宋淇淇，錢麗敏，蘇苗，于曉雪，秦順義，龔岳

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犬附紅細(xì)胞體PGK的原核表達(dá)、純化及其多克隆抗體的制備

宋淇淇1，錢麗敏1，蘇苗1，于曉雪1，秦順義1，龔岳2

（1. 天津農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384；2. 天津市濱海新區(qū)塘沽動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，天津 300354）

為了原核表達(dá)、純化犬附紅細(xì)胞體磷酸甘油酸激酶（PGK），并制備多克隆抗體，本試驗(yàn)從NCBI中已公布的犬附紅細(xì)胞體（）全基因組序列中，調(diào)取其磷酸甘油酸激酶（PGK）的基因序列，并選用原核生物偏愛的密碼子優(yōu)化基因序列，化學(xué)合成全新的基因序列，插入質(zhì)粒pET32a（＋）中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a（＋）-pgk，轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，利用Western-blot方法檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳離子親和層析純化后免疫昆明小鼠，獲得鼠抗犬附紅細(xì)胞體PGK多克隆抗體，并利用間接ELISA法檢測(cè)血清抗體效價(jià)。結(jié)果表明：成功構(gòu)建了pET32a（＋）-pgk原核表達(dá)載體，并在BL21中得以誘導(dǎo)表達(dá)，重組蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為60 ku，在包涵體和上清中均有表達(dá)，經(jīng)鎳離子親和層析獲得了純度較高的目的蛋白，利用純化后的蛋白所制備的鼠抗血清效價(jià)可達(dá)1∶51 200。

犬附紅細(xì)胞體；磷酸甘油酸激酶；原核表達(dá)；純化；多克隆抗體

附紅細(xì)胞體病是由附紅細(xì)胞體寄生于人或動(dòng)物紅細(xì)胞表面、血漿、骨髓等處而引起的一種人畜共患病，臨床上以發(fā)熱、貧血、黃疸為主要特征。1928年，Schilling和Dinger等首次報(bào)道了嚙齒類動(dòng)物紅細(xì)胞中的附紅細(xì)胞體。隨后，綿羊、牛、豬紅細(xì)胞上的附紅細(xì)胞體相繼被發(fā)現(xiàn)。1986年，人類附紅細(xì)胞體病正式由Puntaric等報(bào)道[1]。犬附紅細(xì)胞體（） 最早由Kiluth于1928年在德國(guó)發(fā)現(xiàn)，而在我國(guó)，全炳昭于1990年首次報(bào)道了犬附紅細(xì)胞體病，次年華修國(guó)等在上海發(fā)現(xiàn)了此病[2-4]。隨著人民生活水平的提高，寵物業(yè)飛速發(fā)展，犬附紅細(xì)胞體病的分布日益廣泛，引起了人們的廣泛關(guān)注。

犬附紅細(xì)胞體的全基因組信息于2011年被公布并注釋，經(jīng)分析，此類病原體內(nèi)缺乏丙酮酸脫氫酶復(fù)合體，其利用糖酵解途徑進(jìn)行主要的能量代謝[5-6]。磷酸甘油酸激酶 （phosphoglyceric kinase，PGK）是生物體糖酵解過程中的關(guān)鍵酶類，它催化1，3-二磷酸甘油酸（1，3-diphosphogly cerate）轉(zhuǎn)變成3-磷酸甘油酸（3-phosphoglycerate 3-PG），在這過程中消耗一分子的ADP，產(chǎn)生一分子的ATP。經(jīng)報(bào)道，糖酵解途徑是錐蟲在血流期唯一的能量來源，而錐蟲的PGK是一個(gè)重要的潛在藥物設(shè)計(jì)靶標(biāo)[7]。而在華支睪吸蟲中，PGK則證實(shí)主要分布在表皮和肌肉組織[8]。日本血吸蟲的PGK重組蛋白經(jīng)證實(shí)可在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)部分免疫性保護(hù)作用，且此蛋白大量存在于血吸蟲的體被表膜中[9]。盡管PGK在以上所述的多種寄生蟲中均有報(bào)道，但在附紅細(xì)胞體中的研究卻為空白。

本研究根據(jù)NCBI上已公布的犬附紅細(xì)胞體PGK蛋白基因序列，化學(xué)合成并且連接表達(dá)載體后進(jìn)行原核表達(dá)，純化表達(dá)的重組蛋白并且制備多克隆抗體血清，為研究PGK在犬附紅細(xì)胞體中的作用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株及主要試劑

