肖音　肖斌　趙娜　張娜　武心亮　蘇伊新

中圖分類號 R285 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）01-0058-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.01.15

摘 要 目的：從黑沙蒿所含黃酮類化合物中篩選過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR-γ）的激動活性成分，為發(fā)現黑沙蒿中抗糖尿病藥效物質提供參考。方法：以已知PPAR-γ激動藥羅格列酮為陽性對照，采用分子對接技術對黑沙蒿中已分離得到的18個黃酮類化合物與PPAR-γ靶點進行一一分子對接，并對化合物與PPAR-γ靶點的對接親和力、對接構象等進行分析比較，篩選黑沙蒿中可能的PPAR-γ激動活性成分。結果：有5個黃酮類化合物呈現了較好的對接親和力，其中以化合物3（5，3′ ，4′ -三羥基-7-甲氧基黃酮）親和力最高（-8.3 kcal/mol）；對接構象分析發(fā)現，黃酮類化合物A環(huán)與B環(huán)上的氧原子易與PPAR-γ配體結合域活性位點形成1個（Tyr327）或2個（Tyr327、Arg288）氫鍵結合，這對于黃酮類化合物與PPAR-γ的結合以及PPAR-γ構象的穩(wěn)定起著重要作用。結論：采用分子對接技術進行的虛擬篩選結果表明，黑沙蒿中的黃酮類化合物（大多含有多個自由酚羥基）易與PPAR-γ形成較好的對接模式與較高親和力，具有潛在抗糖尿病活性；本研究可為黑沙蒿治療2型糖尿病的化學成分研究提供參考。

關鍵詞 黑沙蒿；分子對接技術；黃酮類化合物；過氧化物酶體增殖物激活受體-γ；親和力；抗糖尿病

ABSTRACT OBJECTIVE： To screen the agonist active ingredients of peroxisome proliferator-activated receptor-γ （PPAR-γ） in flavonoids from Artemisia ordosica， and provide reference for finding antidiabetic agents in A. ordosica. METHODS： Using known PPAR-γ agonist rosiglitazone as positive control， molecular docking technology was conducted for docking one by one for 18 flavonoids and PPAR-γ targets obtained from A. ordosica. It was compared with binding affinities and binding modes of compounds and PPAR-γ targets， and the possible PPAR-γ agonist ingredients in A. ordosica were screened. RESULTS： 5 flavonoids showed good docking affinities， in which， compound 3 （5，3′ ，4′ -trihydroxy-7-methoxyflavone） showed the highest （-8.3 kcal/mol）. Docking mode analysis showed that the phenol oxygen on ring A and ring B of the flavonoids with LBD active site of PPAR-γ formed one （Tyr327） or two hydrogen bonding （Tyr327， Arg288）， which played an important role in the binding of flavonoids and PPAR-γ and the stability of PPAR-γ conformation. CONCLUSIONS： Results of virtual screening in molecular docking technology indicate that flavonoids （mostly containing multiple free phenolic hydroxyl groups） in can easily form good docking mode and high affinity with PPAR-γ， showing potential antidiabetic activity. The study can provide reference for further research of chemical ingredients for the treatment of type 2 diabetes.

KEYWORDS Artemisia ordosica； Molecular docking technology； Flavonoids； Peroxisome proliferator-activated receptor-γ； Af- finity； Antidiabetic

過氧化物酶體增殖物激活受體（Peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR）是配體激活轉錄因子核受體家族成員[1-2]，PPAR包括3種亞型：α、β/δ和γ。PPAR-γ系在脂肪組織、巨噬細胞、單核細胞、腸細胞、骨骼肌和內皮細胞中表達最豐富的亞型，在調節(jié)胰島素敏感性、脂質代謝、脂肪生成和葡萄糖的體內平衡中具有重要作用，成為近十幾年來研究熱點[3]。

