許向陽，陳小玉，趙婷婷，楊歡歡，張 賀，李景富

（東北農(nóng)業(yè)大學園藝園林學院，哈爾濱 150030）

番茄是重要的蔬菜作物之一，產(chǎn)量高且營養(yǎng)豐富。干旱導致植物光合電子還原鏈過度還原，其線粒體及葉綠體內(nèi)產(chǎn)生過量活性氧，損壞植物細胞膜系統(tǒng)[1]，影響番茄正常生長發(fā)育，產(chǎn)量和品質(zhì)下降。番茄品種對干旱表現(xiàn)敏感，特別是發(fā)芽、幼苗階段。采取一定措施減輕干旱對幼苗傷害，提高幼苗抗旱性，對番茄栽培、生產(chǎn)具有重要意義。

近年來，選用類似脫落酸（ABA）等外源化學物質(zhì)處理植物以提高其抗逆性（干旱、低溫、高鹽）研究取得重大進展[2]。ABA廣泛分布于高等植物體內(nèi)，不僅調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育且的干旱等非生物逆境也有一定調(diào)節(jié)作用。當植物遭受逆境脅迫時，ABA在植物體內(nèi)含量不斷累積[3]，可緩解干旱等逆境對植物傷害，定向增強作物的環(huán)境適應能力，提高作物抗逆性[4]，ABA也被稱為植物“脅迫激素”。近年，ABA抗旱作用備受關(guān)注。植物在缺水環(huán)境下，葉片ABA含量增加，促使保衛(wèi)細胞K+外滲，促進孔隙封閉，減少蒸騰和水分流失，使葉片細胞保持一定水分條件，提高植物干旱耐受性[5]。在甘蔗[6]、棉花[7]、大豆[8]、小麥[9]、玉米[10-11]等主要農(nóng)作物研究中發(fā)現(xiàn)，ABA可不同程度減輕干旱對作物的影響。李長寧等和姚滿生等發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下ABA處理可降低甘蔗幼苗和棉花幼苗細胞膜上結(jié)構(gòu)骨架磷脂分子氧化，增強抗氧化酶活性，減少過氧化物產(chǎn)生，一定程度上保護細胞膜，提高甘蔗及棉花幼苗抗旱性[6-7]。

目前，關(guān)于ABA減緩番茄幼苗干旱脅迫，提高抗旱性研究尚無報道。ABA亦稱S-抗誘素，是啟動植物體內(nèi)抗逆基因表達的信號分子，可誘導某些抗逆基因表達[12-13]。本研究對4葉期番茄幼苗作適量ABA噴施和干旱處理，分析其生理生化指標變化，通過cDNA-AFLP技術(shù)篩選ABA誘導后干旱脅迫下番茄幼苗差異表達基因表達模式上調(diào)的抗旱相關(guān)候選基因片段，利用實時熒光定量PCR技術(shù)驗證基因表達量模式，為外源噴施ABA提高番茄幼苗抗旱性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與處理

試驗材料為番茄栽培品種Moneymaker，試驗于2017年8～11月在東北農(nóng)業(yè)大學園藝站連棟溫室內(nèi)完成。采用苗盤育苗，兩葉時分苗于10 cm×10 cm營養(yǎng)缽中，常規(guī)培養(yǎng)。苗長至四葉一心時，每天早上8點噴施處理葉片。設(shè)置4組處理，處理1：清水+干旱處理（CK）；處理2：清水（CK1）；處理3：300μL·L-1ABA處理（CK2）；處理4：300μL·L-1ABA+干旱處理（A），20株為1個處理組。連續(xù)4 d對葉片藥物噴施處理，噴施時以葉片表面附著1層液珠為準，處理期間以見干見濕為原則對幼苗澆水，第4天噴施后營養(yǎng)缽澆透水，進入干旱處理不再澆水，記當天為0 d。

于1、3、5、7 d分別對CK和A處理葉片取樣，測定生理指標；同時分別在0、12、24、36、48、72 h時對CK、CK1、CK2、A所有處理組取適量葉片，液氮速凍存放在-80℃冰箱中，提取RNA用于cDNA-AFLP分析及實時熒光定量PCR驗證。作3次生物學重復。

1.2 測定項目及方法

參照李合生常規(guī)飽和、烘干稱量方法測定葉片相對含水量，抽氣法測定葉片相對電導率[14]。以氮藍四唑光化還原法測定超氧化物歧化酶（SOD），過氧化氫酶還原法測定過氧化氫酶（CAT），愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（POD）活性，硫代巴比脫酸法測定丙二醛（MDA）含量[14]，結(jié)合高俊鳳[15]方法稍加改動。

Trizol法從葉片中快速提取總RNA。由Ndrop 2000微量分光光度計測定260 nm吸收值計量總RNA濃度，以260 nm/230 nm及260 nm/280 nm吸收值比值衡量其純度。采用1%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙啶染色分析RNA完整性。選用TaKaRa（大連生物工程公司）cDNA Synthesis kit（Clontech）雙鏈試劑盒合成雙鏈cDNA。按試劑說明書步驟操作，采用紫外分光光度法測定雙鏈cDNA濃度。

