姜軒，劉夢月，付超，馬吉飛，趙瑞利，石青青，胡燁，崔君

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天津地區(qū)規(guī)模化生豬場產腸毒素大腸桿菌的分離鑒定

姜軒，劉夢月，付超，馬吉飛，趙瑞利通信作者，石青青，胡燁，崔君

（天津農學院 動物科學與動物醫(yī)學學院，天津 300384）

具有特殊血清型的大腸桿菌對人與動物腸道有不同程度的致病性，其中以產腸毒素大腸桿菌（ETEC）危害較為嚴重。從天津地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)豬場采集 15 例腹瀉病豬的直腸拭子樣品，接種到 MH、麥康凱、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基進行細菌培養(yǎng)及革蘭染色鏡檢。選取培養(yǎng)基上形態(tài)不同的菌落進行生化試驗，16S rRNA 序列測定及 BLAST 分析，結果分離到的10株腸桿菌科細菌與大腸桿菌的同源率達 99.6%。合成大腸桿菌腸毒素 ST1、ST2、LT1、IR1 特異性引物，PCR 結果檢測到產 LT1 毒素、產 LT1 和 ST1 毒素及產 ST1 腸毒素的3株大腸桿菌。對分離出的產腸毒素 LTI、ST1 的菌株進行藥敏試驗，結果表明產腸毒素大腸桿菌對新霉素、克林霉素、慶大霉素、青霉素、頭孢曲松、丁胺卡那、頭孢呋辛、氟苯尼考敏感，為臨床產腸毒素大腸桿菌的監(jiān)測與防控提供依據。

產腸毒素大腸桿菌（ETEC）；腹瀉；分離鑒定；16S rRNA

大腸埃希菌（），革蘭陰性短桿菌，在分類上屬于腸桿菌科埃希菌屬。根據不同的生物學特性將致病性大腸桿菌分為 6 類：腸致病性大腸桿菌（EPEC）、腸侵襲性大腸桿菌（EIEC）、產腸毒性大腸桿菌（ETEC）、腸出血性大腸桿菌（EHEC）、腸黏附性大腸桿菌（EAEC）和彌散黏附性大腸桿菌（DAEC）。任繼平等[1]報道ETEC感染仔豬后，仔豬出現(xiàn)腸道炎癥反應，但 ETEC 對腸道的致病機理尚不清楚[2]。豬的大腸埃希菌感染包括仔豬黃白痢和水腫病、全身系統(tǒng)性感染癥、大腸埃希菌性乳房炎及泌尿感染癥等[3]。組成大腸桿菌的抗原成分十分復雜，由菌體抗原（O）、鞭毛抗原（H）和表面抗原（K）組成，這些不同的抗原成分決定大腸桿菌有不同的致病力，H 和 K 抗原有抗機體吞噬和抗補體的能力。

產腸毒素大腸桿菌是導致仔豬斷奶前腹瀉的主要病原，其致病性取決于他們在宿主小腸上皮細胞的定居能力和產腸毒素的能力[4]。美國農業(yè)部最近連續(xù)監(jiān)測報告表明致病性ETEC腹瀉仍然主要危害著養(yǎng)豬產業(yè)[5]。而ETEC的致病性主要來自O抗原和其毒力因子，ETEC最重要的毒力因子是腸毒素（Enterotoxin，Ent）和菌毛抗原（又稱黏附素 abhensin）[6]，腸毒素是 ETEC 在生長繁殖過程中釋放的外毒素，分為耐熱腸毒素（Heat-stable-enterotoxin，ST）和不耐熱腸毒素（Heat-Labile enterotoxin，LT）兩種。ETEC 的有些菌株只產生一種腸毒素，即LT或ST；有些則兩種均可產生。通常認為產生LT毒素的大腸桿菌較為常見，且危害較為嚴重。

本研究從天津地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)豬場采集腹瀉豬直腸拭子15份，進行細菌分離鑒定，從培養(yǎng)特性、生化特性、血清學、毒力因子及耐藥性等方面進行檢測，分離到產腸毒素LT1、產LT1和ST1 毒素及產ST1腸毒素的3株大腸桿菌，為天津地區(qū)規(guī)?；i場大腸桿菌腹瀉病的防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源