質(zhì)粒pET-32a（＋） 購(gòu)自Novagen生物工程公司；Trans5αChemically Competent Cell、BL21 （DE3） Chemically Competent Cell購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

限制性內(nèi)切酶、T4連接酶購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司（Takara）；DNA Marker、鎳親和層析介質(zhì)（ProteinPure Ni-NTA Resin）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自Thermo公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天生物科技研究所。HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG購(gòu)自索萊寶有限公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購(gòu)自Sigma公司。

1.2 基因序列的化學(xué)合成及重組表達(dá)載體的構(gòu)建

從NCBI中已公布的犬嗜血性支原體（）全基因組序列中，調(diào)取其PGK的基因序列，其基因全長(zhǎng)為1 227 bp。考慮到支原體密碼子的特殊性（UGA在支原體中編碼色氨酸，而在大腸桿菌中則為終止密碼子），需將基因序列中所有UGA密碼子處突變?yōu)閁GG。因此本試驗(yàn)采用化學(xué)合成的方法合成新的基因序列，并選用原核生物偏愛的密碼子優(yōu)化基因序列，以使其能順利的在原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)。

合成的基因5＇端加HⅠ酶切位點(diǎn)，3＇端加Ⅲ酶切位點(diǎn)。對(duì)載體pET-32a（＋）進(jìn)行HⅠ和Ⅲ雙酶切，與目的基因連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個(gè)菌落后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，獲取陽性重組質(zhì)粒（pET-32a-pgk）。

1.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將構(gòu)建好的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-pgk轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落，接種于3 mL含氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床中180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜；將過夜培養(yǎng)的菌液按1∶100比例轉(zhuǎn)接入5 mL新鮮的氨芐抗性液體培養(yǎng)基中。于37 ℃搖床中180 r/min振蕩培養(yǎng)2.5～3.0 h，直至600值達(dá)到0.7左右；將培養(yǎng)后的菌液加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度為1 mmol/L；37 ℃搖床中180 r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3～4 h；將振蕩培養(yǎng)完成之后的菌液分別取1 mL轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中，8 000 r/min離心2 min收集菌體；將每管菌體沉淀用ddH2O或PBS重懸后加入上樣緩沖液后充分渦旋，于沸水中煮10 min，之后立即轉(zhuǎn)入冰上靜置5 min。處理之后的蛋白樣品可以直接用于SDS-PAGE電泳檢測(cè)或者置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 重組蛋白表達(dá)形式的確定

將按1.3所述方法誘導(dǎo)表達(dá)的菌液取1.5 mL于8 000 r/min離心2 min收集菌體，用ddH2O或PBS反復(fù)洗滌菌體2～3次；將菌體溶液置于冰水混合物上用超聲破碎儀進(jìn)行破碎，15 s/次，間隔30 s，每管破碎8～10次，直至液體澄清具有透光性；將已破碎好的樣品于4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min。分別取上清溶液及沉淀加入適量上樣緩沖液后充分渦旋混勻。將所有樣品在沸水中煮10 min，之后立即轉(zhuǎn)入冰上靜置5 min。處理之后的樣品經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)觀察結(jié)果。

1.5 重組蛋白的純化

參照北京全式金公司鎳親和層析介質(zhì)（ProteinPure Ni-NTA Resin）蛋白純化說明書進(jìn)行蛋白純化，具體方法如下：將1 L誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌培養(yǎng)物于4 ℃條件下8 000 r/min離心10 min，棄去上清。將沉淀用1/10體積的平衡緩沖液（20 mmol/L磷酸鈉，調(diào)節(jié)pH至7.0）重懸后，用壓力破碎儀破碎至液體澄清；于4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min。若目的蛋白存在于上清中，則上清可直接用于上柱；若目的蛋白存在于包涵體中，則此步棄去上清，將沉淀用一定量的包涵體平衡緩沖液室溫作用2 h，或4 ℃作用過夜，直至沉淀溶解；用5～10倍柱體積平衡緩沖液平衡層析柱；將處理后的上清成分或者包涵體溶解液經(jīng)微濾后上柱；用5～10倍柱體積平衡緩沖液洗滌層析柱；用不同濃度咪唑溶液洗脫目的蛋白，按咪唑濃度由低到高進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)濃度的洗脫體積為1～2倍柱體積，收集洗脫液；將鎳柱純化過程中各步驟所得到的溶液各取40 μL，用上樣緩沖液進(jìn)行處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢驗(yàn)蛋白純化效果；根據(jù)跑膠結(jié)果將有單一目的蛋白帶的洗脫液集中倒于處理過的透析袋中，在4 ℃條件下于PBS中透析后濃縮，測(cè)定蛋白濃度后分裝于小管置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 重組蛋白的Western-blot檢測(cè)