選取Eco RⅠ和MseⅠ兩種內(nèi)切酶酶切雙鏈cDNA，待產(chǎn)物與接頭（見表1）連接后用于預擴增。以BLAST對提交到NCBI數(shù)據(jù)庫中差異目的基因片段序列比對基因相似性，推測與之相關(guān)功能。采用熒光染料嵌合法，對內(nèi)參基因（番茄actin基因）和目的基因片段作實時熒光定量PCR（iQ5 Real Time PCRDetection System），目的基因相對表達量分析采用 2-ΔΔCt法。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運用Microsoft Excel 2013和SPSS 17.0軟件分析數(shù)據(jù)差異顯著性。

表1 cDNA-AFLP接頭和引物序列信息Table 1 cDNA-AFLPadapter and primer sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下外源ABA對番茄幼苗葉片相對電導率和相對含水量的影響

圖1 干旱脅迫下ABA對番茄幼苗葉片相對電導率與相對含水量的影響Fig.1 Influence of ABA on relativeelectrical conductivity and relativewater content of tomato seedling leaves under drought stress

如圖1可知，干旱第1天，CK相對電導率明顯高于A處理，后期A處理和CK均呈上升趨勢，但A處理相對電導率始終小于CK，且差異顯著。相反，干旱初期，CK相對含水量稍高于A處理，經(jīng)干旱處理后，CK葉片含水量直線下降，第5天后，下降趨勢更加顯著，A處理前3 d雖略有下降但趨勢平緩，3 d后才明顯下降，但相對含水量始終高于CK，差異顯著。

2.2 干旱脅迫下外源ABA對番茄幼苗抗氧化酶活性和丙二醛含量的影響

由圖2可知，干旱第1天，CK和A處理SOD、CAT、POD活性值差異較小，隨干旱時間延長，3種抗氧化酶活性值均呈明顯上升趨勢，但SOD活性值第3天達峰值后下降，第5天又稍有上升，CAT活性值第5天達峰值后下降，而POD活性值始終呈上升趨勢。A處理抗氧化酶活性較CK上升更明顯，干旱后期活性值較初期差異顯著。相反，丙二醛含量CK始終高于A處理，干旱前3 d，CK和A處理丙二醛含量變化小，3 d后，CK丙二醛含量顯著上升，A處理稍有升高，CK與A處理差異顯著。

圖2 ABA對番茄幼苗干旱脅迫下抗氧化酶活性及丙二醛含量的影響Fig.2 Influence of ABA on antioxidant activitiesand MDA content of tomato seedlings under drought stress

2.3 干旱脅迫下外源ABA對番茄幼苗基因表達的影響

2.3.1 差異表達TDFs分離

利用64對引物組合對CK2和A3處理葉片cDNA選擇性擴增，共篩選得到112條差異表達TDF（見圖3）。根據(jù)條帶有無和擴增條帶強弱，TDF表達模式可歸為以下幾類：①干旱誘導或增強表達，這類TDF僅在干旱處理的兩組中特異表達或亮度增加；②ABA誘導型基因，部分TDF僅在ABA處理組中特異表達或亮度增加；③ABA抑制基因，此類TDF僅在非ABA處理組中表達；④干旱和ABA同時誘導或ABA加強誘導，TDF僅在ABA+干旱處理組中表達或亮度增加；⑤ABA+干旱抑制表達，少數(shù)TDF僅ABA+干旱下不表達；⑥干旱或ABA抑制表達，僅在無任何處理CK1中表達；⑦干旱抑制表達，在非干旱處理下表達。本試驗中，干旱下ABA加強基因表達均屬于本研究需獲得基因類型。

圖3 部分cDNA-AFLP特異性引物篩選結(jié)果Fig.3 Result of somescreen special cDNA-AFLPprimers

2.3.2 序列比對和功能分析

為了解干旱脅迫下外源ABA對番茄幼苗分子調(diào)控機理，在已有112條差異表達基因片段中挑選87條，二次PCR擴增、回收、克隆并測序，最終得到51個有效序列。

對51個有效序列作BLAST比對，序列結(jié)果表明22個有效序列與已知功能基因具有高度同源性，18個與未知功能基因及假定基因具有高度同源性，重復序列11個。22個同源基因生物學功能主要包括信號轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、逆境響應、細胞代謝與代謝途徑相關(guān)酶基因。如片段TDF33與番茄轉(zhuǎn)錄因子CBF1同源性值為94%，差異片段TDF71又與ABC轉(zhuǎn)運蛋白相似，其比對E值為0.083，參與響應逆境脅迫（見表2）。

表2 部分差異表達片段序列同源性比對結(jié)果Table 2 Homology comparison results of partial differentially expressed fragment(TDF)sequences

