程中琴　劉小妹　施崇精　王姍姍　袁強華　宋英

中圖分類號 R917 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）01-0033-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.01.09

摘 要 目的：建立同時測定平臟調神顆粒中鹽酸小檗堿、淫羊藿苷、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芍藥苷、芒果苷、丹酚酸B和葛根素含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為IntertSustain C18，流動相為乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（pH為3，梯度洗脫），流速為 1.0 mL/min，檢測波長為250 nm（0～23 min，葛根素、芒果苷）、230 nm（>23～30 min，芍藥苷）、220 nm（>30～50 min，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷）、286 nm（>50～60 min，丹酚酸B）、265 nm（>60～75 min，鹽酸小檗堿）、220 nm（>75～90 min，淫羊藿苷），柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。結果：鹽酸小檗堿、淫羊藿苷、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芍藥苷、芒果苷、丹酚酸B和葛根素檢測質量濃度線性范圍分別為4.000～400.0、4.843～484.3、0.498～49.8、2.366～236.6、23.26～ 2 326.0、3.067～306.7、3.629～362.9、48.23～4 823.2 μg/mL（r≥0.999 4）；檢測限分別為0.02、0.02、0.02、0.02、0.01、0.02、0.01、0.01 μg/mL，定量限分別為0.07、0.05、0.06、0.05、0.03、0.07、0.02、0.03 μg/mL；精密度、穩(wěn)定性（24 h）、重復性試驗的RSD均<2.0%（n=6）；加樣回收率為 95.77%～103.50%，RSD為0.77%～2.22%（n=6）。結論：建立的方法可用于平臟調神顆粒中鹽酸小檗堿等8種成分含量的同時測定。

關鍵詞 高效液相色譜法；平臟調神顆粒；鹽酸小檗堿；淫羊藿苷；毛蕊花糖苷；毛蕊異黃酮葡萄糖苷；芍藥苷；芒果苷；丹酚酸B；葛根素；含量測定

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of berberine hydrochloride， icariin， acteoside， isoflavone glucoside， paeoniflorin， mangiferin， salvianolic acid B and puerarin in Pingzang tiaoshen granule. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on InertSustain C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.05mol/L potassium dihydrogen phosphate solution （pH to 3， gradient elution） with the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 250 nm （0-23 min， puerarin， mangiferin）， 230 nm （>23-30 min， paeoniflorin）， 220 nm （>30-50 min， isoflavone glucoside， acteoside）， 286 nm （>50-60 min， salvianolic acid B）， 265 nm （>60-75 min， berberine hydrochloride）， 220 nm （>75-90 min， icariin）. The column temperature was set at 30 ℃， and sample size was 10 μL. RESLUTS： The linear range of berberine hydrochloride， icariin， acteoside， isoflavone glucoside， paeoniflorin， mangiferin， salvianolic acid B and puerarin were 4.000-400.0， 4.843-484.3， 0.498-49.8， 2.366-236.6， 23.26-2 326.0， 3.067-306.7， 3.629-362.9 μg/mL， 48.23-4 823.2 μg/mL（r≥0.999 4）， respectively. The limits of detection were 0.02， 0.02， 0.02， 0.02， 0.01， 0.02， 0.01， 0.01 μg/mL； the limits of quantitation were 0.07， 0.05， 0.06， 0.05， 0.03， 0.07， 0.02， 0.03 μg/mL， respectively. RSDs of precision， stability （24 h） and repetition tests were all<2.0% （n=6）. The average recoveries were 95.77%-103.50% （RSD=0.77%-2.22%， n=6）. CONCLUSIONS： Established method can be used for simultaneous determination of 8 components such as berberine hydrochloride in Pingzang tiaoshen granule.