重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印到NC膜上，轉(zhuǎn)印后的膜置于封閉液中封閉1 h；一抗為鼠抗His單克隆抗體（按1∶100稀釋），于37 ℃反應(yīng)1 h；用PBST洗膜三次；二抗為山羊抗小鼠IgG抗體（按1∶1 000稀釋），于37 ℃反應(yīng)1 h；用PBST洗膜3次；最后用DAB顯色液進(jìn)行顯色，同時(shí)設(shè)誘導(dǎo)前的蛋白作為對(duì)照。

1.7 多克隆抗體的制備

首免采用抗原與弗氏完全佐劑乳化后免疫小鼠，免疫劑量為50 μg/只，首免后21 d用抗原與弗氏不完全佐劑乳化后進(jìn)行二免，免疫劑量減半，之后加強(qiáng)免疫每次免疫間隔為10 d，三免后七天尾部少量采血測(cè)抗體效價(jià)。免疫程序結(jié)束后，采用眼眶采血法最大限度的收集小鼠血清。

1.8 多克隆抗體效價(jià)的鑒定

用包被液將蛋白抗原稀釋至5 ng/μL，以100 μL/孔包被酶標(biāo)板，4℃過夜；取出ELISA板，甩干，加入PBST洗滌液180 μL，靜置3 min，甩干，如此洗滌3次；以150 μL/孔加入封閉液（3% BSA），37 ℃溫育45 min，甩干后拍干；以100 μL/孔加入倍比稀釋的多抗血清，稀釋度為1∶100至1∶51 200，同時(shí)設(shè)立陰性（免疫前小鼠血清）及空白對(duì)照，37 ℃溫育1 h，PBST洗滌3次；以100 μL/孔加入適當(dāng)稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，37℃溫育1 h，PBST洗滌4次；以100 μL/孔加入TMB底物顯色液，室溫避光靜置10 min；以50 μL/孔加入0.25%HF終止液結(jié)束反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定630nm值，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)載體的鑒定

將基因與pET-32a（＋）載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個(gè)菌落后提取質(zhì)粒用HⅠ和Ⅲ進(jìn)行雙酶切鑒定，得到大小約為5 900 bp和1 200 bp兩條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。酶切結(jié)果見圖1。

圖1 重組表達(dá)載體的酶切鑒定

注：M為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2、3為pET-32a-pgk經(jīng)HⅠ和Ⅲ雙酶切的結(jié)果

2.2 重組蛋白的表達(dá)及可溶性分析

取l mL誘導(dǎo)后的菌液經(jīng)離心收集菌體，用ddH2O或PBS洗滌后加入上樣緩沖液，煮沸后經(jīng)SDS-PAGE分析。SDS-PAGE結(jié)果見圖2，與未誘導(dǎo)組相比，誘導(dǎo)組在60 ku左右可見清晰的目的條帶，其大小與理論值相符。

圖2 重組蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果

注：M為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1為未誘導(dǎo)的重組菌；2為誘導(dǎo)后的重組菌；3為超聲裂解后的上清液；4為超聲裂解后的沉淀

將誘導(dǎo)后的菌液經(jīng)超聲破碎處理后，分別取上清溶液及沉淀加入適量上樣緩沖液，煮沸經(jīng)SDS-PAGE分析（見圖2）。可見目的蛋白條帶在上清液和沉淀中均有表達(dá)，表明部分目的蛋白是以可溶性形式進(jìn)行表達(dá)。

2.3 重組蛋白的純化結(jié)果

取目的蛋白的可溶性表達(dá)成分進(jìn)行純化，純化結(jié)果見圖3，純化后的重組蛋白可見分子質(zhì)量為60 ku的目的條帶，未見其他明顯條帶，表明獲得了濃度和純度都較高的目的蛋白。

圖3 重組蛋白的純化結(jié)果

注：M為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1為誘導(dǎo)后超聲裂解的上清液；2為純化后的表達(dá)產(chǎn)物