從天津地區(qū)某豬場采集腹瀉豬直腸拭子共 15 份，進行細菌分離培養(yǎng)。

1.1.2 主要儀器設備

恒溫培養(yǎng)箱（上海?，攲嶒炘O備有限公司）；生物顯微鏡（重慶奧特光學儀器有限公司）；超凈工作臺（型號 SW-CJ-2D 型）；PCR 儀（BIO RAD）；S1000 凝膠成像系統(tǒng)（BIO RAD）；穩(wěn)壓溫流電泳儀。

1.1.3 主要試劑

麥康凱瓊脂、MH 肉湯、瓊脂粉、伊紅-美藍瓊脂、血液瓊脂培養(yǎng)基、革蘭染液、PCR 引物（金唯智生物科技有限公司合成）；DNA-Marker（DL 2000）、5×Loading Buffer、2×Master Mix（均購自上海捷瑞生物工程有限公司）；1×TAE、核酸染色劑、腸桿菌科細菌生化鑒定管（購自杭州濱和微生物試劑有限公司）、Kovacs 氏靛基質試劑盒、甲基紅指示劑盒、V-P 試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離培養(yǎng)

取腹瀉豬的肛門拭子，劃線接種到 MH 瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃ 過夜培養(yǎng) 18～24 h；挑取 MH 瓊脂培養(yǎng)基上形態(tài)不同的單菌落分別接種到麥康凱、伊紅-美藍瓊脂培養(yǎng)基和血瓊脂培養(yǎng)基上， 37 ℃ 過夜培養(yǎng)，分別觀察記錄菌落形態(tài)。

1.2.2 革蘭染色鏡檢

分別在MH瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅-美藍瓊脂培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基上用接種環(huán)挑取單菌落于載玻片上，革蘭染色鏡檢。

1.2.3 生化試驗

將分離菌的純培養(yǎng)物進行枸櫞酸鹽利用試驗、靛基質試驗、乳糖發(fā)酵試驗、MR-VP 試驗等；篩選出菌株再做糖類分解試驗。使用時玻管上端用砂輪劃痕折斷，然后用接種針分別取菌液接種并覆蓋滅菌封口膜，置小試管架上于 37 ℃ 培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，按規(guī)定時間觀察記錄結果。設置空白對照，利于比對試驗結果[7]。

1.2.4 16S rRNA 序列分析

通過PCR細菌通用引物擴增（引物序列為5＇- GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇，5＇-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3＇），96 ℃ 預變性 3 min；94 ℃變性 1 min，58 ℃ 退火 1 min，72 ℃ 延伸 2 min，30 個循環(huán)；最后 72 ℃ 延伸 10 min。

PCR產物送蘇州金唯智生物科技有限公司進行16S rRNA序列測定，與NCBI基因庫BLAST比對，根據同源率確定ETEC血清型。

1.2.5 ETEC大腸桿菌的毒素基因測定

將PCR鑒定結果為大腸桿菌的菌株，按照參考文獻[8]合成4對特異性引物，PCR鑒定產腸毒素大腸桿菌，引物設計見表1。

表1 大腸桿菌腸毒素引物設計

設計20 μL PCR 體系為：Mix 預混液 5 μL，ddH2O 13 μL，上游引物 0.5 μL，下游引物 0.5 μL，菌液1 μL；PCR 反應條件為：94 ℃預變性 4 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30 次；72 ℃延伸10 min。以1.2%瓊脂糖核酸凝膠電泳分析PCR 產物。

1.2.6 ETEC 藥敏試驗

將分離出的 ETEC 菌株均勻涂布于瓊脂平板表面，將藥敏紙片分別貼于培養(yǎng)基表面。37 ℃ 培養(yǎng) 24 h后觀察結果。20 種藥物判斷標準參考美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）藥敏紙片擴散法[9]。根據有無抑菌圈及其直徑大小來判斷該菌對各種藥物的敏感程度，記錄結果。

2 試驗結果

2.1 細菌的分離培養(yǎng)

取直腸拭子樣本分別在 MH 瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅-美藍瓊脂培養(yǎng)基和血液瓊脂培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，37 ℃ 培養(yǎng) 18～24 h。在 MH 肉湯固體培養(yǎng)基上呈圓形、表面隆起平滑、邊緣整齊、黏稠、大小不同的小菌落，顏色呈半透明灰白色。在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上呈現(xiàn)表面隆起平滑、邊緣整齊、黏稠、大小不同的粉紅色菌落。在血液瓊脂培養(yǎng)基上呈現(xiàn)表面隆起、光滑、邊緣整齊、黏稠的灰白色群落，未見明顯的溶血性菌落。在伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基上呈表面隆起、光滑、邊緣整齊、黏稠的半透明菌落，泛紫黑色或綠色金屬光澤，如圖1所示。