2.3.3 四個抗旱相關(guān)基因差異表達模式熒光定量PCR分析

為驗證cDNA-AFLP結(jié)果準確性并進一步探究番茄抗旱差異表達基因片段在不同干旱時間點表達情況，選取4個干旱脅迫下受ABA誘導上調(diào)表達的基因片段（TDF23、TDF56、TDF62、TDF72）作熒光定量PCR分析。

圖4 干旱脅迫下ABA預處理番茄幼苗及對照抗旱相關(guān)基因相對表達Fig.4 Relative expression of drought-resistant genes in tomato seedlings pretreated with ABA and control under drought stress

由圖4可知，4種不同抗旱相關(guān)基因隨干旱時間增加，基因表達量均較初期明顯增加，基本呈先升后降趨勢。但表達量上升到最大值時間點不同，TDF23在24 h，而TDF56、TDF62、TDF72在36 h。其次，四個不同基因相同時間點基因表達量為A處理高于CK，僅有TDF23和TDF72在12 h時CK表達量稍高于A處理。

3 討論

植物經(jīng)干旱處理后，植株抗旱性越強，葉片抗脫水能力越強，葉片RWC含量越高[16]。干旱脅迫時，RWC含量降低，破壞自由基平衡代謝，產(chǎn)生大量自由基，自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應，得到具有毒性的氧化終產(chǎn)物MDA，加劇膜系統(tǒng)損傷[17]；質(zhì)膜滲透性增加，電解質(zhì)外滲，電導率增強。本研究發(fā)現(xiàn)，隨干旱脅迫時間延長，葉片RWC含量顯著降低，而MDA含量明顯增加，相對電導率顯著上升，與陳青奇等研究結(jié)果一致[18-19]。此外，番茄幼苗葉片在噴施ABA預處理后，相對電導率始終低于對照，與尹松松等研究結(jié)果一致[20]，相對水含量下降趨勢也較對照相對平緩。一定程度上說明外源ABA預處理可減輕膜系統(tǒng)在干旱脅迫下的損傷。

SOD是生物體內(nèi)關(guān)鍵的抗氧化酶，亦稱自由基清除劑，其活性可作為判斷植物抗逆性指標，可催化有毒超氧自由基反應生成無毒O2和H2O2，存在于植物體葉綠體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中CAT和過氧化物酶體中POD可進一步清除有毒害作用H2O2，生成無害O2，減少自由基對膜的傷害。因此，SOD、CAT、POD活性可衡量植物抗旱能力[21]。本試驗中，ABA預處理后，不同程度增加抗氧化酶活性，與郭貴華等[22]和趙宏偉等[19]研究一致，但郭貴華等研究中，3種酶在干旱及ABA處理后始終呈上升趨勢。本試驗中，后期SOD和CAT酶活性有所下降，可能是不同作物不同生長期導致的差異。

植物抗逆性均是多基因控制的復雜數(shù)量性狀[23]，許多基因在逆境環(huán)境下不同程度表達，其產(chǎn)物蛋白或RNA作用于植物細胞，響應干旱等非生物逆境以提高其抗逆性[24]。本研究中，干旱脅迫下部分TDF差異性表達，說明干旱脅迫不同程度影響基因表達，差異表達片段調(diào)控植物抗旱性。為明確植物抗旱性分子調(diào)控機制，學者鑒定和分析大量干旱脅迫誘導基因，在模式植物如水稻和擬南芥上研究更深入，已鑒定數(shù)百個抗旱相關(guān)誘導基因[25]。本研究中有22個cDNAs對應的TDF與已鑒定的干旱脅迫相關(guān)功能基因具有高度同源性，某種程度上表明不同植物對干旱脅迫耐受性具有相似分子基礎(chǔ)。

ABA是啟動植物體內(nèi)抗逆基因表達“第一信使”，可誘導某些抗逆基因表達，調(diào)控抗逆代謝反應。在干旱、低溫、高鹽等逆境中有重要作用且受ABA誘導的基因已被相繼克隆，如番茄SINAC41、玉米MAPK等[26-27]。本試驗中，四種抗旱相關(guān)TDF在干旱脅迫期間，基因表達量均高于初期，說明其對干旱脅迫產(chǎn)生應答反應。盡管4種片段基因表達量均先升后降，但初始CK和A處理中TDF23、TDF56和TDF72表達水平相似，后期差異性較為明顯，可能因TDF在后期受ABA誘導更為明顯。TDF62的CK和A處理基因表達量趨勢相同，但表達量A處理始終高于CK，可能是TDF62片段基因較其他3個TDF受干旱影響更強烈，而ABA對其表達起促進作用。因此推測ABA預處理番茄幼苗對干旱高抗性與抗旱相關(guān)基因較高表達緊密相關(guān)。為更全面揭示ABA誘導基因表達與逆境脅迫之間聯(lián)系，其機理尚需深入研究。

4 結(jié) 論

ABA預處理可有效緩解干旱脅迫對番茄幼苗生理生化及代謝功能損傷，一定程度減輕干旱對幼苗影響。結(jié)合cDNA-AFLP及實時熒光定量驗證經(jīng)ABA預處理的番茄幼苗可促進抗旱基因相關(guān)表達并提高其抗旱性。