已知的PPAR-γ配體類型主要包括2種：生理性配體和藥理性配體。生理性配體包括內源性的15-脫氧前列腺素J2及其代謝產物和飲食來源的不飽和脂肪酸等；藥理性配體有合成藥物噻唑烷二酮類（Thiazolidinedione，TZDs，PPAR-γ的高效配體）、L-酪氨酸衍生物（PPAR-α/γ雙重激動藥）以及不斷發(fā)現的具有PPAR-γ激動活性的天然產物和合成產物，其中以曾廣泛應用于臨床的胰島素增敏劑TZDs最有名。分子對接是一種計算程序，可根據配體與受體作用的“鎖鑰原理”用于預測大分子的非共價結合情況。該技術的應用使基于人體靶點的中藥天然產物活性成分的高效、快速篩選成為可能[4-5]。

黑沙蒿（Artemisia ordosica Krasch.）為菊科蒿屬植物，在前期研究中，筆者對黑沙蒿的資源分布、化學成分及藥理活性研究進展進行了綜述，結果發(fā)現黑沙蒿含有18種黃酮類化學成分[6]。本研究嘗試利用分子對接技術從黑沙蒿所含黃酮類化合物中篩選PPAR-γ激動活性成分，并預測其與PPAR-γ的結合模式，旨在從分子水平探究黑沙蒿黃酮類化學成分通過PPAR-γ產生生理作用的潛在藥效物質基礎，并進一步為中藥化學成分的虛擬篩選提供參考和借鑒。

1 材料

PPAR-γ蛋白與羅格列酮的X-射線共結晶結構文件來源于RCSB PDB Bank（Research Collaboratory for Structural Bioinformatics：Protein Data Bank）數據庫（http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do，PDB code：2PRG）；晶體結構預處理采用分子建模軟件包Chimera 1.5.3（National Institutes of Health，USA）；受體加氫以及grid box（箱格）設置采用分子建模軟件包MGL Tools 1.5.4（The Scripps Research Institute，USA）處理；Chem3D Ultra 8.0軟件（Cambridge Soft Corporation，USA）；分子對接模擬應用對接軟件AutoDock Vina 1.1.2（The Scripps Research Institute，USA）；軟件PyMOL v1.5（Schrodinger LLC，USA；用于分析和觀察配體-蛋白質的對接構象）。

2 方法

2.1 羅格列酮的藥效團研究

從RCSB PDB Bank數據庫中下載PPAR-γ與其配體小分子藥物羅格列酮的共結晶結構（PDB code：2PRG）作為分子對接的受體模型。羅格列酮在本研究中作為陽性對照，因此基于共結晶結構2PRG進行了羅格列酮的藥效團研究，重點對羅格列酮的拓撲結構、PPAR-γ的關鍵螺旋、折疊、氨基酸殘基、重要水分子等進行了總結。

2.2 基于PPAR-γ的分子對接研究

2.2.1 PPAR-γ的晶體結構及預處理 X-射線衍射得到的靶點的晶體結構與生物體中實際情況往往略有差異，故需進行預處理以接近其生理狀態(tài)。從2PRG 中分離出A鏈或B鏈，去除C鏈以及所有配體和水分子（關鍵水分子除外），并計算蛋白質的質子化態(tài)，備用。

2.2.2 配體構建及預處理 黑沙蒿中已知的18種黃酮類化合物的平面結構采用ChemDraw 軟件繪制，通過Chem3D Ultra 8.0軟件將二維結構轉換成三維結構數據并使其能量最小化。對配體進行預處理以使配體分子接近天然構象，加載電荷，備用。

2.2.3 對接流程 綜合“2.2.1”和“2.2.2”項，對接流程如下：（1）從RCSB PDB Bank數據庫中下載PPAR-γ與配體羅格列酮的共結晶晶體結構（2PRG.pdb），去除C鏈，分離A鏈或B鏈，制備PPAR-γ monomer（.pdb格式文件）；去除所有配體和水分子（關鍵水分子除外），根據軟件默認方法計算蛋白質質子化態(tài)，受體加氫，設置grid box參數，使其覆蓋整個PPAR-γ monomer蛋白晶體以探尋所有可能的結合模式。（2）制備待對接配體，將二維結構轉換成三維結構數據并使其能量最小化，加載電荷（.pdbqt格式文件）。（3）創(chuàng)建config.txt文件，將對接參數（grid box坐標、exhaustiveness數值）輸入其中。（4）將PPAR-γ與黑沙蒿中所有已知黃酮類化合物進行逐一對接（之前4步為預處理）。（5）根據配體的構象、位置及對接親和力（軟件自動給出）等對各種結合模式進行綜合對比。

