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        黃芪糖蛋白對博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的治療作用及機制

        2018-10-19 09:04:04欒智華任晉宏薛慧清魏硯明陳薛靜劉新潔
        世界中醫(yī)藥 2018年9期
        關(guān)鍵詞:肺纖維化小鼠模型

        欒智華 任晉宏 薛慧清 柴 智 魏硯明 陳薛靜 陳 晨 劉新潔

        (山西中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心,晉中,030619)

        特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis,IPF)是呼吸系統(tǒng)最嚴重的疾病之一,廣泛累及肺間質(zhì)、肺泡和(或)細支氣管,由于各種刺激因子介導(dǎo)肺內(nèi)炎性反應(yīng)細胞滲出,出現(xiàn)大量成纖維細胞增殖和細胞外基質(zhì)過量沉積,病程一般呈進行性發(fā)展,最終導(dǎo)致呼吸功能衰竭而死亡[1]。隨著污染、環(huán)境惡化等因素,肺纖維化己成為當(dāng)今嚴峻的健康問題。因西醫(yī)治療手段有限,從中藥及天然植物中提取不良反應(yīng)低的有效單體成分已成為纖維化疾病治療的新途徑。

        黃芪糖蛋白(Huang Qi Glycoprotein,HQGP)從傳統(tǒng)中藥膜莢黃芪中提取純化,體外實驗表明其具有一定的免疫抑制作用[2]。HQGP除了具有已知的免疫抑制作用,可能還有直接的抗纖維化的作用,但目前其用于肺纖維化的治療及作用機制尚未見報道。本研究采用博萊霉素誘導(dǎo)小鼠建立肺纖維化模型,觀察HQGP是否對肺纖維化有干預(yù)作用,并初步探討其作用機制,為拓展其臨床應(yīng)用范圍提供實驗依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 動物 SPF級雌性ICR小鼠,體重16~18 g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,實驗動物使用許可證號:SCXK(京)2016-0011。

        1.1.2 藥物 黃芪糖蛋白(HQGP),由山西中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心薛慧清教授惠贈。注射用鹽酸博萊霉素,浙江海正輝瑞制藥有限公司生產(chǎn),批號16033811。

        1.1.3 試劑與儀器 轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1(小鼠)ELISA試劑盒,上海研吉生物科技有限公司;羥脯氨酸(Hyp),丙二醛(MDA),超氧化物歧化酶(SOD),考馬斯亮藍蛋白試劑盒,無毒環(huán)保蘇木精染液,均購自南京建成生物工程研究所;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

        721型分光光度計(上海第三分析儀器廠);YD-1508RⅢ型石蠟切片機(金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司);5415D型低溫高速多功能離心機(德國Eppendorf公司);DHG-9243BS-Ⅲ型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司);BX51T-32F01型全自動顯微攝像系統(tǒng)(日本Olympus公司);Varioskan型全波長多功能酶標儀(美國Thermo公司)。

        1.2 方法

        1.2.1 分組及模型制備 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,將小鼠分為對照組、模型組及HQGP觀察組。模型組小鼠參照欒智華等[3]的方法,鼻腔滴注博萊霉素造模。

        1.2.2 給藥方法 建模后第2天起,對照組、模型組腹腔注射0.9%生理鹽水,每只小鼠0.2 mL;觀察組腹腔注射HQGP,劑量按照1 mg/kg,用0.9%生理鹽水稀釋,每只0.2 mL,連續(xù)注射14 d。

        1.2.3 檢測指標

        11月27日,云南省政府新聞辦舉行“壯闊東方潮 奮進新時代”云南省慶祝改革開放40周年系列新聞發(fā)布會經(jīng)濟發(fā)展主題新聞發(fā)布會,介紹了改革開放40年以來,特別是黨的十八大以來,云南經(jīng)濟體制改革和經(jīng)濟發(fā)展方面的成就,一系列重大改革舉措推動云南經(jīng)濟持續(xù)快速發(fā)展。