圖1 細菌鑒別培養(yǎng)結果

注：A 為 MH 瓊脂培養(yǎng)基；B 為麥康凱瓊脂培養(yǎng)基；C 為血瓊脂培養(yǎng)基；D 為伊紅-美藍瓊脂培養(yǎng)基

2.2 革蘭染色結果

從培養(yǎng)基上挑取單個菌落進行革蘭染色鏡檢，為革蘭陰性菌，兩端鈍圓，且單個存在，桿狀，大小不一的短桿菌，如圖2所示。

圖2 細菌革蘭染色鏡檢結果

2.3 生化試驗結果

從固體培養(yǎng)基挑取單菌落進行純培養(yǎng)后進行生化試驗，進一步鑒定細菌生化反應，其中 6 個樣品檢測結果如表2所示。

表2 生化鑒定結果

生化試驗結果表明，MR 試驗陽性，VP 試驗陰性，枸櫞酸鹽試驗陰性，氨基酸對照試驗有的呈現(xiàn)陽性，均發(fā)酵木糖和山梨醇，有的則不能利用棉子糖和側金盞花醇。生化試驗結果均符合大腸桿菌生化特性。

2.4 16S rRNA 測序結果

將分離出的細菌通過細菌通用引物擴增出大約 1 500 bp 基因片段，將 PCR 檢測和血清凝集結果為陽性的菌株進行序列測定（圖3）。

圖3 大腸桿菌16S rRNA電泳結果

將測序結果與GeneBank 基因序列BLAST分析，結果顯示其中3株大腸桿菌序列與O6∶H16（CP024275），O25∶H16（FJ949577），T1（GU265555），O27∶H7、O15∶H11（CP024245）血清型的大腸桿菌同源率達99%以上。

2.5 產毒素大腸桿菌的毒素基因鑒定

被檢測菌株樣品中有3個樣品檢測出產腸毒素大腸桿菌，其中由LT1引物擴增出特異性條帶，大小約為280 bp；由ST1引物擴增出特異性條帶，大小約為183 bp；其中有一株大腸桿菌檢測ST1和LT1陽性。其中ETEC陽性率約為20%（圖4）。

圖4 電泳結果圖

注：M為DL 2000 Marker；1為產LT1菌株；2、3為產LT1、ST1菌株；4為產ST1菌株

2.6 藥敏試驗結果

由表3可以看出，本試驗分離出的 ETEC 菌株對新霉素、克林霉素、慶大霉素、青霉素、頭孢曲松、丁胺卡那、頭孢呋辛、氟苯尼考敏感；對恩諾沙星、左氧沙星低敏，部分對阿莫西林低敏；部分對林可霉素、阿莫西林和諾氟沙星、甲硝唑、桿菌肽耐藥。

表3 3株ETEC藥敏試驗結果 mm

注：抑菌圈直徑在 15 mm 以上用“S”表示，高度敏感；抑菌圈直徑在 10～15 mm 用“I”表示，中度敏感；抑菌圈直徑在10 mm以下用“L”表示，低敏；無抑菌圈用“R”表示，耐藥

3 討論

通過對豬場腹瀉拭子樣本進性細菌的分離鑒定、染色鏡檢、測序及 PCR 特異性檢測和血清型診斷，從 10 株大腸桿菌中分離得到 3 株產腸毒素大腸桿菌，腸毒素引物PCR 特異性檢測有1株為 LT1 型 ETEC；1株為 ST1 型 ETEC，其中1株同時產腸毒素LT1 和 ST1，其他7株為腸道常在大腸桿菌，產腸毒素大腸桿菌分離率約20%。藥敏試驗結果表明，可用新霉素、克林霉素、青霉素、頭孢曲松、丁胺卡那、頭孢呋辛、氟苯尼考等進行臨床治療。

本次僅分離出 LT1 型與 ST1 型產腸毒素大腸桿菌，還有很多危害較大的其他毒素型，而此次分離鑒定未分離出其他毒素型。ETEC可導致豬出現(xiàn)腹瀉、水腫等大規(guī)模傳染性疾病，對斷奶仔豬的致死率達15%，其致病性與其毒力因子密切相關，LT 與 ST 毒力因子成為判斷 ETEC 致病性的指標之一，由于大腸桿菌抗原型很多，血清凝集試驗難以準確測出。