3 結果

3.1 已知PPAR-γ與配體羅格列酮的藥效團研究

Nolte RT等于1998年報道了由人源PPAR-γ配體結合域（Ligand binding domain，LBD）、羅格列酮和類固醇受體共激活因子1（Human steroid receptor co-activating factor-1，SRC-1）組成的三元絡合物2PRG[7]。筆者對PPAR-γ的藥效團進行了總結，如圖1所示。

PPAR-γ LBD包含一個大的結合口袋，可容納不同配體進入并形成適當構象從而組成配體-受體復合物。羅格列酮骨架被分為頭部（Head）、連接基（Linker）和尾部（Tail）。PPAR-γ激動藥包含有一個親水性頭部Head，通過一個芳香連接基與疏水性尾部相連接。親水性頭部基團通常含有羥基、羰基或羧基氧原子（例如，羧酸和2，4-噻唑烷二酮），可與PPAR-γ LBD的關鍵氨基酸殘基（Tyr473、His449、His323和Ser289）形成氫鍵（圖1中虛線）網絡。這些氫鍵有助于穩(wěn)定PPAR-γ于適當的構象，對共激活因子的成功攝取至關重要[8-9]。芳香中心與關鍵螺旋Helix 3的多個疏水性氨基酸殘基形成范德華力，而疏水性尾部則可允許多種取代基與PPAR-γ大的疏水性口袋以及自由水分子相互作用[10]。

3.2 基于PPAR-γ的分子對接研究

3.2.1 2PRG晶體結構A鏈和B鏈的對比、選擇 2PRG晶體結構包含了3個不對稱分子單元A、B和C（見圖2）。本研究去除了C鏈，對A鏈和B鏈進行了分離及與羅格列酮的再對接試驗。

A鏈和B鏈與配體羅格列酮的結合具有明顯的不同，A鏈缺失了與關鍵氨基酸殘基His449間的氫鍵結合（見圖3a）；B鏈缺失了與Glu286間的氫鍵結合（見圖3b）。此外，同一軟件（Chimera1.5.3）得到的位于PPAR- γ LBD尾部結合口袋的關鍵水分子（紅色球體）也不同。

分別以A鏈和B鏈為靶蛋白受體與羅格列酮進行分子再對接試驗后，發(fā)現A鏈再對接結果呈現了所有關鍵的配體-受體氫鍵組合。對于B鏈，大部分的再對接構象缺乏與氨基酸殘基His449和Glu286之間的氫鍵結合。同時，A鏈被認為與激活態(tài)的PPAR-γ蛋白結構相近[11]。因此，A鏈被選定用于PPAR-γ激動活性成分的分子對接試驗。

3.2.2 PPAR-γ LBD中水分子的選擇保留 PPAR-γ LBD尾部結合口袋未與羅格列酮形成氫鍵結合，且大的結合口袋允許諸多自由水分子的存在，并與羅格列酮存在范德華力等相互作用，尤其H2O604（注：604以及后文的308是水分子的標號，此標號為2PRG中固有標號）（見圖 1中標出的水分子）與羅格列酮分子吡啶環(huán)上的N原子形成了氫鍵結合，這對于羅格列酮在PPAR-γ LBD內構象的穩(wěn)定起著重要作用。鑒于此，本研究選擇了A鏈PPAR-γ LBD尾部結合口袋內的若干重要水分子進行考察，保留不同的水分子組合進行再對接試驗，最終選定H2O308、H2O339、H2O444和H2O467（A鏈水分子的標識號在.mol2 格式的文件中的編號有所變化，與2PRG中編號有差異，但本研究中選擇的相應水分子，隨后用PyMOL打開后發(fā)現其顯示了正常的編號）。此條件生成了與2PRG晶體接近、重現性高并排名第一的結合模式。

3.2.3 對接結果 將黑沙蒿藥材中已知的黃酮類化學成分與PPAR-γ 進行分子對接，根據AutoDock Vina分子對接程序，每個化合物有9個分子對接模式，并按照所有模式的親和力進行排名。與羅格列酮比較，所有化合物與PPAR-γ分子對接的親和力均略低于羅格列酮，從中篩選得到5 個親和力較高的化合物（親和力絕對值大于8.0，羅格列酮為-8.7 kcal/mol），其中以化合物3最高（-8.3 kcal/mol）。篩選結果（由對接軟件AutoDock Vina自動給出，包括9個構象中最高親和力、親和力平均值、9個構象中位于PPAR-γ LBD內的個數、最高親和力構象與PPAR-γ形成的氫鍵結合情況）見表1。