2.4 重組蛋白的Western-blot檢測(cè)結(jié)果

重組蛋白的Western-blot結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后的重組菌在60 ku處可見陽性條帶，而誘導(dǎo)前的樣品則無條帶（圖4）。說明表達(dá)的重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

圖4 重組蛋白的Western-blot分析結(jié)果

注：M為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1為誘導(dǎo)前pET-32a- pgk重組菌；2為誘導(dǎo)后pET-32a-pgk重組菌

2.5 多克隆抗體的鑒定結(jié)果

以純化的PGK蛋白包被ELISA板，采用間接ELISA方法檢測(cè)制備的免疫血清效價(jià)，結(jié)果顯示，免疫后的多克隆抗體血清的效價(jià)可達(dá)1∶51 200。

3 討論

犬附紅細(xì)胞體病近年在許多國(guó)家發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，其中包括美國(guó)、坦桑尼亞、瑞士、希臘以及意大利、西班牙、葡萄牙等地中海國(guó)家，其陽性率為0.6%～40.0%[10-14]。而在我國(guó)，關(guān)于犬附紅細(xì)胞體病的報(bào)道主要集中在診斷方法的建立[15-17]及形態(tài)學(xué)研究[18-19]。隨著犬附紅細(xì)胞體全基因組測(cè)序的完成，此病原的許多功能性蛋白基因序列得以公布，使得對(duì)此病原的進(jìn)一步深入研究成為可能。

由于犬附紅細(xì)胞體在分類上屬于支原體，其密碼子的使用與大腸桿菌不完全相同[20]。具體來說，UGA在支原體中編碼色氨酸，而在大腸桿菌中則為終止密碼子，因此直接從陽性樣品中擴(kuò)增出的犬附紅細(xì)胞體基因序列并不適用于構(gòu)建原核表達(dá)載體，若要順利進(jìn)行原核表達(dá)，則需要將基因序列中所有三聯(lián)密碼子為TGA處突變?yōu)門GG。因此本試驗(yàn)直接采用化學(xué)合成的方法合成新的基因序列，并選用原核生物偏愛的密碼子優(yōu)化基因序列，以使其順利地在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。

糖酵解途徑中的PGK在多種寄生蟲中不僅參與能量的產(chǎn)生，還定位于蟲體表膜，具有一定的免疫學(xué)保護(hù)作用，可能是潛在的藥物靶標(biāo)。本研究選擇犬附紅細(xì)胞體PGK作為研究對(duì)象，利用化學(xué)合成的基因序列成功構(gòu)建原核表達(dá)載體，并順利表達(dá)出重組蛋白，利用純化后的重組蛋白制備出了效價(jià)達(dá)1∶51 200的多克隆抗體血清，為研究PGK在犬附紅細(xì)胞體中的作用打下基礎(chǔ)。

[1] Puntaric V，Borcic D，Vukelic D，et al.in man[J]. Lancet，1986，11：868-869.

[2] Sykes J E，Ball L M，Bailiff N L，et al.‘Mycoplasma haematoparvum’，a novel small haemotropic mycoplasma from a dog[J]. Int J Syst Evol Microbiol，2005，55（1）：27-30.

[3] 全炳昭，謝才豐. 犬的附紅細(xì)胞體病及其診療報(bào)告[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)雜志，1991，1（2）：119-120.

[4] 華修國(guó)，張秀根，李中夏. 犬附紅細(xì)胞體病[J]. 中國(guó)動(dòng)物檢疫，1992，9（3）：30-31.

[5] do Nascimento N C，Guimaraes A M S，Santos A P，et al. Complete genome sequence ofstrain Illinois[J]. Journal of Bacteriology，2012，194（6）：1605-1606.

[6] Santos A P，Guimaraes A M S，do Nascimento N C，et al. Genome of，unraveling its strategies for survival and persistence[J]. Veterinary Research，2011，42：102-117.

[7] Opperdoes F R. Compartmentation of carbohydrate metabolism in trypanosomes[J]. Annu Rev Microbiol，1987，41：127 -151.

[8] Hong S J，Seong K Y. Molecular cloning and immunological characterization of phosphoglycerate kinase from[J]. Mol Biochem Parasitol，2000，108：207-216.

[9] 黃莉妮. 日本血吸蟲磷酸甘油酸激酶SjPGK基因的克隆表達(dá)及生物學(xué)特性的初步探索[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[10] Barker E N，Tasker S，Day M J，et al. Development and use of real-time PCR to detect and quantifyand“Mycoplasma haematoparvum”in dogs[J]. Veterinary Microbiology，2010，140（1）：167-170.