豬腹瀉仍是危害當今養(yǎng)豬業(yè)的嚴重問題，是由多種病因引起的綜合征。自2010年起，在我國全國范圍內中、大規(guī)模的豬場、小型豬場及散養(yǎng)戶均發(fā)生不同程度的腹瀉[10]，給豬場造成了巨大的經濟損失。統(tǒng)計仔豬在規(guī)?；i場中發(fā)病率高達35%～40%，因腹瀉引起的死亡率就占到 20%[11]，其中以細菌性腹瀉最為常見，具有廣發(fā)性和傳染性。細菌性腹瀉的病原主要有大腸桿菌、沙門氏菌、魏氏梭菌等[12]。在生產實踐中，仔豬腹瀉往往是多種因素相互作用的結果，常呈多重感染和混合感染[13]。因此，加強仔豬的飼養(yǎng)管理和及時做好預防和治療仔豬腹瀉是規(guī)?；i場提高經濟效益的重要手段[14]。

ETEC是導致豬腹瀉的重要病原[15]，ETEC血清型的診斷對針對規(guī)?；i場治療豬腹瀉有重大意義。ETEC可單獨或同時合成耐熱腸毒素（ST）或不耐熱腸毒素（LT）刺激腸上皮細胞分泌出大量的電解質和水，最終導致機體腹瀉[16]。這與從天津規(guī)模化豬場得到的糞便樣本，病豬表現(xiàn)出水樣腹瀉一致。在天津養(yǎng)豬業(yè)中，腹瀉是造成損失嚴重的疾病之一，因此對細菌性腹瀉菌株的分離培養(yǎng)及鑒定有利于產腸毒素大腸桿菌的快速鑒定。由于引起豬腹瀉的大腸桿菌血清型范圍廣、血清型之間的免疫力保護性差，使產腸毒素大腸桿菌的防治有一定困難，本試驗僅從腹瀉糞便樣本中分離出1株LT1型大腸桿菌，1株ST1型大腸桿菌，1株LT1型與ST1型產腸毒素大腸桿菌，其他毒素因子未檢測到。產腸毒素大腸桿菌的臨床檢測及診斷應給予高度重視，這對于我國規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展具有重大意義。

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責任編輯：張愛婷

Isolation and identification of enterotoxigenicfrom large scale pig farms in Tianjin area

JIANG Xuan, LIU Meng-yue, FU Chao, MA Ji-fei, ZHAO Rui-liCorresponding Author, SHI Qing-qing, HU Ye, CUI Jun

（College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

with special serotype has different degrees of pathogenicity to human and animal intestines, among which enterotoxigenic（ETEC）is more serious. Rectal swabs samples of 15 diarrhoea pigs in Tianjin area were collected and inoculated with MH, MacConkey Agar and eosin-methylene blue agar for bacterial culture and Gram staining microscopy.The colonies with different shape on the medium were tested for biochemical tests, 16S rRNA sequencing and BLAST analysis. The homology rate of 10 strains of Enterobacteriaceae andwas 99.6%. The specific primers ofenterotoxin ST1, ST2, LT1 and IR1 were synthesized. PCR results showed that 3 strains ofproducing LT1 toxin, LT1 and ST1 toxin, and ST1 enterotoxin were isolated. The antimicrobial susceptibility test of isolated strains of enterotoxin LTI and ST1 showed that enterotoxigenicwas sensitive to neomycin, clindamycin, gentamicin, penicillin, ceftriaxone, amikacin, cefuroxime and florfenicol, which provided a basis for the monitoring and prevention of ETEC.

enterotoxigenic（ETEC）; diarrhea; isolation and identification; 16S rRNA

1008-5394（2018）03-0052-05

10.19640/j.cnki.jtau.2018.03.011

S852.611

A

2018-04-27

天津市高?！爸星嗄旯歉蓜?chuàng)新人才培養(yǎng)計劃”項目（無編號）；天津市“131”創(chuàng)新型人才資助項目（無編號）；天津市生豬產業(yè)技術體系創(chuàng)新團隊-豬細菌病崗位項目（ITTPRS2017004）；天津市應用基礎與前沿技術研究計劃一般項目（14JCYBJ30000）

姜軒（1995-），女，碩士在讀，研究方向：分子病原細菌學。E-mail：806440849@qq.com。

趙瑞利（1979-），女，副教授，博士，研究方向：分子病原細菌學。E-mail：zhaoruili1109@126.com。