3.2.4 PPAR-γ與配體的結合構象 以得分較高的配體結合構象用來預測PPAR-γ與激動活性成分的結合模式，羅格列酮、化合物3與PPAR-γ受體的對接構象如圖4所示。

羅格列酮與受體的氨基酸殘基Tyr473、His323、Gln286、Ser289形成4個氫鍵結合（虛線表示，見圖4a），得分最高的化合物3與受體的Tyr327、Arg288形成2個氫鍵結合（虛線表示，圖4b）。篩選出的其他化合物與化合物3相似，化合物中的A環(huán)與B環(huán)上的氧原子均易與PPAR-γ LBD活性位點形成1個（Tyr327）或2個（Tyr327、Arg288）氫鍵結合。分析可知，這些化合物均對接到PPAR-γ LBD活性位點，占據其結合腔，氫鍵結合將PPAR-γ的若干Helix固定，形成穩(wěn)定的構象，對于PPAR-γ進一步與靶基因結合以及PPAR-γ受體的激活起著重要作用[12]。所有化合物與羅格列酮的結合模式均不同（如形成氫鍵結合的氨基酸），提示對接親和力及激動活性與羅格列酮有所不同。而對PPAR-γ受體的激動活性尚需體內外活性研究進行驗證。

4 討論

（1）分子對接用于預測小分子與蛋白的結合具有特殊的意義，可以用來進行類藥分子的虛擬篩選，以獲得藥物開發(fā)的先導化合物，也可用于缺少實驗數據的已知結合體的構象的預測。迄今為止，采用分子對接技術對中藥化學成分進行活性機制研究的報道不多。筆者以黑沙蒿為研究對象，拓展了分子對接技術在中藥藥效物質基礎和中藥作用機制研究方面的應用。

（2）本文采用分子對接技術篩選黑沙蒿中PPAR-γ激動活性成分，得到5種親和力較高的黃酮類化合物1～5。這些黃酮類化合物有望作為配體與PPAR-γ受體結合并使之激活，隨后與視黃醛X受體α形成異二聚體，結合到特異性DNA序列-PPAR特異性反應元件而活化靶基因[13-15]。同時，這5種黃酮類化合物可能會成為PPAR-γ激動藥的先導化合物，值得進一步研究。

（3）配體最佳對接模式的選擇不僅需要考慮對接親和力，還應結合對接模型的構象觀察[16-18]。此外，分子對接模擬的應用局限于前期研究，對化合物的進一步活性測試依然是必要的。

（4）分子對接模擬是一種成本較低的虛擬篩選技術，對于活性結果的預測具有參考意義。分子對接過程中陽性對照化合物的選擇、目標受體蛋白共晶的選擇、受體蛋白的處理、對接流程及條件的優(yōu)化（如本文中共晶結構2PRG中A鏈、B鏈與羅格列酮的再對接、grid box參數的設置）對于預測待篩選分子的準確活性至關重要。

綜上，采用分子對接技術篩選黑沙蒿中PPAR-γ激動活性成分的方法可靠，黑沙蒿中5種黃酮類化合物與PPAR-γ的對接呈現了較高的親和力，但對接構象與已知PPAR-γ激動藥羅格列酮不同，黃酮類化合物A環(huán)與B環(huán)上的氧原子易與PPAR-γ受體的LBD活性位點形成1個（Tyr327）或2個（Tyr327、Arg288）氫鍵結合（羅格列酮與Tyr473、His343、Gln286和Ser289形成氫鍵結合），其中以化合物3（5，3′ ，4′ -三羥基-7-甲氧基黃酮）對接親和力最強。本研究為這5種黃酮類化合物與PPAR-γ靶點的結合以及用于治療2型糖尿病的化學成分研究提供了參考。

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（收稿日期：2017-04-24 修回日期：2017-06-13）

（編輯：劉 萍）