[11] Compton S M，Maggi R G，Breitschwerdt E B.Mycoplasma haematoparvum andinfections in dogs from the United States[J]. Comparative Immunology，Microbiology and Infectious diseases，2012，35（6）：557-562.

[12] Novacco M，Meli M L，Gentilini F，et al. Prevalence and geographical distribution of canine hemotropic mycoplasma infections in Mediterranean countries and analysis of risk factors for infection[J]. Veterinary Microbiology，2010，142（3）：276-284.

[13] Tennant K V，Barker E N，Polizopoulou Z，et al. Real-time quantitative polymerase chain reaction detection of haemoplasmas in healthy and unhealthy dogs from Central Macedonia，Greece[J]. Journal of Small Animal Practice，2011， 52（12）：645-649.

[14] Wengi N，Willi B，Boretti F S，et al. Real-time PCR- based prevalence study，infection follow-up and molecular characterization of canine hemotropic mycoplasmas[J]. Veterinary Microbiology，2008，126（1）：132-141.

[15] 夏曉輝，丁曉雙，張曉軒，等. 犬附紅細(xì)胞體PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J]. 畜牧與獸醫(yī)，2013，45（3）：81-84.

[16] 張偉，刁有祥，臧大鵬，等. 犬附紅細(xì)胞體病PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J]. 西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009，34（1）：67-71.

[17] 周勇志，李莊，石磊，等. 犬附紅細(xì)胞體PCR檢測(cè)方法的建立[J]. 中國(guó)獸醫(yī)寄生蟲病，2008，16（4）：1-4.

[18] 車京波. 犬附紅細(xì)胞體病形態(tài)學(xué)研究及PCR快速診斷方法的建立與應(yīng)用[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[19] 薛慧亮. 犬附紅細(xì)胞體形態(tài)學(xué)觀察及PCR診斷方法的建立[D]. 長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2014.

[20] Neimark H，Johansson K E，Rikihisa Y，et al. Proposal to transfer some members of the generaandto the genuswith description of‘Mycoplasma haemofelis’，‘Mycoplasma heamomuris’，‘Mycoplasma haemosuis’and‘Mycoplasma wenyonii’[J]. Int J Syst Evol Microbiol，2001，51：891-899.

責(zé)任編輯：張愛婷

Prokaryotic expression and purification ofphosphoglyceric kinase and the preparation of its polyclonal antibodies

SONG Qi-qi1, QIAN Li-min1, SU Miao1, YU Xiao-xue1, QIN Shun-yi1, GONG Yue2

（1. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Tanggu Animal Health Supervision Institute, Binhai New District, Tianjin 300354, China）

In order to express and purify phosphoglyceric kinase （PGK） of, and prepare its polyclonal antibodies, the information of PGK gene sequence was obtained from the publishedgenome on NCBI. The modified PGK gene sequence was synthesized chemically according to the prokaryotic cells-preferred codon, and inserted into pET32a（+）. The constructed recombinant plasmid pET32a（+）-pgk was transformed toBL21（DE3）competent cells, and induced with IPTG. The expression product was detected by Western-blot, and then purified by Ni-affinity purification column. The purified recombinant protein was used to immune Kunming mice and to produce the polyclonal antibodies. The serum antibody titer was determined by indirect ELISA. The results showed that recombinant plasmid pET32a（+）-pgk was constructed correctly, and successfully expressed in BL21. The relative molecular mass of recombinant protein was about 60 ku. And the protein was existed in both inclusion bodies and supernatant. The high-purified recombinant protein was obtained by Ni-affinity purification column, and the prepared mice antiserum reached a titer of 1∶51 200.

; phosphoglyceric kinase; prokaryotic expression; purification; polyclonal antibodies

1008-5394（2018）03-0042-05

10.19640/j.cnki.jtau.2018.03.009

S852.62

A

2018-04-28

天津農(nóng)學(xué)院科學(xué)研究發(fā)展基金項(xiàng)目（2014N10）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31702223）；天津農(nóng)學(xué)院附屬動(dòng)物醫(yī)院委托項(xiàng)目（科經(jīng)第2018.96號(hào)）

宋淇淇（1986-），女，講師，博士，主要從事獸醫(yī)寄生蟲學(xué)教學(xué)及研究工作。E-mail：qqs0606@163.com。