KEYWORDS HPLC； Pingzang tiaoshen granule； Berberine hydrochloride； Icariin； Acteoside； Isoflavone glucoside； Paeoni- florin； Mangiferin； Salvianolic acid B； Puerarin； Content determination

平臟調神顆粒系成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院根據(jù)臨床經驗方制成的顆粒劑，由黃連、生地黃、葛根、淫羊藿、黃芪、知母、赤芍、丹參、五味子、地骨皮、牡蠣等藥材組成，具有滋腎疏肝寧心、理氣解郁活血、生津斂汗安神、益氣清熱補虛的功效，主治自主神經功能紊亂[1-2]。該制劑有效成分以黃連為君藥，故目前只以黃連中鹽酸小檗堿的含量為質量控制標準[1-2]，但相關藥效研究表明，除黃連中的鹽酸小檗堿有降糖作用，可用于治療糖尿病的并發(fā)癥外[3]，該制劑中的其他藥物亦有治療作用。淫羊藿中的淫羊藿苷可改善心血管系統(tǒng)功能，調節(jié)心臟供血供氧平衡[4]；生地黃中的毛蕊花糖苷和黃芪中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷均具有神經系統(tǒng)保護作用[5-6]；赤芍中的芍藥苷可保護神經細胞[7]；知母中的芒果苷具有抗炎作用[8]；丹參中的丹酚酸B有抗菌作用[9]；葛根中的葛根素具有抗炎、降血糖等藥理作用[10]。鑒于此，本課題組采用高效液相色譜法（HPLC）建立了同時測定平臟調神顆粒中鹽酸小檗堿、淫羊藿苷、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芍藥苷、芒果苷、丹酚酸B和葛根素成分含量的方法，以期為完善該制劑的質量控制標準提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括四元泵、二極管陣列檢測器、在線脫氣裝置、自動進樣器、Openl AB工作站（美國Agilent公司）；BP211D型電子分析天平（瑞士 Mettler-Toledo 公司）；AS20500BD 型超聲清潔儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；CXP-500A 型高速多功能粉碎機（上海市晟喜制藥機械有限公司）；Milli-Q Advantage A10型超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

平臟調神顆粒（成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院自制，批號：20170507、20170515、20170519；規(guī)格：10 g/袋，鹽酸小檗堿含量：≥1.5%）；鹽酸小檗堿對照品（批號：110713- 201212）、淫羊藿苷對照品（批號：110737-200415）、毛蕊花糖苷對照品（批號：111530-201411）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（批號：111920-201304）、芍藥苷對照品（批號：110736-201438）、芒果苷對照品（批號：111607- 200402）、丹酚酸B對照品（批號：111562-20131）、葛根素對照品（批號：110736-201438）均購自中國食品藥品檢定研究院，純度均>86%；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：IntertSustain C18（250 mm×4.6 mm ，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（磷酸調節(jié)至pH為3，B），梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；檢測波長：250 nm（0～23 min，葛根素、芒果苷）、230 nm（>23～30 min，芍藥苷）、220 nm（>30～50 min，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷）、286 nm（>50～60 min，丹酚酸B）、265 nm（>60～75 min，鹽酸小檗堿）、220 nm（>75～90 min，淫羊藿苷）；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

梯度洗脫程序見表1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 毛蕊花糖苷對照品貯備液 精密稱取毛蕊花糖苷對照品2.5 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得毛蕊花糖苷對照品貯備液。

2.2.2 混合對照品溶液 分別精密取鹽酸小檗堿、淫羊藿苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芍藥苷、芒果苷、丹酚酸B和葛根素對照品2.00、2.42、1.18、11.63、1.53、1.18、24.11 mg，以及“2.2.1”項下毛蕊花糖苷對照品貯備液1 mL，置于同一5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液 取樣品粉末1.0 g，置于25 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲（功率：250 W，頻率：50 kHz，下同）處理50 min，冷卻至室溫，加甲醇定容，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液 按樣品的制備工藝和配方比例，分別制備缺黃連、缺淫羊藿、缺知母、缺赤芍、缺丹參、缺生地黃、缺黃芪、缺葛根的陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法制備陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

精密量取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜。結果，在該色譜條件下，各待測成分間，與各雜質峰間均能達到基線分離，分離度>1.5，其他成分對待測成分的測定無干擾，理論板數(shù)以鹽酸小檗堿峰計為5 000，詳見圖1。

2.4 線性關系考察

精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液0.5 mL，分別置于5、10、20、25、50 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，制成系列混合對照品溶液。精密量取上述系列混合對照品溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度為橫坐標（x，μg/mL）、峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸，線性關系考察結果見表2。