        1.2.3.1 一般狀況觀察 每天觀察動物活動、精神狀態(tài)、攝食等狀況。分別于給藥后第7、14、21、28天,測定每組小鼠的體重變化。分別于給藥后第7、28天,每次每組取5只小鼠,眼球采血處死。取肺臟,用濾紙吸干血跡,稱取并記錄肺質(zhì)量,根據(jù)公式計算肺系數(shù):肺系數(shù)=肺質(zhì)量(mg)/體重(g)。

        1.2.3.2 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察肺組織形態(tài)變化 分別于給藥后第7、28天取材,每次每組處死5只小鼠。取左肺4%多聚甲醛固定,按常規(guī)病理學(xué)方法包埋,病理切片進行HE染色,光鏡下觀察肺泡炎、肺纖維化程度。

        1.2.3.3 分光光度法檢測肺組織中Hyp、SOD、MDA表達 取右肺用冰鹽水沖洗,濾紙吸干水分,冷凍保存?zhèn)錂z,肺組織中Hyp、SOD、MDA水平檢測均按照試劑盒說明書操作。

        1.2.3.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測肺組織中TGF-β1表達 取右肺冷凍保存?zhèn)錂z,肺組織中TGF-β1檢測按照試劑盒說明書操作。

        2 結(jié)果

        2.1 動物一般情況比較 觀察期間對照組小鼠活潑好動,皮毛光亮,攝食正常,體重逐漸增加。模型組小鼠精神萎靡,呼吸急促,反應(yīng)靈敏度變差,毛發(fā)干燥晦暗,嚴重者脫毛,進食下降,體重逐漸減輕。觀察組小鼠精神狀態(tài)略好于模型組。

        每組小鼠在造模后第7、28天肺系數(shù)的變化情況,與對照組比較,模型組小鼠的肺系數(shù)明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,觀察組小鼠的肺系數(shù)明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖1。

        表1 HQGP對肺纖維化小鼠體重的影響

        注:與對照組比較,*P<0.05

        圖1 HQGP對肺纖維化小鼠體重及肺系數(shù)的影響

        注:與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05

        2.3 HQGP對肺纖維化小鼠肺組織Hyp的影響 模型組小鼠肺組織中Hyp水平第7、28天明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,HQGP觀察組第7、28天有明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

        2.4 HQGP對肺纖維化小鼠肺組織TGF-β1水平的影響 與對照組比較,模型組小鼠肺組織中TGF-β1表達第7、28天顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,觀察組第7、28天明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

        2.5 HQGP對肺纖維化小鼠肺組織SOD,MDA水平的影響 模型組小鼠肺組織中MDA表達第7、28天顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,觀察組第28天MDA表達明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5.a。

        模型組肺組織中SOD表達水平第7、28天顯著低于對照組(P<0.05)。與模型組比較,觀察組第28天SOD表達明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5.b。

        圖2 HQGP對肺纖維化小鼠肺組織病理學(xué)的影響(HE,×200)

        注:A.對照組第7天;B.模型組第7天;C.觀察組第7天;D.對照組第28天;E.模型組第28天;F.觀察組第28天

        圖3 HQGP對肺纖維化小鼠肺組織Hyp水平的影響

        注:與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05

        3 討論

        肺纖維化是以彌漫性肺泡炎和肺泡結(jié)構(gòu)紊亂,最終形成肺間質(zhì)纖維化為特征病變的慢性進展性疾病。目前臨床上用于治療肺纖維化的藥物主要是糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑,但其嚴重不良反應(yīng)影響了廣泛使用,調(diào)查顯示,肺纖維化的發(fā)病率和死亡率正在逐年攀升[4],但早期診斷和有效的治療手段仍較缺乏,因此尋找合適的中藥治療肺纖維化已成為目前的研究熱點。

