn)，睪丸間質(zhì)細(xì)胞能夠分泌NGF，并通過與間質(zhì)細(xì)胞、生精細(xì)胞上的受體相結(jié)合，對睪丸的發(fā)育、組織形態(tài)的完善、生殖細(xì)胞的發(fā)生等起調(diào)節(jié)作用。

RUSSO等[13]于1999年在對NGF和其受體在小鼠胚胎期和發(fā)育過程（1，5，10，20 d）中睪丸組織的表達(dá)的動態(tài)觀察中發(fā)現(xiàn)，NGF及其受體的主要表達(dá)部位會隨日齡增加發(fā)生變化，早期主要存在于支持細(xì)胞，后期則存在于間質(zhì)細(xì)胞、管周樣細(xì)胞。LI等[6]對大鼠的研究表明，NGF主要位于間質(zhì)細(xì)胞及初級和次級精母細(xì)胞，在輸精管的上皮細(xì)胞和促性腺的上皮細(xì)胞中也存在著表達(dá)，而在成熟精子和支持細(xì)胞中呈陰性反應(yīng)。CUPP等[14]研究了胚胎期和出生后0～5 d的大鼠睪丸組織中的NGF及其受體的表達(dá)情況，結(jié)果表明，早期NGF及其受體主要存在于支持細(xì)胞，而后期則存在于間質(zhì)細(xì)胞和各級生精細(xì)胞中。這些研究表明，NGF及其受體在睪丸發(fā)育的不同階段均有表達(dá)，但表達(dá)部位有所不同。本試驗結(jié)果顯示，在睪丸發(fā)育階段表達(dá)產(chǎn)物主要集中在支持細(xì)胞，少量見于精原細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞，隨著雞性成熟的完成，NGF及其受體的表達(dá)產(chǎn)物主要見于支持細(xì)胞、精原細(xì)胞、各級精母細(xì)胞及精子中，間質(zhì)細(xì)胞中含量較少，這可能與雞的睪丸間質(zhì)細(xì)胞不發(fā)達(dá)有關(guān)。

LI等[6]通過免疫組織化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，在大鼠睪丸的間質(zhì)細(xì)胞、初級精母細(xì)胞與粗線期精子細(xì)胞中都有NGF的表達(dá)，這與對日本猴[7]和人類[8]的研究結(jié)果是相近的。但對日本猴的研究還發(fā)現(xiàn)，NGF在睪丸的支持細(xì)胞也有表達(dá)。咸華等[15]采用RT-PCR技術(shù)對出生后 1，7，14，28，56 d 小鼠睪丸組織中NGF mRNA的表達(dá)量進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，出生后 1，7，14，28，56 d 的小鼠睪丸組織內(nèi)均有 NGF mRNA的表達(dá)，且7d的表達(dá)量最高。胡永婷等[16]在對大鼠睪丸組織中NGF mRNA的研究中發(fā)現(xiàn)，NGF mRNA的表達(dá)量在21 d前呈上升趨勢，21 d達(dá)到峰值后逐漸下降至成年時并維持在一定水平。李麗芳等[17]采用實時熒光定量PCR技術(shù)對雄雞睪丸組織NGF mRNA的表達(dá)研究顯示，NGF mRNA在性成熟發(fā)育期（20～24周齡）雄雞睪丸組織中的表達(dá)量隨日齡增加呈上升趨勢，成年期（35周齡）有所下降。通過以上這些研究可以發(fā)現(xiàn)，NGF的表達(dá)在物種間存在一定的差異性。而在本試驗中，NGF及P75的蛋白表達(dá)量隨日齡增加而升高，且在35周齡基本達(dá)到峰值。

本研究以散養(yǎng)雄性土雞為對象，分析了NGF及P75在睪丸組織中的定位和表達(dá)，所得結(jié)果為分析其與睪丸組織的生長發(fā)育、性激素的分泌、精子的產(chǎn)生等生理學(xué)過程的關(guān)系提供了依據(jù)，為禽類生殖生理學(xué)研究奠定了重要的理論基礎(chǔ)，有助于闡明其在禽類生殖發(fā)育中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的分子機(jī)理。