2.5 檢測限與定量限考察

取“2.2.2”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為3 ∶ 1時，得檢測限；當信噪比為10 ∶ 1時，得定量限。結果，鹽酸小檗堿、淫羊藿苷、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芍藥苷、芒果苷、丹酚酸B和葛根素的檢測限分別為0.02、0.02、0.02、0.02、0.01、0.02、0.01、0.01 μg/mL，定量限分別為0.07、0.05、0.06、0.05、0.03、0.07、0.02、0.03 μg/mL。

2.6 精密度試驗

取“2.2.2”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定 6次，記錄峰面積。結果，鹽酸小檗堿、淫羊藿苷、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芍藥苷、芒果苷、丹酚酸B和葛根素峰面積的RSD分別為0.92%、1.35%、1.09%、0.39%、0.47%、0.86%、0.70%、1.02%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.3”項下供試品溶液（批號：20170507）適量，分別于室溫下放置 0、3、6、12、18、24 h 時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，鹽酸小檗堿、淫羊藿苷、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芍藥苷、芒果苷、丹酚酸B和葛根素峰面積的RSD分別為 0.79%、1.60%、1.09%、1.52%、1.34%、0.79%、0.53%、1.07%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩(wěn)定性良好。

2.8 重復性試驗

精密稱取同一批（批號：20170507）樣品適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結果，鹽酸小檗堿、淫羊藿苷、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芍藥苷、芒果苷、丹酚酸B和葛根素含量的平均值分別為19.64、26.76、1.98、3.00、26.81、1.76、5.59、48.54 mg/g，RSD分別為 0.82% 、1.73% 、0.69%、0.85%、0.74%、1.09%、0.25%、0.84%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品（批號：20170507）0.3 g，共6份，分別置于100 mL量瓶中，各加入一定質量的待測成分對照品，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表3。

2.10 樣品含量測定

取3批樣品各適量，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結果見表4。

3 討論

3.1 質量控制指標的選擇

中藥治療疾病的物質基礎是化學成分，化學成分是復方發(fā)揮療效的前提。中藥療效的發(fā)揮，是多種化合物協(xié)同作用產生的結果。中藥單一成分的含量測定不能反映復方本身的質量，故建立多指標的含量測定以評價復方質量勢在必行[11-13]。

在本復方的組成中，地骨皮主要有效成分為?；撬醄14]，牡蠣的有效成分主要為碳酸鈣，均不適合采用HPLC法測定其含量[15]，故本課題在質量標準研究時，對?；撬岵捎梅止夤舛确y定其含量，牡蠣采用化學方法測定；且采用本試驗方法對五味子乙素進行含量測定時，并未檢測出該成分，故本課題將在后續(xù)研究中采用薄層色譜法對五味子乙素進行分析。鑒于此，本課題組只測定了平臟調神顆粒中黃連、生地黃、葛根、淫羊藿、黃芪、知母、赤芍、丹參的主成分的含量。

3.2 超聲時間的選擇

在制備供試品溶液時，筆者以甲醇為提取溶劑，考察了超聲時間（20、30、40、50、60、70 min）對待測成分提取效果的影響。結果表明，隨著超聲時間的延長，待測成分的含量增加，但當超聲時間超過50 min后，待測成分的含量增加較少，因此選擇50 min為本試驗提取時間。

3.3 檢測波長的選擇

在選擇檢測波長時，筆者采用二極管陣列檢測器在200～400 nm波長范圍內對供試品溶液進行全波長掃描，結果顯示葛根素和芒果苷在250 nm波長下，芍藥苷在230 nm波長下，毛蕊異黃酮葡萄糖苷和毛蕊花糖苷在220 nm波長下，丹酚酸B在286 nm波長下，鹽酸小檗堿在265 nm波長下，淫羊藿苷在220 nm波長下吸收較好，因此選擇上述波長測定相關成分。

綜上所述，本文建立的方法適用于平臟調神顆粒中鹽酸小檗堿、淫羊藿苷、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芍藥苷、芒果苷、丹酚酸B和葛根素含量的同時測定。

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（收稿日期：2017-06-08 修回日期：2017-08-10）

（編輯：劉 柳）