        圖4 HQGP對肺纖維化小鼠肺組織TGF-β1水平的影響

        注:與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05

        圖5 HQGP對肺纖維化小鼠肺組織SOD、MDA的影響

        注:與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05

        糖蛋白是一類由糖類同多肽或蛋白質(zhì)以共價鍵連接而形成的結(jié)合蛋白,廣泛存在于動物、植物和某些微生物中,且存在形式各不相同。山西中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心從中藥黃芪中提取到一種具有免疫抑制活性的物質(zhì)-黃芪糖蛋白(HQGP),并已申請專利。近年來,關(guān)于黃芪糖蛋白的研究越來越多,楊向竹等[5]發(fā)現(xiàn)黃芪糖蛋白的抑制作用主要表現(xiàn)為對T細胞增殖的抑制,而對B細胞增殖的抑制只有在高劑量時有作用;在佐劑性關(guān)節(jié)炎(Adjuvan Arthritis,AA)大鼠模型治療實驗中,HQGP對模型鼠的關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)有顯著的改善作用[6]。趙俊云等[7]采用TUNEL法觀察到HQGP可有效誘導(dǎo)AA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織的細胞凋亡。章培軍等[8]利用HQGP治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis,EAE),推測其治療EAE的可能機制是抑制了炎性反應(yīng)。章培軍等[9]還發(fā)現(xiàn)HQGP通過調(diào)節(jié)T細胞亞群比例,抑制炎性反應(yīng)介質(zhì)釋放,從而減輕EAE炎性反應(yīng)。張娜等[10]研究表明HQGP對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(Collagen-induced Arthritis,CIA)小鼠的治療作用,可能是與降低特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA-3表達,調(diào)整Th1/Th2功能失衡有關(guān)。但目前還沒有關(guān)于黃芪糖蛋白與小鼠肺纖維化的關(guān)系研究,本研究結(jié)果表明HQGP對小鼠的肺纖維化具有一定的治療作用。

        本研究HE染色結(jié)果表明,HQGP可明顯減輕肺纖維化小鼠肺泡結(jié)構(gòu)受損及肺泡間隔增厚的程度,減少炎性反應(yīng)細胞浸潤,表明HQGP對小鼠PF的發(fā)生發(fā)展具有抑制作用。肺系數(shù)作為反映PF程度的指標之一,在PF的發(fā)病過程中,由于炎性反應(yīng)細胞浸潤、血管充血淤血等因素造成肺重增加,導(dǎo)致肺系數(shù)升高。本研究結(jié)果顯示,HQGP可顯著降低模型小鼠的肺系數(shù),進一步證明HQGP可改善小鼠PF的發(fā)病程度。

        Hyp作為膠原纖維蛋白中主要的組成成分,可準確地間接反映膠原纖維蛋白的水平。研究表明TGF-β1是細胞外基質(zhì)沉積最強的促進劑,還能抑制膠原的降解,在肺纖維化發(fā)病機制中的作用顯著[11]。本實驗結(jié)果表明,HQGP能顯著降低肺纖維化小鼠肺組織中Hyp、TGF-β1的表達,提示HQGP可減輕膠原在肺間質(zhì)得沉積,從而起到減輕PF的作用。

        肺纖維化是一個復(fù)雜的病理生理過程,盡管發(fā)病機制尚未完全闡明,但氧化應(yīng)激在其發(fā)生發(fā)展中起重要作用[12]。SOD是體內(nèi)重要的清除氧自由基的酶,肺組織中SOD的水平可以間接反映機體肺清除氧自由基的能力[13]。MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物,可以反映機體過氧化的程度,也可以破壞細胞膜結(jié)構(gòu),進而導(dǎo)致細胞腫脹壞死[14]。本研究發(fā)現(xiàn),HQGP可降低肺纖維化小鼠肺組織內(nèi)MDA水平,上調(diào)SOD的水平,表明HQGP可能通過調(diào)節(jié)氧化/抗氧化失衡、降低氧化應(yīng)激損傷達到減輕PF的目的。

        綜上所述,HQGP可能通過降低HYP、TGF-β1的表達,升高肺組織SOD和降低MDA表達,提高機體抗氧化能力,減輕肺組織炎性反應(yīng)損傷和改善纖維化程度,抑制ECM的沉積,保持肺組織結(jié)構(gòu)的完整,從而起到防治PF的作用,這些作用機制的揭示為指導(dǎo)HQGP的開發(fā)及臨床用藥提供了可靠的藥理學(xué)依據(jù)。

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